Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core

Riepilogo

Si descrive come implementare fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini crude per produrre un'immagine super-risoluzione.

Abstract

Rilevamento della fluorescenza fornisce le basi per molte tecniche di microscopia molto utilizzate e in rapido progresso impiegati in applicazioni biologiche e mediche moderne. Punti di forza della fluorescenza comprendono la sua sensibilità, la specificità e la compatibilità con l'imaging dal vivo. Purtroppo, forme convenzionali di microscopia a fluorescenza soffrono di una debolezza, risoluzione diffrazione limitata importante nel piano di imaging, che ostacola studi di strutture con dimensioni inferiori a ~ 250 nm. Recentemente, questa limitazione è stata superata con l'introduzione di super-risoluzione tecniche di microscopia a fluorescenza, come la microscopia localizzazione fotoattivati ​​(PALM). A differenza dei suoi omologhi convenzionali, PALM grado di produrre immagini con una risoluzione laterale di decine di nanometri. È quindi ora possibile utilizzare fluorescenza, con la sua miriade di forza, per chiarire uno spettro di attributi precedentemente inaccessibili di struttura e organizzazione cellulare. _content "> Purtroppo, PALM non è banale da implementare e strategie di successo, spesso, devono essere adattati al tipo di sistema in fase di studio. In questo articolo mostriamo come implementare studi PALMA monocolore di strutture vescicolari, in neuroni in coltura fissi. PALM è ideale per lo studio delle vescicole, che hanno dimensioni che in genere vanno da ~ 50-250 nm. passaggi chiave nel nostro approccio includere etichettatura neuroni con fotoconvertibile (verde a rosso) chimere di vescicole carico, la raccolta di immagini RAW scarsamente campionate con sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini raw per produrre un'immagine PALM ad alta risoluzione. Abbiamo anche dimostrare l'efficacia del nostro approccio con la presentazione di immagini eccezionalmente ben risolte, di vescicole dense-core (DCVS) in neuroni ippocampali in coltura, che confutare l'ipotesi che il traffico extrasinaptica di DCVs è mediato principalmente dai cluster DCV.

Introduzione

Un certo numero di processi cellulari dipendono traffico accurato ed efficiente vescicola-mediata di biomolecole a destinazioni specifiche subcellulari. Un esempio importante è l'Assemblea sinaptica, che è preceduto da lunga distanza, consegna vescicola-mediata dei componenti sinaptiche da siti di biogenesi nel soma neuronale potenzialmente distali siti pre-e post-sinaptici ^1.

Microscopia a fluorescenza è un metodo potente e popolare di studiare il traffico di vescicole. Punti di forza di questa tecnica sono la sua sensibilità, la specificità e la compatibilità con l'imaging dal vivo ^2. Purtroppo, fino a tempi relativamente recenti, la tecnica ha subito da una grande debolezza, risoluzione di diffrazione limitata ^2, che ostacola gli studi di strutture con dimensioni inferiori a ~ 250 nm. Recentemente, risoluzione laterale in microscopia a fluorescenza superato la barriera di diffrazione con l'introduzione di mi fluorescenza super-risoluzionetecniche croscopy, come PALM ^3. La risoluzione laterale di PALM, decine di nanometri, è ideale per lo studio delle vescicole, che hanno dimensioni che in genere vanno da ~ 50-250 nm ^4. È quindi ora possibile utilizzare fluorescenza, con la sua miriade di forza, per chiarire uno spettro di attributi precedentemente inaccessibili di vescicole, compresi alcuni aspetti del loro traffico verso specifici siti subcellulari.

PALM non è banale da implementare e strategie di successo, spesso, devono essere adattati al tipo di sistema in fase di studio. Qui si descrive come implementare studi Palma di strutture vescicolari, e abbiamo dimostrato l'efficacia del nostro approccio per il caso di DCVs in neuroni dell'ippocampo. In particolare, usiamo PALM affrontare l'ipotesi che il traffico di DCVs alle sinapsi dei neuroni dell'ippocampo è mediato dai cluster DCV ^5-8.

Traffico Cluster-mediata di vescicole di sinapsi nello sviluppo di neurons è una possibilità intrigante perché può facilitare una rapida stabilizzazione sinaptica e il montaggio ^9,10. I fautori della tratta cluster di DCVs citano la grande dimensione apparente del puncta fluorescente extrasinaptica ospitare esogeno DCV carico come prove a sostegno di clustering ^6. Tuttavia, questi puncta appaiono in immagini generate utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza diffrazione limitata, che non sono adatti a distinguere gli effetti di dimensioni derivanti dalla diffrazione da quelli derivanti da clustering.

