Супер-Resolution Imaging нейронных Плотные-ядерные пузырьков

Резюме

Опишем, как реализовать фотоактивируемые локализации микроскопии (PALM) на основе исследования пузырьков в основной, культивируемых нейронов. Ключевые компоненты нашего протокола включают маркировки пузырьки с photoconvertible химер, собирая редко выборочные необработанных изображений с системой микроскопии сверхвысокого разрешения, и обработка исходных изображения на продукцию супер-разрешение изображения.

Аннотация

Обнаружение флуоресценции обеспечивает основу для многих широко используемых и быстро развивающихся методов микроскопии, занятых в современных биологических и медицинских приложений. Сильные флуоресценции включают его чувствительности, специфичности и совместимость с живого изображения. К сожалению, обычные формы флуоресцентной микроскопии страдают от одного крупного слабость, разрешение дифракционной в плоскости изображения, что затрудняет исследования структур с размерами, меньшими, чем ~ 250 нм. В последнее время это ограничение было преодолеть с введением методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, таких как фотоактивируемой локализации микроскопии (PALM). В отличие от своих обычных аналогов, PALM может создавать изображения с пространственным разрешением в десятки нанометров. Таким образом, теперь можно использовать флуоресценцию, с его бесчисленными сильные стороны, чтобы пролить свет на спектр ранее недоступных атрибутов клеточной структуры и организации. _content "> К сожалению, PALM не является тривиальной в реализации, и успешные стратегии часто должны быть адаптированы к типу изучаемой системы. В этой статье мы покажем, как реализовать одноцветных PALM исследования везикулярного структур на рынке фиксированных, культивируемых нейронов. PALM идеально подходит для изучения пузырьков, которые имеют размеры, которые, как правило, варьируются от ~ 50-250 нм. Ключевые шаги в нашем подходе включают маркировки нейронов с photoconvertible (зеленый на красный) химеры пузырьков груза, собирая редко выборочные необработанных изображений с Система микроскопии супер-разрешения и обработки необработанных изображений с целью выработать PALM изображение высокого разрешения. Мы также продемонстрировать эффективность нашего подхода, представляя исключительно хорошо решены образы плотной основных пузырьков (DCVS) в культивируемых нейронах гиппокампа, которые опровергают гипотеза, что extrasynaptic торговля DCVS опосредуется в основном DCV кластеров.

Введение

Ряд клеточных процессов зависит от точного и эффективного везикул-опосредованной торговли биомолекул на конкретные субклеточных направлений. Один из ярких примеров является синаптической собрание, которое предшествует долго колебался, везикул-опосредованной доставки синаптических компонентов из сайтов биогенеза в нейронной сомы к потенциально дистальных пред-и постсинаптических участках ^1.

Флуоресцентная микроскопия является мощным и популярным методом изучения торговлей пузырьков. Сильные стороны метода относятся его чувствительность, специфичность и совместимость с живого изображения ^2. К сожалению, до сравнительно недавнего времени, техника не пострадал от одного из основных недостатков, дифракционной разрешением ^2, что затрудняет исследования структур с размерами, меньшими, чем ~ 250 нм. Недавно, боковая разрешение в флуоресцентной микроскопии превзошел дифракции барьер с введением флуоресценции ми супер-разрешениямикроскопия методы, такие как PALM ^3. Боковое разрешение PALM, десятки нанометров, идеально подходит для изучения пузырьков, которые имеют размеры, которые, как правило, варьируются от ~ 50-250 нм ^4. Таким образом, теперь можно использовать флуоресценцию, с его бесчисленными сильные стороны, чтобы пролить свет на спектр ранее недоступных атрибутов пузырьков, в том числе некоторые аспекты их торговли на конкретные субклеточных сайтов.

PALM не является тривиальной в реализации, и успешные стратегии часто должны быть адаптированы к типу исследуемой системы. Здесь мы опишем, как реализовать исследований ладони везикулярного структур, и мы продемонстрировать эффективность нашего подхода для случая DCVS в нейронах гиппокампа. В частности, мы используем PALM обратиться гипотезу, что торговля DCVS чтобы синапсов в нейронах гиппокампа опосредуется DCV кластеров ^5-8.

Кластер-опосредованной торговля пузырьков в синапсах в развивающихся пeurons является интригующая возможность, потому что это может способствовать скорейшей стабилизации синапсов и сборку ^9,10. Сторонники кластерного торговли DCVS привести большой видимый размер extrasynaptic флуоресцентного Puncta укрывательство экзогенный DCV груз как доказательств, подтверждающих кластеризации ^6. Однако эти Puncta На изображениях появляются генерируемых с помощью дифракционной флуоресценции методы микроскопии, которые не подходят для отличительных размерных эффектов, возникающих от дифракции от тех, которые вызваны кластеризации.

