L'utilisation de l'oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l'hôte une réaction immunitaire chez la souris

Résumé

La réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par des pathogènes est un processus étroitement régulé. Utilisant un poumon modèle d'exposition de lipopolysaccharide chez la souris, il est possible de procéder à des évaluations de haute résolution des mécanismes complexes associés à la pathogenèse de la maladie.

Résumé

La réponse immunitaire de l'hôte à des agents pathogènes est un processus biologique complexe. La majorité des études in vivo utilisé classiquement pour caractériser les interactions hôte-pathogène profiter des injections intra-péritonéales de sélectionner des bactéries ou des motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP) chez la souris. Bien que ces techniques ont donné des données énormes liés à pathobiology des maladies infectieuses, les modèles d'injection intrapéritonéale sont pas toujours appropriés pour les études d'interaction hôte-pathogène dans les poumons. Utilisant un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë chez la souris, il est possible de procéder à une analyse à haute résolution de l'hôte réponse immunitaire innée utilisant le lipopolysaccharide (LPS). Ici, nous décrivons les méthodes d'administration de LPS en utilisant non chirurgicale administration intratrachéale oropharyngée, de surveiller les paramètres cliniques associés à la pathogenèse de la maladie, et d'utiliser le liquide de lavage broncho-alvéolaire pour évaluer la réponse immunitaire de l'hôte. Les techniques qui sont décritessont largement applicable pour l'étude de la réponse immunitaire innée hôte à un large éventail de PAMP et les agents pathogènes. De même, avec des modifications mineures, ces techniques peuvent également être appliquées dans des études évaluant l'inflammation allergique des voies aériennes et dans des applications pharmacologiques.

Introduction

Les infections pulmonaires associés aux espèces de bactéries pathogènes sont une cause fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Déterminer les mécanismes qui conduisent la réponse immunitaire de l'hôte à ces agents pathogènes favorisera le développement de nouvelles stratégies de prévention et des agents thérapeutiques qui atténuent l'impact de ces infections. L'objectif global du protocole décrit ici est de fournir à l'utilisateur une méthode flexible pour évaluer l'hôte réponse immunitaire innée à l'infection par des agents pathogènes en utilisant un modèle de l'agent pathogène associé moléculaire (PAMP) comme un substitut pour les bactéries vivantes. La majorité des études antérieures évaluant l'hôte réponse immunitaire innée aux bactéries ont mis l'accent sur les modèles péritonéale en raison de la relative facilité d'exécution. Bien que ces modèles sont très utiles et ont donné lieu à des avancées significatives dans le domaine des interactions hôte-pathogène et l'inflammation systémique, les données générées à partir de ces modèles ne sont pas toujours appropriés pour les études involving le système respiratoire. Ici, un modèle d'inflammation pulmonaire aiguë du poumon est proposé comme une extension pratique et cliniquement pertinente de l'intra-péritonéale (ip), les modèles d'injection classiques. La technique proposée permet l'évaluation locale de la réponse immunitaire innée dans un système de modèle spécifique d'organe.

Les méthodes décrites ici sont conçues pour fournir une technique simple et robuste pour permettre aux utilisateurs d'évaluer la réponse immunitaire de l'hôte au LPS, qui est un PAMP commun. Les méthodes sont basées sur intratrachéale (it) instillation de LPS, ce qui induit une réponse immunitaire innée robuste dans les poumons de souris et imite de nombreuses caractéristiques physiopathologiques observés chez des patients humains souffrant d'infections respiratoires et de lésions pulmonaires aiguës ^1. Un avantage principal de cette technique est qu'elle permet à l'utilisateur d'évaluer la réponse immunitaire de l'hôte sans les facteurs de confusion et des problèmes de sécurité liés à la réalisation des études in vivoà l'aide de bactéries vivantes. De même, l'administration de ce parcours oropharyngée de l'exposition décrite dans ce protocole présente des avantages significatifs par rapport aux autres techniques couramment utilisées, y compris par voie intranasale (dans) l'administration et la gestion de ce chirurgical. Par exemple, l'administration du dosage, il permet oropharyngée relativement précise et dépôt dans les poumons, comparativement à l'administration, qui souffre généralement d'une augmentation de la variabilité de dépôt dans les poumons à cause de la perte d'agents dans la cavité nasale, des sinus ^{de 2-4.} La voie d'administration de ces cavités, il contourne et permet un accès direct à la trachée et les voies respiratoires. De même, l'approche chirurgicale est une méthode d'administration beaucoup plus morbide et nécessite une formation approfondie à maîtriser. Les protocoles décrits ici comprennent également une description des techniques courantes et des marqueurs de substitution utilisés pour évaluer la progression de l'inflammation et se terminer par un protocole décrivant les techniques appropriées pour la préparation de la luNGS pour l'évaluation de l'histopathologie. Ces protocoles sont concentrés sur la réduction du nombre de souris requis pour chaque étude en maximisant les données générées à partir de chaque animal individuel.

