Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

Resumen

Se describe cómo implementar la localización microscopía fotoactivado (PALM) basado en estudios de vesículas en las neuronas cultivadas, fijos. Los componentes clave de nuestro protocolo de etiquetado incluyen vesículas con quimeras fotoconvertible, recogiendo imágenes crudas escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de super-resolución.

Resumen

La detección de la fluorescencia proporciona la base para muchas de las técnicas de microscopía ampliamente utilizados y rápido avance de empleados en las aplicaciones biológicas y médicas modernas. Fortalezas de la fluorescencia son su sensibilidad, especificidad, y la compatibilidad con imágenes en vivo. Desafortunadamente, las formas convencionales de microscopía de fluorescencia sufren de una debilidad importante, la resolución de difracción limitada en el plano de la imagen, lo que dificulta los estudios de estructuras con dimensiones menores que ~ 250 nm. Recientemente, esta limitación ha sido superada con la introducción de técnicas de microscopía de fluorescencia de super-resolución, como la microscopía de localización fotoactivado (PALM). A diferencia de sus contrapartes convencionales, PALM puede producir imágenes con una resolución lateral de decenas de nanómetros. Por lo tanto, es ahora posible usar la fluorescencia, con sus puntos fuertes miríada, para aclarar un espectro de atributos previamente inaccesibles de estructura celular y organización. _content "> Lamentablemente, PALM no es trivial de implementar, y estrategias de éxito a menudo se debe adaptar al tipo de sistema en estudio. En este artículo, mostramos cómo implementar estudios PALM solo color de estructuras vesiculares en neuronas cultivadas, fijos. PALMA es ideal para el estudio de las vesículas, que tienen dimensiones que suelen oscilar entre ~ 50-250 nm. Pasos clave en nuestro enfoque de incluir el etiquetado de las neuronas con fotoconvertible (verde a rojo) quimeras de la carga de la vesícula, la recogida de imágenes en bruto escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de alta resolución PALMA. También demuestran la eficacia de nuestro enfoque mediante la presentación de imágenes excepcionalmente bien resueltas de vesículas de núcleo denso (DCVS) en las neuronas del hipocampo en cultivo, lo que refuta la hipótesis de que la trata de extrasynaptic DCVs está mediada en gran parte por grupos DCV.

Introducción

Un número de procesos celulares dependen de tráfico de vesículas mediada precisa y eficiente de biomoléculas a destinos subcelulares específicos. Un ejemplo destacado es la asamblea sináptica, que está precedida por oscilado largo la entrega, mediada por vesículas sinápticas de los constituyentes de los sitios de la biogénesis del soma neuronal potencialmente distales sitios pre y postsinápticos ^1.

La microscopia de fluorescencia es un método poderoso y popular de estudiar el tráfico de vesículas. Fortalezas de la técnica son su sensibilidad, especificidad, y la compatibilidad con imágenes en vivo ^2. Por desgracia, hasta hace relativamente poco, la técnica ha sufrido de una gran debilidad, la resolución de difracción limitada ^2, lo que dificulta los estudios de estructuras con dimensiones menores que ~ 250 nm. Recientemente, la resolución lateral en microscopía de fluorescencia superó la barrera de difracción con la introducción de super-resolución de fluorescencia millastécnicas de microscopía, como la palma ^3. La resolución lateral de PALMA, decenas de nanómetros, es ideal para el estudio de las vesículas, que tienen dimensiones que suelen oscilar entre ~ 50-250 nm ^4. Por lo tanto, es ahora posible usar la fluorescencia, con sus puntos fuertes miríada, para aclarar un espectro de atributos previamente inaccesibles de vesículas, incluyendo algunos aspectos de su tráfico a sitios subcelulares específicos.

PALMA no es trivial de implementar, y estrategias de éxito a menudo se debe adaptar al tipo de sistema en estudio. Aquí se describe cómo implementar estudios de palma de estructuras vesiculares, y se demuestra la eficacia de nuestro enfoque para el caso de DCVs en las neuronas del hipocampo. En particular, utilizamos PALMA hacer frente a la hipótesis de que la trata de DCVs de sinapsis en las neuronas del hipocampo está mediada por grupos DCV ^5-8.

Tráfico Cluster mediada por vesículas de las sinapsis en el desarrollo de neurons es una posibilidad intrigante, ya que puede facilitar la estabilización sináptica rápida y montaje ^{de 9,10.} Los defensores de la trata agrupada de DCVs citan el gran tamaño aparente de puntos lagrimales fluorescente extrasynaptic albergar carga DCV exógena como la evidencia que soporta clustering ^6. Sin embargo, estos puntos lagrimales aparecen en las imágenes generadas usando técnicas de microscopía de fluorescencia de difracción limitada, que no se adaptan a efectos de tamaño distintivas derivados de difracción de los derivados de la agrupación.