Чтобы решить эту проблему, мы собрали обычную флуоресценции широким полем зрения и пальмовое образы нейронов гиппокампа, выражающих химеры, ориентированные на DCVS. Анализ этих изображений показал, что> 92% предполагаемых extrasynaptic кластеров DCV в обычных изображений решаются как 80 нм (индивидуальное DCV размера) ¹¹ Puncta в Палм-изображений. Таким образом, эти данные в значительной степени недействительным кластеризации гипотезу применительно к DCVS в разработке hippocampal нейроны.

протокол

1. Подготовка образца

1. Подготовка ДНК, кодирующей photoconvertible или Фотоактивируемые химеру, ориентированные на DCVS, с использованием стандартных методов молекулярной биологии.
   Примечание: Одна из возможностей состоит ДНК, кодирующей тканевой активатор плазминогена-Dendra2 химера (ТАП-Dendra2). Dendra2 является photoconvertible белок, который переключается с зеленого на красный излучения при воздействии ультрафиолетового света ^12.
2. Культура нейроны гиппокампа на высокоэффективной # 1.5 крышкой скользит в течение ~ 5-10 дней, в соответствии со стандартными протоколами ^13.
3. Трансфекции разработке гиппокампа нейронов использованием катионного липида реагента.
   Примечание: Вирусные инфекции-опосредованной является более эффективным для зрелых нейронов. Этот альтернативный подход был описан подробно в другом месте ^14.
   1. Приготовьте 1,5 мл пробирку, содержащую ~ 1 мкг ДНК и 250 мкл минимальной поддерживающей среде (MEM), и второй трубки 1,5 мл, содержащую 4 мкл катионного липида реагента и 250 мклЗЭМ.
   2. Выдержите решения в течение 5 мин.
   3. Смешайте два решения и инкубировать полученную смесь в течение еще 30 мин.
   4. Во время инкубации, готовить блюда, содержащий несколько мл культуральной среды нагревают до 37 ° С.
   5. Аккуратно перенести покровные стекла, содержащие нейроны к блюду с теплой среды и добавьте трансфекции смесь.
   6. Наклоните блюдо осторожно, а затем поместить его в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 90 мин.
   7. Вернуться нейронов к их "дома блюдо" и ждать ~ 12-18 час.
4. Исправить клетки в течение 45 мин в 4% параформальдегида / 4% сахарозы в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, рН 7,4) нагревают до 37 ° С.
   Примечание: в пальмовом экспериментов, важно для достижения хорошей сохранности ультраструктуры и стандартные протоколы формальдегид, используемые для фиксации иммунофлуоресцентного окрашивания обычно не являются достаточными ^15. Одной из главных причин плохого структурной сохранения недостаточно еВремя ixation потому формальдегида фиксации включает образование аддукта и белка сшивание, и последний процесс довольно медленный ^16. 45 мин фиксация помогает смягчить эту проблему без заметного overfixation вызванной потерей флуоресценции.
5. Вымойте крышка скользит ~ 10x с фильтрованной PBS.
   Примечание: Это уменьшает флуоресцентных примесей. Образцы изображение относительно быстро после фиксации. Тем временем, в магазине клеток при 4 ° С в фильтрованной PBS в светонепроницаемый контейнер.
6. Покровные стекла Mount содержащие нейроны в камере в фильтрованной PBS.
   Примечание: Образец должен быть установлен в водной среде, как PBS, с показателем преломления ниже, чем у стекла, для реализации полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) на основе освещения. TIRF основе освещение очень полезно, потому что только крышка скольжения-проксимального флуорофоры взволнованы, и есть большой связано падение фоновой флуоресценции ^17.