Per risolvere questo problema, abbiamo raccolto convenzionale fluorescenza widefield e le immagini palmo di neuroni dell'ippocampo che esprimono chimere mirati a DCVs. L'analisi di queste immagini ha rivelato che il> 92% dei presunti cluster DCV extrasynaptic in immagini convenzionali sono risolti come 80 nm (individuale DCV-sized) ¹¹ puncta in immagini PALM. Quindi, questi dati ampiamente invalidare l'ipotesi di clustering applicati agli DCVs nello sviluppo hippocaneuroni mpal.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Preparare DNA codificante una chimera fotoconvertibile o photoactivatable mirato al DCVs, utilizzando tecniche di biologia molecolare standard.
   Nota: Una possibilità è DNA che codifica un attivatore tissutale del plasminogeno-Dendra2 chimera (tPA-Dendra2). Dendra2 è una proteina fotoconvertibile che passa dal verde al rosso emissione per esposizione a luce ultravioletta ^12.
2. Neuroni dell'ippocampo sulla cultura ad alte prestazioni # 1.5 copertura scivola per ~ 5-10 giorni, seguendo protocolli standard ^13.
3. Trasfezione sviluppare neuroni ippocampali utilizzando un reagente lipide cationico.
   Nota: infezione virale-mediata è più efficace per i neuroni maturi. Questo approccio alternativo è stato descritto in dettaglio altrove ^14.
   1. Preparare una provetta da 1,5 ml contenente ~ 1 mg di DNA e 250 pl di mezzo minimo essenziale (MEM) ed una seconda provetta da 1,5 ml contenente 4 ml di reagente lipide cationico e 250 microlitridi MEM.
   2. Incubare le soluzioni per 5 min.
   3. Combinare le due soluzioni e incubare la miscela risultante per altri 30 min.
   4. Durante l'incubazione, preparare un piatto contenente diversi ml di terreno di coltura riscaldata a 37 ° C.
   5. Delicatamente trasferire vetrini contenenti neuroni al piatto contenente il mezzo di caldo e aggiungere la miscela di trasfezione.
   6. Inclinare il piatto delicatamente e poi riporla in un incubatore a 37 ° C per 90 min.
   7. Neuroni tornare alla loro "piatto di casa" e attendere ~ 12-18 ore.
4. Fissare le cellule per 45 min a 4% paraformaldeide / 4% di saccarosio in tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4) riscaldata a 37 ° C.
   Nota: Negli esperimenti PALM, è importante per ottenere una buona conservazione del ultrastruttura e protocolli di fissaggio formaldeide standard utilizzati per immunofluorescenza in genere non sono sufficienti ^15. Una ragione importante per cattiva conservazione strutturale è insufficiente ftempo ixation perché fissazione con formaldeide comporta la formazione di addotti e proteine ​​reticolazione, e quest'ultimo processo è abbastanza lento ^16. A 45 min fissazione aiuta ad attenuare questo problema senza perdita overfixation indotta rilevabile di fluorescenza.
5. Copertura Wash scivola ~ 10x con filtrato PBS.
   Nota: Questo riduce i contaminanti fluorescenti. Campioni di immagini in tempi relativamente brevi dopo la fissazione. Nel frattempo, le cellule conservare a 4 ° C in PBS filtrato in un contenitore a tenuta di luce.
6. Vetrini Mount contenenti neuroni in una camera in filtrato PBS.
   Nota: Il campione deve essere montato in un mezzo acquoso, come PBS, con indice di rifrazione inferiore a quello del vetro, per attuare totale fluorescenza interna riflessione (TIRF) basata illuminazione. Illuminazione basato TIRF-è molto utile perché solo copertura fluorofori slittare-prossimale sono eccitati, e vi è una forte caduta associato a fluorescenza di fondo ^17.