Para resolver este problema, hemos recogido la fluorescencia de campo amplio convencional y las imágenes palma de las neuronas del hipocampo expresan quimeras dirigidos a DCVs. El análisis de estas imágenes reveló que> 92% de los racimos DCV extrasinápticos putativos en imágenes convencionales se resuelven como 80 nm (DCV tamaño individual) ¹¹ puntos lagrimales en imágenes PALMA. Por lo tanto, estos datos invalidan en gran medida la hipótesis de la agrupación como se aplica a DCVs en el desarrollo de hippocaneuronas Mpal.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Preparar ADN que codifica una quimera fotoconvertible o fotoactivable dirigido a DCVs, usando técnicas de biología molecular convencionales.
   Nota: Una posibilidad es ADN que codifica un activador tisular del plasminógeno-Dendra2 quimera (tPA-Dendra2). Dendra2 es una proteína fotoconvertible que cambia de verde a roja de emisión tras la exposición a la luz ultravioleta ^12.
2. Las neuronas del hipocampo Cultura en alto rendimiento # 1.5 cubreobjetos de ~ 5-10 días, siguiendo protocolos estándar ^13.
3. Transfectar el desarrollo de las neuronas del hipocampo usando un reactivo lípido catiónico.
   Nota: la infección mediada por virus es más eficaz para las neuronas maduras. Este enfoque alternativo ha sido descrito en detalle en otra parte ^14.
   1. Preparar un tubo de 1,5 ml que contiene 1 ~ g de ADN y 250 l de medio mínimo esencial (MEM) y un segundo tubo de 1,5 ml que contiene 4 l de reactivo lípido catiónico y 250 ldel MEM.
   2. Incubar las soluciones durante 5 min.
   3. Combinar las dos soluciones y se incuba la mezcla resultante durante 30 minutos adicionales.
   4. Durante la incubación, preparar un plato que contiene varios ml de medio de cultivo se calentó hasta 37 º C.
   5. Transferir suavemente cubreobjetos que contienen las neuronas para el plato que contiene medio de tibia y agregue la mezcla de transfección.
   6. Incline el plato suavemente y luego se coloca en una incubadora a 37 ° C durante 90 min.
   7. Neuronas volver a su "plato de casa" y esperar unos 12 a 18 h.
4. Fijar las células durante 45 min en paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) se calentó a 37 ° C.
   Nota: En los experimentos de palma, es importante para lograr una buena conservación de la ultraestructura, y los protocolos de fijación de formaldehído estándar utilizados para la tinción de inmunofluorescencia típicamente no son suficientes ^15. Una razón importante para la mala conservación estructural es insuficiente ftiempo ixation porque la fijación de formaldehído implica la formación de aductos y la reticulación de proteínas, y el último proceso es bastante lento ^16. Un 45 min de fijación ayuda a mitigar este problema sin pérdida inducida overfixation-detectable de la fluorescencia.
5. Lave la funda se desliza ~ 10 veces con PBS filtrada.
   Nota: Esto reduce los contaminantes fluorescentes. Muestras de la imagen de forma relativamente rápida después de la fijación. En las células intermedias se almacenan a 4 ° C en PBS filtrada en un recipiente a prueba de luz.
6. Cubreobjetos de montaje que contienen las neuronas en una cámara en PBS filtrada.
   Nota: La muestra se debe montar en un medio acuoso, como PBS, con índice de refracción menor que el del vidrio, para poner en práctica la reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) basado en la iluminación. Iluminación basada en TIRF es muy útil porque sólo fluoróforos de deslizamiento proximal de la cubierta se excitan, y hay una gran caída asociado en la fluorescencia de fondo ^17.