2. Приобретение изображения

1. Включите системы формирования изображений супер-разрешением.
   1. Включите лампу дуги.
   2. Переверните "системы / шт" и "компонент" переключателей (на пульте дистанционного выключателя питания), чтобы "на".
   3. Включите компьютер (после контрольной микроскоп планшет / док-станция поставляется на).
      Примечание: док-станция может быть использована для контроля и мониторинга многие атрибуты оптики и пути света, в частности выбор объективным и внимания.
   4. Дважды щелкните значок программного обеспечения и выберите опцию "Start System" в окне входа.
2. Изучите образец.
   1. Откройте переднюю и верхние панели доступа на лазерной безопасности кабинета.
   2. Наклоните проходящем свете руку, чтобы получить доступ к рабочей и цели.
   3. Нанести масло на альфа План-Apochromat 100X числовой апертурой / NA = 1,46 (TIRF) цель.
      Примечание: 63X высокого NA цель может быть использован вместо части 100X.
   4. Установите образец на сцене, а также повысить тыс.е задача к образцу.
   5. Контролировать положение объектива с помощью функции XYZ в док-станции. Остановитесь, когда объектив на стадионах фокуса (например, г ~ 2.50 мм).
   6. Полностью закрыть панели доступа.
      Примечание: Для включения безопасности лазера.
   7. Точно настройте фокусировку с помощью окуляров и кнопки на вкладке найти.
      Примечание: На вкладке найдите обеспечивает доступ к кнопкам, которые производят дуговой лампы на основе освещение и облегчает непосредственное наблюдение образца с окуляров. Кроме того, вкладка приобретение обеспечивает доступ к инструментам, которые производят на основе лазера освещение и облегчает захват изображения с помощью камеры.
      1. Перейдите на вкладку найти, выбрать "Транс On".
      2. Нажмите на глазной символ расширения.
         Примечание: Это поднимает схема пути света. Атрибуты пути света может быть изменена путем левой кнопкой мыши соответствующие значки на схеме или с помощью сенсорного экрана на док-станции. Например, фильтрподходит для просмотра излучение Dendra2 можно выбрать с помощью значка отражатель револьвер.
      3. Посмотрите в окуляры, и принести клетки в центре внимания с помощью док-станции в качестве ориентира.
         Примечание: Образец будет очень малонаселенной флуоресцирующих клеток, потому что нейроны гиппокампа являются трудными для трансфекции, и это таким образом, может быть немного сложнее сфокусироваться с помощью отраженного освещения. Если это так, используйте проходящем свете и г чтение док-станции в качестве ориентира.
      4. Переключите свет "Off" после фокусировки.
3. Определить ячейки, расположенной довольно яркий, проявляет флуоресценцию точечный, и имеет классический морфологию, что является показателем хорошего здоровья.
   1. Выберите отраженный свет и фильтра, подходящий для просмотра зеленое излучение от Dendra2.
   2. Сканирование покровное для клеток, экспрессирующих Dendra2 химеры с помощью света возбуждения низкой интенсивности.
4. Переключитесь на ACQuisition вкладка.
   1. Используйте "менеджер эксперимент", чтобы загрузить конфигурацию приобретения PALM, что соответствующим образом предназначенные или легко модифицировать.
      Примечание: Если такой эксперимент не существует, создать, начиная экспериментальную конфигурацию, используя следующие настройки в качестве ориентира: Лазерные ползунки питания: 405 нм (~ 0,01% для мВт лазер 50); 488 нм (~ 3% для мВт лазера 100); 561 нм (~ 40% для мВт лазера 100); Экспозиция: ~ 50 мс; Усиления камеры: ~ 200; Многомерные приобретение: временные ряды (циклы = 30000, интервал = 0); Количество треков: 488 нм с эпи-подсветкой и 561 нм с TIRF основе освещения (см. шаг 2.5.1); Цель: 100X (NA = 1,46); Угол TIRF слайдер: угол падения ~ 67-72 °; Размер пикселя: 100 нм; Поле зрения: TIRF (альтернативные варианты дают более высокие интенсивности лазерных и используются для флуорофорами, которые труднее для отбеливания).
   2. Нажмите кнопку "да", когда всплывающее меню появляется с запросом о включении лазеров.
5. Принесите изображениеиз клетки в центре внимания на плоскости камеры.
   1. Выберите 488 нм эпи-подсветки лазерный трек.
      Примечание: Композиции являются конфигурации пучка, используемые во время съемки. Здесь, названия треков определяются длины волны возбуждения, который производит выброс, который передается в камеру. Например, нм трек 561 использует как 405 и 561 нм лазерные линии, но куб фильтр пропускает только излучение photoconverted Dendra2 возбуждается 561 нм света к камере.
   2. Сфокусируйтесь на изображении ячейки на камере с помощью кнопки приобретения "непрерывный".
6. Сбор обычного широким полем зрения изображения.
   1. Используйте кнопку "оснастку".
   2. Сохранить изображение, перейдя в меню "Файл" и выбрав пункт "сохранить / сохранить как."
7. Настройте TIRF основе освещение.
   1. Выберите 488 трек и перейти на "TIRF" с помощью кнопки РПИ / TIRF.
   2. Выберите "непрерывный" приобретение.
   3. Отрегулируйте тон TIRF основе освещение слайдер.
      Примечание: TIRF достигается, когда есть внезапное потемнение фона и образец может быть сфокусирован в одной плоскости ^18. Если новые функции становятся очевидными через фокусировки вверх в образце, угол падения слишком низкая, потому что в TIRF есть только один самолет в фокусе.
   4. Тщательно проверьте угол TIRF с помощью 561 трек с 405 нм лазер "выключено".
   5. Поверните 405 нм лазер спине "на" до начала эксперимент PALM.
8. Сбор данных Palm.
   1. Хит "начать эксперимент."
      Примечание: При желании, откройте вкладку "онлайн опций обработки" и проверьте "онлайн обработки PALM" и "Fit Gauss2D" (до начала эксперимента) для мониторинга реконструированный PALM изображения во время сбора первичных данных. Это облегчит оценку качества данных и, таким образом значение продолжения относительно трудоемкий процесс сбора данных.
   2. Визуальноследить фотоконверсии.
   3. Увеличение интенсивности 405 нм (photoconverting) лазера при Dendra2 фотопреобразования уменьшается (как правило, после приобретения ~ 10000 необработанных изображений).
   4. Продолжить эксперимент, если фотопреобразования увеличивается. В противном случае, прекратить эксперимент (без потери данных), нажав «Стоп» текущий кнопку шаг.
   5. Сохраните изображения, когда сбор данных будет завершена (после ~ 15 мин).