Les protocoles décrits sont très flexibles et peuvent être facilement modifiés pour évaluer une diversité PAMP de gamme et des modèles moléculaires de dommages associé (atténue). En outre, moyennant quelques modifications supplémentaires, ces protocoles peuvent également être appliqués à des études évaluant allergique des voies aériennes progression de la maladie ou des interactions hôte-pathogène avec des bactéries vivantes, des virus ou des champignons ^5-10.

Protocole

Toutes les études ont été menées sous l'approbation du Comité des soins et institutionnel (IACUC) pour Virginia Tech et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Une. Intratrachéale (it) inoculation de LPS aide de l'Administration de l'oropharynx

1. Assurez-vous que chaque animal est identifié en utilisant soit un coup de poing de l'oreille, une étiquette d'oreille, ou toute autre méthode approuvée institutionnellement.
2. Noter le poids corporel de base et la température du corps de chaque animal.
3. Préparer le stock de travail de LPS. Chaque souris reçoit une dose de 50 pi de 1 mg / kg de LPS dans 1 x tampon phosphate salin (PBS). Animaux traités Mock recevront une dose de 50 pi de PBS 1x.
4. Préparer une chambre chargée de l'administration de l'isoflurane en utilisant la méthode de la goutte suivante. Les directives institutionnelles varient en ce qui concerne l'utilisation de l'isoflurane et d'autres agents anesthésiques et avant Initiattion des études, les personnes doivent communiquer avec le Service de protection des animaux / Bien-être de leur institution pour assurer les toutes les directives sont satisfaits. Si la méthode de chute isoflurane n'est pas une option, d'autres agents anesthésiques sont des alternatives acceptables.
   1. Dans une armoire de sécurité approprié, appliquer environ 3 ml d'isoflurane à une serviette de papier absorbant plié et le placer dans le fond d'un bécher de 500 ml.
   2. Placer un petit morceau de papier d'aluminium sur le dessus de la serviette en papier et couvrir le bol avec un couvercle transparent.
5. Préparer les outils et les réactifs qui seront utilisés au cours de l'inoculation il. Placez la bande de caoutchouc afin de garantir les animaux se dirigent sur le stand de l'intubation. Cette procédure nécessite une paire de pinces droites, une paire de pinces inclinées ou courbes, et une pipette P200 avec des conseils.
6. Charge 50 pi de LPS dans la pointe de la pipette et le placer dans un endroit facilement accessible à côté du stand de l'intubation.
7. Anesthésier la sourisen plaçant l'animal dans la chambre de l'isoflurane et recouvrant la chambre avec le couvercle transparent. Respecter les modes de respiration de l'animal, qui sera rapide et superficielle lors de la première placée dans la chambre. L'animal sera suffisamment anesthésiée quand les taux de respiration s'approchent 1 souffle / 2 sec, qui est généralement atteint en 30 secondes à placer dans la chambre. La souris doit être anesthésié comme indiqué dans le protocole approuvé pour les animaux en utilisant la méthode de chute de l'isoflurane.
8. Retirez la souris anesthésiée de la chambre et de suspendre l'animal sur l'intubation tenir ses incisives. S'assurer que l'animal est bien retenu et la bouche et la langue sont accessibles.
9. Garantir doucement la langue avec la pince droite. Saisir la languette avec la pince à angles et tirez-le doucement hors de la bouche jusqu'à ce qu'une légère résistance se fait sentir. Cette action est suffisante pour bloquer l'épiglotte et avoir accès à la trachée.
10. Tout en continuant à tenir la langue dans laposition étendue, administrer la dose de 50 ul de LPS dans le fond de la gorge et couvrir immédiatement les narines de l'animal avec un doigt ganté. Le LPS sera visible à l'arrière de la gorge jusqu'à ce que la souris inhale.
11. Continuez à couvrir les narines et maintenez la langue étendu pendant 5-10 respirations supplémentaires.
12. Débranchez la souris de la position de l'intubation et placez le dos de l'animal dans une nouvelle cage jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie.
13. Surveillance de marqueurs de substitution associées à la progression de la maladie. Le poids corporel et la température du corps doivent être surveillés tous les 4-8 heures pour la durée de l'étude. De même, évaluer les caractéristiques de comportement et de symptômes cliniques associés à une morbidité accrue.
14. Pour évaluer la progression de la maladie, les souris de récolte aux points de contrôle spécifiques suite à l'exposition au LPS. Points de temps typiques de récolte après une exposition LPS comprennent 0, 6, 12, 18, 24, et 48 h. Pour évaluer le rétablissement et la survie, évaluer la souris pour 7 days après l'inoculation.