2. Adquisición de imágenes

1. Encienda el sistema de imágenes de super-resolución.
   1. Encienda la lámpara de arco.
   2. Da la vuelta al "sistema / PC" y cambia "componentes" (en el interruptor remoto de potencia) en "on".
   3. Encienda el ordenador (después de la estación de la tableta / el acoplamiento de control del microscopio se enciende).
      Nota: La estación base se puede utilizar para controlar y supervisar muchos atributos de la óptica y trayectoria de la luz, en particular la elección del objetivo y el enfoque.
   4. Haga doble clic en el icono del programa y elegir la opción "sistema de arranque" en el diálogo de inicio de sesión.
2. Examine la muestra.
   1. Abra la parte frontal y los paneles de acceso superior en el gabinete de seguridad del láser.
   2. Incline el brazo de luz transmitida para acceder a la etapa y los objetivos.
   3. Poner aceite en la alfa Plan-Apochromat 100X apertura numérica / NC = 1,46 (TIRF) objetivo.
      Nota: Un objetivo 63X de alta NA se puede utilizar en lugar de la 100X.
   4. Montar la muestra en el escenario, y elevar ªe objetivo hacia la muestra.
   5. Vigilar la posición de la lente usando la función XYZ de la estación de acoplamiento. Pare cuando el objetivo se encuentra en el estadio de béisbol de enfoque (por ejemplo, z ~ 2.50 mm).
   6. Cerrar completamente los paneles de acceso.
      Nota: Para activar la seguridad del láser.
   7. Afinar el enfoque utilizando los oculares y los botones de la ficha de localizar.
      Nota: La pestaña localizar proporciona acceso a los botones que producen la iluminación basado en lámpara de arco y facilita la observación directa de la muestra con los oculares. Del mismo modo, la pestaña adquisición proporciona acceso a las herramientas que producen la iluminación basado en láser y facilita la captura de imágenes por la cámara.
      1. Vaya a la pestaña de localizar, elegir la opción "Trans On."
      2. Haga clic en el símbolo de la expansión ocular.
         Nota: Esto nos lleva a un esquema de la trayectoria de la luz. Atribuciones de la trayectoria de la luz se pueden modificar haciendo clic izquierdo iconos correspondientes en el esquema o mediante el uso de la pantalla táctil en la estación de acoplamiento. Por ejemplo, un filtroAdecuado para ver emisiones de Dendra2 puede ser elegido mediante el icono revólver reflector.
      3. Mire por los oculares, y llevar a las células en el enfoque utilizando la estación de acoplamiento como guía.
         Nota: La muestra será muy poco poblada con células fluorescentes debido a las neuronas del hipocampo son difíciles de transfectar, y por lo tanto puede ser un poco difícil enfocar con la iluminación reflejada. Si este es el caso, utilice iluminación transmitida y la lectura z de la estación de acoplamiento como guía.
      4. Cambia la luz "Off" después de enfocar.
3. Identificar una célula que es bastante brillante, exhibe fluorescencia punteada, y tiene una morfología clásica que es indicativo de la buena salud.
   1. Elija la luz reflejada y la adecuada filtro para visualizar la emisión verde de Dendra2.
   2. Busque en la hoja de la cubierta para las células que expresan quimeras Dendra2 usando luz de excitación de baja intensidad.
4. Cambie a la ACQpestaña uisition.
   1. Utilice la opción "gerente experimento" para cargar una configuración adquisición PALMA que está diseñado apropiadamente o modificarse fácilmente.
      Nota: Si no existe tal experimento, el diseño de una configuración experimental empezando con la siguiente configuración como guía: deslizadores potencia del láser: 405 nm (~ 0,01% para un láser mW 50); 488 nm (~ 3% para un láser de 100 mW); 561 nm (~ 40% para un láser de 100 mW); Tiempo de exposición: ~ 50 ms; Ganancia de la cámara: ~ 200; Adquisición Multidimensional: series de tiempo (ciclos = 30.000, intervalo = 0); Pistas: 488 nm con epi-iluminación, y 561 nm con una iluminación a base de TIRF (ver paso 2.5.1); Objetivo: 100X (NA = 1,46); Deslizador ángulo TIRF: ángulo de incidencia ~ 67-72 °; Pixel Tamaño: 100 nm; Campo de visión: TIRF (las opciones alternativas producen intensidades de láser más altos y se utilizan para fluoróforos que son más difíciles de blanquear).
   2. Haz clic en "Sí" cuando aparezca un menú emergente con una consulta sobre el cambio en los láseres.
5. Traiga la imagende la célula en el foco en el plano de la cámara.
   1. Elija la pista láser epi-iluminación 488 nm.
      Nota: Las pistas son configuraciones de haz utilizados durante la exploración. Aquí, nombres de las pistas están determinadas por la longitud de onda de excitación que produce la emisión que se pasa a la cámara. Por ejemplo, la pista de 561 nm utiliza tanto el 405 y 561 líneas de láser nm, pero el cubo de filtro pasa única emisión de photoconverted Dendra2 excitado por 561 nm de luz a la cámara.
   2. Enfoque la imagen de la célula de la cámara con el botón de la adquisición de "continuo".
6. Se recoge una imagen de campo amplio convencional.
   1. Utilice el botón "Snap".
   2. Guardar la imagen, vaya al menú "Archivo" y seleccionando "Guardar / Guardar como."
7. Configurar la iluminación basada en TIRF.
   1. Elija la pista 488 y cambiar a "TIRF" utilizando el botón EPI / TIRF.
   2. Elija adquisición "continuo".
   3. Ajuste tque TIRF-basado deslizador iluminación.
      Nota: TIRF se logra cuando hay un repentino oscurecimiento de fondo y la muestra se puede enfocar en un plano ^18. Si nuevas características se ponen de manifiesto a través de enfoque hasta dentro de la muestra, el ángulo de incidencia es demasiado baja porque en TIRF sólo hay un plano de enfoque.
   4. Vuelva a comprobar el ángulo TIRF usando la pista 561 con el láser de 405 nm "off".
   5. Gire el láser 405 nm de nuevo "on" antes de iniciar un experimento PALMA.
8. Recopilar datos de palma.
   1. Haga clic en "iniciar el experimento."
      Nota: Si lo desea, abra la pestaña "opciones de procesamiento en línea", y marca "PALMA línea de procesamiento" y "Fit gauss2D" (antes de comenzar el experimento) para monitorizar la imagen PALMA reconstruida durante la recolección de datos en bruto. Esto facilitará la evaluación de la calidad de los datos y por lo tanto el valor de continuar el proceso de recopilación de datos relativamente mucho tiempo.
   2. Visualmentemonitorear fotoconversión.
   3. Aumentar la intensidad del láser de 405 nm (photoconverting) cuando disminuye fotoconversión Dendra2 (por lo general después de la adquisición de ~ 10,000 imágenes en bruto).
   4. Continuar el experimento si los aumentos fotoconversión. De lo contrario, deje el experimento (sin pérdida de datos) pulsando el botón de paso actual "stop".
   5. Guarde las imágenes en la recogida de datos se ha completado (después de ~ 15 min).