2. Image Acquisition

1. Accendere il sistema di imaging super-risoluzione.
   1. Accendere la lampada ad arco.
   2. Capovolgere il switch "componente" "Sistema / pc" e (l'interruttore di alimentazione remota) su "on".
   3. Accendere il computer (dopo il tablet / docking station controllo microscopio si accende).
      Nota: La docking station può essere utilizzato per controllare e monitorare molti attributi delle ottiche e il percorso della luce, in particolare la scelta dell'obiettivo e messa a fuoco.
   4. Fare doppio clic sull'icona del software e scegliere l'opzione "sistema start" nella finestra di login.
2. Esaminare il campione.
   1. Aprire il frontale e pannelli di accesso superiore alla cappa di sicurezza laser.
   2. Inclinare il braccio di luce trasmessa per accedere al palco e obiettivi.
   3. Mettere olio sul piano alfa-Apochromat 100X apertura numerica / NA = 1.46 (TIRF) obiettivo.
      Nota: A 63X obiettivo high-NA può essere utilizzato al posto del 100X.
   4. Montare il campione sul palco, e sollevare °e obiettivo verso il campione.
   5. Monitorare la posizione dell'obiettivo utilizzando la funzione XYZ della docking station. Fermarsi quando la lente è nel campo da baseball di messa a fuoco (ad esempio, z ~ 2,50 millimetri).
   6. Chiudere completamente i pannelli di accesso.
      Nota: Per attivare la sicurezza laser.
   7. Ottimizzare la messa a fuoco utilizzando gli oculari ei pulsanti nella scheda localizzare.
      Nota: La scheda localizzare fornisce l'accesso ai pulsanti che producono arco di illuminazione basato su lampade e facilita l'osservazione diretta del campione con gli oculari. Allo stesso modo, la scheda di acquisizione fornisce l'accesso a strumenti che producono un'illuminazione a base di laser e facilita la cattura delle immagini dalla fotocamera.
      1. Vai alla scheda di individuare, scegliere "Trans On".
      2. Fare clic sul simbolo di espansione oculare.
         Nota: Questo porta una schematica del percorso della luce. Attributi del percorso della luce può essere alterato da sinistra cliccando su apposite icone nello schema o utilizzando il touch screen sulla docking station. Ad esempio, un filtroappropriato per la visualizzazione di emissione da Dendra2 può essere scelto utilizzando l'icona del riflettore revolver.
      3. Guardare negli oculari, e portare le cellule a fuoco utilizza la docking station come guida.
         Nota: Il campione sarà molto scarsamente popolata con cellule fluorescenti perché i neuroni dell'ippocampo sono difficili da trasfezione, e quindi può essere un po 'difficile mettere a fuoco con un'illuminazione riflessa. Se questo è il caso, utilizzare illuminazione trasmessa e la lettura z della docking station come guida.
      4. Alterna la luce "Off" dopo la focalizzazione.
3. Identificare una cella che è abbastanza brillante, esibisce puntiformi fluorescenza, e ha una morfologia classico che è indicativo di una buona salute.
   1. Scegliere luce riflessa e l'appropriato filtro per la visualizzazione le emissioni verde da Dendra2.
   2. Eseguire la scansione del vetrino di cellule esprimenti chimere Dendra2 usando la luce a bassa intensità di eccitazione.
4. Passare alla acqscheda uisition.
   1. Utilizzare il "manager esperimento" per caricare una configurazione di acquisizione PALM che è opportunamente progettato o modificato facilmente.
      Nota: Se nessun esperimento del genere esiste, creare una configurazione di partenza sperimentale utilizzando le seguenti impostazioni come guida: cursori di potenza del laser: 405 nm (~ 0,01% per un laser 50 mW); 488 nm (~ 3% per un laser mW 100); 561 nm (~ 40% per un laser mW 100); Tempo di esposizione: ~ 50 msec; Guadagno della telecamera: ~ 200; Acquisizione multidimensionali: serie temporale (cicli = 30.000, interval = 0); Tracks: 488 nm con epi-illuminazione, e 561 nm con illuminazione a base di TIRF (vedi passo 2.5.1); Obiettivo: 100X (NA = 1.46); Cursore Angolo TIRF: angolo di incidenza ~ 67-72 °; Dimensione dei pixel: 100 nm; Campo di vista: TIRF (le scelte alternative producono intensità del laser più elevati e vengono utilizzati per fluorofori che sono più difficili da candeggina).
   2. Fare clic su "sì" quando appare un menu pop-up con una query su accensione laser.
5. Portare l'immaginedella cella a fuoco sul piano fotocamera.
   1. Scegliere la traccia laser epi-illuminazione di 488 nm.
      Nota: le canzoni sono configurazioni raggio utilizzato durante l'imaging. Qui, i nomi delle tracce sono determinati dalla lunghezza d'onda di eccitazione che produce l'emissione che viene passato alla fotocamera. Ad esempio, la traccia 561 nm utilizza sia il 405 e 561 linee laser nm, ma il cubo filtro passa unica emissione da photoconverted Dendra2 eccitato da 561 nm luce alla telecamera.
   2. Mettere a fuoco l'immagine della cella della fotocamera utilizzando il tasto di acquisizione "continua".
6. Raccogliere un'immagine widefield convenzionale.
   1. Usare il tasto "Snap".
   2. Salvare l'immagine andando nel menu "File" e scegliendo "Salva / Salva come."
7. Impostare l'illuminazione basata TIRF.
   1. Scegliere la pista 488 e passare a "TIRF" utilizzando il tasto EPI / TIRF.
   2. Scegliere acquisizione "continua".
   3. Regolare tegli TIRF basata cursore illuminazione.
      Nota: TIRF si ottiene quando vi è un improvviso oscuramento di sfondo e il campione può essere focalizzata su un piano ^18. Se nuove caratteristiche diventano evidenti attraverso concentrandosi su nel campione, l'angolo di incidenza è troppo bassa perché in TIRF c'è solo un piano di attenzione.
   4. Doppio controllare l'angolo TIRF utilizzando la traccia 561 con il laser 405 nm "off".
   5. Ruotare il laser 405 nm torna "on" prima di avviare un esperimento PALM.
8. Raccogliere dati PALM.
   1. Hit "start esperimento."
      Nota: Se si desidera, aprire la scheda "opzioni di elaborazione on-line" e spunta "PALM linea di trasformazione" e "Fit Gauss2D" (prima di iniziare l'esperimento) per monitorare l'immagine PALM ricostruita durante la raccolta dei dati grezzi. Ciò faciliterà la valutazione della qualità dei dati e quindi il valore di continuare il processo di raccolta dati relativamente tempo.
   2. Visivamentemonitorare fotoconversione.
   3. Aumenta l'intensità del laser 405 nm (photoconverting) quando Dendra2 diminuisce fotoconversione (in genere dopo l'acquisizione di ~ 10.000 immagini crude).
   4. Continua l'esperimento, se aumenta fotoconversione. In caso contrario, interrompere l'esperimento (senza perdita di dati), premendo il tasto "stop" passo corrente.
   5. Salvare le immagini quando la raccolta dei dati è completa (dopo ~ 15 min).