3. Обработка изображений, дисплей, и анализ

1. В отсутствие оперативной обработки, технологических необработанных изображений, которые были сохранены на диск.
   1. Перейдите на вкладку обработки, откройте вкладку метод, и выберите пункт "PALM".
   2. Выберите "Palm" снова от четырех подопций.
   3. Перейдите в меню файла, открывать и просматривать интересующий файл, и нажмите кнопку "выбрать".
   4. Хит "применить".
      Примечание: Эта команда начнет локализацию пик / ознакомительную флуорофором и пиковую с умолчанию OptiДополнения. При необходимости, пики также могут быть сгруппированы с помощью вкладки "PAL-Group". Группировка назначает пики, которые появляются в нескольких последовательных кадров в одной молекуле Если пик координаты достаточно похожи. Кроме того, данные могут быть скорректированы для образца дрейфа с помощью основанного на модели вариант выравнивания дрейфа программного обеспечения.
2. Фильтр из плохо локализованные и плохо обследованных компоненты в данных пиковых локализованные.
   1. Откажитесь флуорофоры с локализации уточнений, σ,> 35 нм с использованием "PAL-Фильтр" инструмент.
   2. Откажитесь флуорофоры в районах, где среднее расстояние между пиками, D, является слишком большим, чтобы решить везикулы диаметром, D.
      1. Выписка точность среднее локализации, σ, от точности локализации гистограммы.
      2. Рассчитать максимально допустимое значение D на основе σ, и Шеннона-Найквиста критерий по ^19, как это предусмотрено в резолюции приближение ²⁰ R = D =[(2.35σ) ² + (2d) ^{2] 1/2.}
      3. Установите порог в "Удалить PALM выбросы" инструмент для удаления пики, окруженные менее ^nd-2 / (4d ²⁾ соседей в пределах круга радиусом D / 2.
   3. Преобразование обработанные данные PALM в PALM изображения, используя "PAL-визуализации" инструмент; см. рисунок 1.
   4. Количественная размеры и разделения, выбрав функцию "Профиль".
      1. Проверьте, связанный линии и опции таблицы, и нарисуйте линию вдоль нужном направлении в изображении.
      2. Количественная диаметры путем определения полной ширины на половине максимальной интенсивности.
      3. Количественная разделения путем определения пика до пика расстояний профилей интенсивности.

Результаты

На рисунке 1 показана одна конечный продукт обработки изображений и обработки. В этом PALM изображения, боковые координаты локализованных флуорофорами показаны в режиме центроидной дисплея, а также супер-разрешение изображения соответствующего DCV показан в режиме Gaussian дисплея...

Обсуждение

PALM и связанные флуоресценции методы микроскопии сверхвысокого разрешения в последнее время появились в качестве ценного дополнения к лучше-установленным формам оптической микроскопии и электронной микроскопии (ЭМ) ^22-24. Положительные атрибуты PALM включают относительно простой ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss PALM	Carl Zeiss, Inc.	Elyra PS.1	With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668-019
Minimum Essential Medium	Life Technologies	11095-080
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-8501
Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D	Fisher Scientific	NC0059095