3. Procesamiento de imágenes, visualización y análisis

1. En ausencia de tratamiento, procesa imágenes RAW en línea que se han guardado en el disco.
   1. Haga clic en la ficha Control, abra la ficha de método y seleccione "Palm".
   2. Elija "PALMA" de nuevo a partir de los cuatro sub-opciones.
   3. Ir al menú de archivo, abrir y ver el archivo de su interés, y pulsa "seleccionar".
   4. Haga clic en "Aplicar".
      Nota: Esto iniciará pico / pico hallazgo fluoróforo y localización con opti defectoons. Si es necesario, los picos también se pueden agrupar mediante la ficha "PAL-Group". Agrupación asigna picos que aparecen en varias tramas consecutivas a una sola molécula de si las coordenadas de pico son suficientemente similares. Además, los datos se pueden corregir para la deriva de la muestra usando la opción de alineación deriva basado en modelo de software.
2. Filtrar los componentes mal localizados y mal comprendidas en la muestra de datos pico-localizada.
   1. Deseche fluoróforos con precisiones de localización, σ,> 35 nm con la función "PAL-filtro".
   2. Deseche fluoróforos en las zonas donde la distancia media entre picos, d, es demasiado grande para resolver las vesículas de diámetro, D.
      1. Extraer la precisión de localización media, σ, a partir del histograma de precisión de localización.
      2. Calcula un valor máximo aceptable para d basado en σ, y la criteron Shannon-Nyquist ^19, que se recoge en la resolución de aproximación ²⁰ R = D =[(2.35σ) ² + (2d) ^{2] 1/2.}
      3. Establecer el umbral de la función "Eliminar valores atípicos PALM" para eliminar picos rodeados de menos de πD ² / (4d ²⁾ vecinos dentro de un círculo de radio D / 2.
   3. Convertir los datos PALMA procesado una imagen de la palma con la función "PAL-Rendering" en; vea la Figura 1.
   4. Cuantificar tamaños y separaciones seleccionando la función "Perfil".
      1. Compruebe la línea asociada y opciones de tabla, y trace una línea a lo largo de la dirección deseada en la imagen.
      2. Cuantificar diámetros determinando anchos llenos a la mitad la intensidad máxima.
      3. Cuantificar las separaciones mediante la determinación de pico a pico de separaciones de perfiles de intensidad.

Resultados

La figura 1 muestra un producto final de formación de imágenes y el procesamiento. En esta imagen PALMA, coordenadas laterales de fluoróforos localizados se muestran utilizando el modo de visualización centroide, y la imagen de super-resolución del DCV asociados se muestra usando el modo de visualización de Gauss.

Figura 2A muestra widefield análoga e imágenes palma de la soma y los procesos proximales de un niño de ocho días en las neuron...

Discusión

PALMA y técnicas de microscopía de fluorescencia de super-resolución relacionados han surgido recientemente como un valioso complemento de las formas más establecidas de la microscopía óptica y microscopía electrónica (EM) ^22-24. Los atributos positivos de la palma incluyen la preparación de muestras relativamente simple y mínima perturbación de la muestra. En principio, Palm también se puede utilizar para estudiar las células de vida. Probablemente el principal atributo negativo de palma es la a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss PALM	Carl Zeiss, Inc.	Elyra PS.1	With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668-019
Minimum Essential Medium	Life Technologies	11095-080
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-8501
Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D	Fisher Scientific	NC0059095