2. Sérum et lavage broncho-alvéolaire fluide (LBA) Collection

1. Sacrifier la souris en utilisant une méthode approuvée institutionnellement.
2. Placez l'animal sur son dos et le fixer à un bord de l'autopsie, idéalement 0,5 à (1,27 cm) de hauteur.
3. Mouillez l'ensemble souris avec 70% d'éthanol.
4. En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 27 G, procéder à une ponction cardiaque avant de faire des incisions. Il devrait être possible de retirer 500 à 800 pi de sang total à partir d'une seule souris.
5. Retirez l'aiguille de la seringue et transférer le sang total à un tube de 1,5 ml microtubes préalablement marqué. Pour la collecte de sérum, le sang total permet de coaguler pendant au moins 30 min à température ambiante. En plus de la collecte de sérum, ce procédé peut également être modifié par incorporation d'un anti-coagulant dans le tube et d'une seringue, avant de recueillir le sang entier, pour étudier les cellules immunitaires circulantes.
6. Faire une incision horizontale untraverser la longueur de la cavité péritonéale, et une incision verticale de la cavité peritoneale à la mâchoire inférieure de la souris.
7. En utilisant une pince, saisir des deux côtés de l'incision et tirez doucement la peau à l'écart des cavités péritonéale et thoraciques sous-jacents.
8. Faire une incision le long de la grande longueur de la cavité péritonéale des organes génitaux du sternum, en prenant soin d'éviter de couper le diaphragme. Déplacer doucement l'intestin dans la cavité péritonéale pour permettre l'accès à l'un des reins.
9. Couper la veine rénale conduisant à la rein à servir de point de perfusion de drainage.
10. Nick le diaphragme à l'aide de ciseaux, en prenant soin d'éviter les poumons et le cœur, pour exposer le côté gauche du cœur.
11. Perfuse manuellement le coeur à l'aide d'une seringue de 10 ml avec une aiguille de 27 G et une solution 1 x PBS. Éviter d'appliquer une force excessive lors de la perfusion afin de s'assurer que la solution saline n'est pas forcé dans les poumons. Le sang restant devrait s'écouler de l'incision de la veine porte.
12. Découpez soigneusement la cage thoracique le long du sternum avec des ciseaux émoussés / émoussés, en prenant soin d'éviter de couper le cœur et les poumons. Couper accidentellement les poumons au cours de cette procédure permettra de réduire considérablement la quantité de BALF recueillies et se traduira par une incapacité à gonfler correctement les poumons avec fixateur.
13. Isoler doucement le cœur et les poumons à l'extérieur de la cage thoracique à l'aide de pinces. Découpez soigneusement chaque section de la cage thoracique à l'aide contondants / émoussé ciseaux à proximité de la colonne vertébrale que possible et complètement enlever les deux sections.
14. Séparez les glandes salivaires à l'aide de forceps ou de les supprimer en utilisant des ciseaux, pour exposer la trachée.
15. Découpez soigneusement les muscles qui recouvrent la trachée avec des ciseaux. Il est essentiel que la trachée pas être coupé pendant ce processus.
16. Avec des ciseaux, séparer la clavicule recouvrant la trachée.
17. Saisir doucement le thymus aide d'une pince et soulever le tissu du coeur. Retirez le thymus l'aide de ciseaux, tout en veillant àéviter de couper le cœur ou les poumons.
18. Faire une petite incision horizontale dans la trachée 1-2 anneaux au-dessous du larynx à l'aide des ciseaux inclinés (45-90 º d'angle de, pointus / pointus). L'incision doit être suffisamment grande pour fixer solidement la canule.
19. Insérer la canule, de sorte que l'extrémité effilée s'étend anneaux trachéaux 3.2 ci-dessous de l'incision et de fixer la canule en place à l'aide d'une suture de soie. Assurez-vous que le fil de suture passe entre la trachée et l'œsophage et il est tendu sur la canule.
20. Remplir une seringue de 1 ml avec 1 ml de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS) et introduire délicatement sa luer dans la canule.
21. En utilisant un mouvement lent, mais constant, injecter ~ 900 pi dans la trachée, ce qui gonfle les poumons, et de retirer immédiatement le HBSS. Placer le BALF récupéré dans un tube conique de 15 ml.
22. Répétez cette lavage 2 fois supplémentaires pour recueillir environ 3 ml de BALF pour une analyse future. Rangez le BALF sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à utilisation.