3. Elaborazione immagini, visualizzazione e analisi

1. In assenza di linea di trasformazione, elaborare immagini crude che sono stati salvati su disco.
   1. Fare clic sulla scheda di elaborazione, aprire la scheda metodo, e selezionare "PALM".
   2. Scegliere "PALM" di nuovo dai quattro sotto-opzioni.
   3. Vai al menu dei file, aprire e visualizzare il file di interesse, e premi "seleziona".
   4. Clicca su "Applica".
      Nota: Questo avvierà picco / fluoroforo individuazione e la localizzazione di picco con otti predefinitoons. Se necessario, i picchi possono anche essere raggruppati utilizzando la scheda "PAL-Group". Raggruppamento assegna picchi che compaiono in diversi fotogrammi consecutivi di una singola molecola, se le coordinate di picco sono sufficientemente simili. Inoltre, i dati possono essere corretti per la deriva del campione utilizzando l'opzione di allineamento deriva model-based del software.
2. Filtrare i componenti mal localizzati e mal campionate nei dati di picco-localizzata.
   1. Gettare fluorofori con precisioni di localizzazione, σ,> 35 nm, utilizzando lo strumento "PAL-Filter".
   2. Gettare fluorofori nelle zone in cui la distanza media tra i picchi, d, è troppo grande per risolvere vescicole di diametro, D.
      1. Estrarre la precisione di localizzazione media, σ, dal istogramma precisione di localizzazione.
      2. Calcolare un valore massimo accettabile per d basata su σ, e il Criteron Shannon-Nyquist ^19, come sancito nella risoluzione ravvicinamento ²⁰ R = D =[(2.35σ) ² + (2d) ^{2] 1/2.}
      3. Impostare la soglia in funzione "Elimina valori anomali PALME" per eliminare i picchi circondate da meno di πD ² / (4d ²⁾ vicini di casa all'interno di un cerchio di raggio D / 2.
   3. Convertire i dati PALM trasformato in un'immagine PALM utilizzando lo strumento "PAL-Rendering"; vedi Figura 1.
   4. Quantificare le dimensioni e separazioni scegliendo la funzione "Profilo".
      1. Controllare la linea associata e le opzioni da tavola, e tracciare una linea lungo la direzione desiderata nell'immagine.
      2. Quantificare diametri determinando larghezze pieni a metà intensità massima.
      3. Quantificare separazioni determinando picco-picco distanze di profili di intensità.

Risultati

La Figura 1 mostra un prodotto finale di immagine e l'elaborazione. In questa immagine PALM, coordinate laterali di fluorofori localizzati vengono visualizzati utilizzando la modalità di visualizzazione centroide, e l'immagine super-risoluzione del DCV associato viene visualizzato utilizzando la modalità di visualizzazione gaussiana.

Figura 2A mostra widefield analogo ed immagini palmo della soma e processi prossimali di un otto giorni in vitro...

Discussione

PALM e super-risoluzione relative tecniche di microscopia a fluorescenza hanno recentemente emerso come un prezioso complemento alle forme meglio consolidati di microscopia ottica e microscopia elettronica (EM) ^22-24. Attributi positivi di PALM includono relativamente semplice preparazione del campione e minimale perturbazione del campione. In linea di principio, PALM anche può essere usato per studiare le cellule viventi. Probabilmente il principale attributo negativo di PALM è l'acquisizione di dati r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss PALM	Carl Zeiss, Inc.	Elyra PS.1	With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668-019
Minimum Essential Medium	Life Technologies	11095-080
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-8501
Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D	Fisher Scientific	NC0059095