3. Histopathologie Préparation

1. Insérer une seringue de 10 ml dans la position de gonflage du poumon. Assembler les tubes à la luer, le luer sur le robinet et le robinet de la seringue. S'assurer que le robinet est en position fermée. La seringue de 10 ml servira de réservoir d'écoulement par gravité. Le réservoir doit être fixé à l'inflation 4,75 distingue en dessus de l'animal et de la partie supérieure du réservoir doit s'étendre au-dessus de 10,5 dans l'animal.
2. Remplir la seringue avec neutre solution de formol tamponné. S'assurer que la seringue est complètement remplie avec le fixateur.
3. Placer une serviette absorbante sous l'extrémité ouverte du tube et d'ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre le fixateur pour remplir le tube. Une fois le fixateur commence coule du tuyau, fermer immédiatement le robinet et remplir la seringue vers le haut avec un fixateur. Il est important que la seringue soit complètement rempli de fournir la quantité appropriée de la pression de gonflage du poumon.
4. Passer doucement un second morceau de fil de suture sous la trachée, environ 1-2 anneaux trachéaux dessous de l'extrémité de la canule.
5. Faire un nœud simple en vrac dans la suture; cependant, ne tirez pas sur le noeud serré.
6. Insérez le tube de l'inflation de la souris se dans la canule.
7. Ouvrir le robinet et laisser les poumons se remplissent par gravité inflation.
8. Une fois que les poumons atteignent leur niveau de gonflage maximale, tirez le fil de suture serré et attacher un deuxième noeud.
9. Fermer le robinet et retirez le tube de la canule.
10. Retirer délicatement la canule de la trachée en saisissant le fil de suture avec une paire de pinces et en maintenant la canule avec les doigts. Tirez fermement le fil de suture vers le bas vers la cavité thoracique et la canule de retour vers le nez de la souris.
11. Saisir doucement la trachée ou les sutures avec une pince et soulever la trachée loin de la cavité du cou.
12. Couper la caudale de la trachée à la suture attaché avec des ciseaux émoussés.
13. Une fois que le Trachea est libre dans les tissus sous-jacents, de commencer à tirer sur la trachée à une distance à partir de la souris. Soulevez doucement les poumons de la cavité thoracique.
14. Découpez soigneusement le tissu conjonctif tenant les poumons dans la cavité thoracique. Continuer à tirer la trachée à distance du corps de la souris et appliquer une force constante à la hausse tout en réduisant les connexions sous-jacentes. Prenez soin de ne pas couper les poumons. Notez que le coeur doit être laissé attaché aux poumons en utilisant cette méthode.
15. Une fois que les poumons ont été retirés, placez-les dans 10 ml de formol tamponné.
16. Supprimer une section de la queue de la souris pour le génotypage.
17. Disposer de la carcasse de la souris suivant les directives institutionnelles appropriées.

4. Évaluation de cytokines

1. Centrifuger le sang total, recueillis à l'étape 2.5, à 12 000 g pendant 5 min à isoler le sérum. Transférer le sérum dans un tube de 1,5 ml microtubes pré-marqués et conserver à -80 ° C.
2. Évaluer la serum niveaux de cytokines par ELISA ou un autre test similaire. Diluer le sérum 01 heures 05-à-01:20 dans un tampon de dilution approprié, en fonction du dosage, suivant les instructions du fabricant. Ces dilutions doivent être déterminés de façon empirique avant l'exécution de la masse des échantillons.
3. En raison du faible volume de sérum recueilli, de réduire le volume de l'échantillon chargé sur la plaque ELISA de moitié. Par exemple, la plupart des tests ELISA commerciaux utilisent des volumes de 100 pi de normes et des échantillons. Pour conserver les échantillons, charge 50 pi de normes et de sérum dilué par puits.
4. Centrifugeuse la BALF dans une centrifugeuse de table réfrigérée à 200 g pendant 5 min. Transférer le surnageant acellulaire en deux préalablement marqué de 1,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C.
5. Évaluer cytokines BALF par ELISA ou un autre test similaire sans diluer.
6. Magasin sérum utilisé et BALF à -80 ° C.

5. Différentiel coloration et BAL évaluation Cellularity

1. Suite à la centrifugation et BALF élimination complète du HBSS, lyser les globules rouges en culot à l'aide de la solution saline hypotonique. Remettre en suspension les cellules dans 900 ul d'eau distillée. Immédiatement ajouter 100 ul de PBS 10x.
2. Lyser individuellement chaque échantillon. Si les échantillons contiennent une quantité excessive de cellules rouges du sang, les cellules peuvent être rassemblées en un culot dans la centrifugeuse de paillasse à 400 xg pendant 5 min et le sang protocole de lyse des globules rouges peut être répété.
3. Déterminer la cellularité totale de BALF dans la suspension de 1 ml en utilisant un hématimètre à 10X ou 20 X grossissement avec coloration au bleu Trypan. Évaluer et présenter ces données comme cellules / ml.
4. Préparer le matériel pour la cytospin et coloration différentielle. Étiqueter les lames de microscope standard à l'aide d'un crayon ou stylo solvant résistant. Fixer les lames dans une tranche d'cytospin et entonnoir. Fixez l'ensemble de diapositives dans le rotor de cytospin.
5. Cytospin 150 ul de BALF à 100 xg pendant 5 min. Si la densité cellulaire est trop grand pour effectivementévaluer la morphologie des cellules, de réduire le volume filé vers le bas sur les diapositives. Laisser les lames à l'air sécher pendant la nuit.
6. Différentiel colorer les lames suivant les protocoles fabrique. Laisser les lames à l'air sécher pendant la nuit. Les lames couvre-objet en utilisant du Permount et évaluer les lames à l'aide d'un microscope équipé d'un objectif 20X et 40X.
7. Récolter les cellules restantes pour une analyse ultérieure, telles que FACS, microscopie électronique, microscopie confocale, l'extraction de l'ARN pour l'évaluation de l'expression des gènes, et / ou l'extraction des protéines de transfert de western.

6. évaluation histopathologique

1. Préparer les poumons pour l'évaluation histopathologique. Après 24-48 heures de la fixation au formol, orienter le ventre les poumons entiers gonflés et inclus en paraffine. Couper les blocs qui en résultent pour exposer le principal conducteur voies respiratoires.
2. Pour améliorer la précision de pointage, positionner les poumons dans la même position et couper chaque bloc pour obtenir la visualisation longitudinale maximale de til intrapulmonaires principal voies respiratoires axiale. De ce point, couper 5 microns de coupes en série et la tache avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E). Des sections supplémentaires peuvent être découpés et préparés pour l'hybridation in situ en utilisant des protocoles standards.
3. Évaluer l'histopathologie l'aide d'un système de notation semi-quantitative basée sur les paramètres inflammatoires suivantes, qui sont notés entre 0 (absent) et 3 (sévère): mononucléaires et polynucléaires infiltration de cellules; des voies respiratoires hyperplasie des cellules épithéliales et des blessures; extravasation; périvasculaire et menottes peribroncheolar; et le pour cent du poumon associé à une inflammation. Poumon histopathologie doit être évaluée par un pathologiste expérimenté.
4. Moyenne de l'ensemble des scores de paramètres pour générer un score total de l'histopathologie ou utiliser scores individuels de quantifier les aspects spécifiques de la progression de la maladie. Effectuer tous notation dans un mode à double insu, avec les examinateurs en aveugle à la fois le génotype et le traitement. Ce système de notation a été previously décrit ^6,7,10.

Résultats

Les parois cellulaires des bactéries Gram-négatives sont constituées de LPS, ce qui est très abondant dans l'environnement. L'inhalation de LPS dans les populations humaines sensibles exacerbe réactivité des voies respiratoires et est capable de déclencher une response11 immunitaire robuste. LPS est également un PAMP commun utilisé dans des modèles de souris pour induire une réponse immunitaire innée robuste. Dans le protocole décrit ici, les souris ont reçu une dose de LPS il isolé de E. coli...

Discussion

Les étapes les plus critiques pour l'évaluation avec succès la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons de souris est comme suit: 1) choisir la souche de souris approprié et le sexe pour le modèle en cours d'évaluation; 2) optimiser la livraison de PAMP pour les poumons; 3) recueillir et traiter correctement la BALF; et 4) fixer correctement et préparer des poumons pour l'évaluation histopathologique.

Le choix de la souche de souris est un facteur important da...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500