Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Resumo

Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.

Resumo

A detecção de fluorescência fornece a base para muitas técnicas de microscopia amplamente utilizados e rápido avanço empregados em aplicações biológicas e médicas modernas. Forças de fluorescência incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo. Infelizmente, as formas convencionais de microscopia de fluorescência sofrem de uma grande fraqueza, a resolução de difração limitada no plano de imagem, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, essa limitação foi superada com a introdução de técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, como a microscopia localização fotoativados (PALM). Ao contrário de suas contrapartes convencionais, PALM pode produzir imagens com uma resolução lateral de dezenas de nanômetros. É, portanto, agora possível a utilização de fluorescência, com os seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis da estrutura celular e organização. _content "> Infelizmente, PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Neste artigo, vamos mostrar como implementar estudos PALM uma única cor de estruturas vesiculares, em neurônios cultivados fixos. PALM é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm. As principais etapas da nossa abordagem incluem a rotulagem de neurônios com photoconvertible (verde para vermelho) quimeras de carga vesícula, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia super-resolução e processamento de imagens RAW para produzir imagem PALM de alta resolução. Nós também demonstrar a eficácia da nossa abordagem, apresentando imagens excepcionalmente bem-resolvidos de vesículas densa-core (DCVS) em neurônios do hipocampo em cultura, que refutam a hipótese de que o tráfico de DCV são extrasynaptic é mediado em grande parte por grupos DCV.

Introdução

Um número de processos celulares dependem de tráfico de vesículas mediada preciso e eficiente de biomoléculas a destinos específicos subcelulares. Um exemplo proeminente é a montagem sináptica, que é precedida de longo alcance, a entrega mediada por vesículas sinápticas de eleitores a partir de sites de biogênese na soma neuronal para pré e pós-sinápticos locais potencialmente distais ^1.

A microscopia de fluorescência é um método poderoso e popular de estudar tráfico vesícula. Pontos fortes da técnica incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo ^2. Infelizmente, até há relativamente pouco tempo, a técnica tem sofrido com uma grande fraqueza, resolução de difração limitada ^2, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, a resolução lateral em microscopia de fluorescência ultrapassou a barreira de difração com a introdução de super-resolução mi de fluorescênciatécnicas croscopy, como PALM ^3. A resolução lateral do PALM, dezenas de nanômetros, é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm ^4. Assim, é agora possível a utilização de fluorescência, com seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis de vesículas, incluindo alguns aspectos de seu tráfico para sites subcelulares específicos.

PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Aqui nós descrevemos como implementar estudos palma da estruturas vesiculares, e demonstrar a eficácia da nossa abordagem para o caso de as DCV são em neurônios do hipocampo. Em particular, podemos usar PALM para tratar a hipótese de que o tráfico de DCV são de sinapses em neurónios do hipocampo é mediada por grupos DCV ^5-8.

Tráfico mediada pelo Cluster de vesículas de sinapses no desenvolvimento de neurons é uma possibilidade intrigante, pois pode facilitar a rápida estabilização sináptica e montagem ^9,10. Os defensores do tráfico em cluster do DCV são citar o grande tamanho aparente de puncta fluorescente extrasynaptic abrigar carga DCV exógena como provas agrupamento ^6. No entanto, estes pontos lacrimais aparecem em imagens geradas utilizando técnicas de microscopia de fluorescência limitada de difração, que não são adequados para os efeitos do tamanho de distinção decorrentes da difracção dos que resultem do agrupamento.

Para resolver esse problema, foram coletadas fluorescência widefield convencional e imagens palma da neurônios que expressam quimeras direcionados para as DCV são. A análise destas imagens revelaram que> 92% dos clusters DCV extrasynaptic putativos em imagens convencionais são resolvidos como 80 nm (individual porte DCV-) ¹¹ puncta em imagens de palma. Assim, estes dados largamente invalida a hipótese de agrupamento aplicado a DCV são no desenvolvimento hippocaMpal neurônios.

Protocolo

1. Exemplo de Preparação

1. Preparar ADN que codifica para uma quimera photoconvertible ou fotoactivável alvo para DCV são, utilizando-se técnicas de biologia molecular convencionais.
   Nota: Uma possibilidade é o ADN que codifica um activador do plasminogénio tissular-Dendra2 quimera (tPA-Dendra2). Dendra2 é uma proteína photoconvertible que muda de verde para vermelho emissão após a exposição à luz ultravioleta ^12.
2. Neurônios do hipocampo em cultura de alta performance # 1.5 tampa desliza para ~ 5-10 dias, seguindo protocolos padrão ^13.
3. Transfectar desenvolvimento neurónios do hipocampo utilizando um reagente lipídico catiónico.
   Nota: A infecção viral mediada é mais eficaz para os neurónios maduros. Esta abordagem alternativa tem sido descrito em detalhe noutro local ^14.
   1. Preparar um tubo de 1,5 ml contendo aproximadamente 1 ug de ADN e 250 ul de meio mínimo essencial (MEM) e um segundo tubo de 1,5 mL contendo 4 mL de reagente de lípido catiónico e 250 ulde MEM.
   2. Incubar as soluções durante 5 min.
   3. Combina-se as duas soluções e incuba-se a mistura resultante durante mais 30 min.
   4. Durante a incubação, preparar um prato contendo alguns mililitros de meio de cultura aquecido a 37 ° C.
   5. Gentilmente transferir lamínulas contendo neurônios para o prato contendo meio quente e adicione a mistura de transfecção.
   6. Incline o prato delicadamente e, em seguida, colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C por 90 min.
   7. Retornar neurônios ao seu "prato casa" e esperar ~ 12-18 horas.
4. Fixar as células durante 45 minutos em paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) aquecido a 37 ° C.
   Nota: Em experimentos de palma, que é importante para conseguir uma boa preservação da ultra-estrutura, e os protocolos de fixação formaldeído padrão utilizados para imunofluorescência normalmente não são suficientes ^15. Uma razão importante para a preservação estrutural pobres é insuficiente ftempo ixation porque fixação de formaldeído envolve a formação de aduto e reticulação de proteínas, e este último processo é bastante lento ^16. A fixação de 45 min ajuda a mitigar este problema, sem perda induzida pela excessiva fixação detectável de fluorescência.
5. Cobertura Wash desliza ~ 10x com filtrada PBS.
   Nota: Isto reduz contaminantes fluorescentes. Amostras de imagem de forma relativamente rápida após a fixação. Nas células de armazenagem intermédia a 4 ° C em PBS, filtrado em um recipiente à prova de luz.
6. Lamínulas montagem contendo neurônios em uma câmara em filtrada PBS.
   Nota: A amostra tem de ser montado em um meio aquoso, tal como PBS, com índice de refracção mais baixo do que a do vidro, para implementar fluorescência total reflexão interna (TIRF) à base de iluminação. Iluminação baseadas em TIRF é muito útil porque apenas cobertura fluoróforos deslizamento proximal está animado, e há uma grande queda associada na fluorescência de fundo ^17.

2. Aquisição de Imagem

1. Ligue o sistema de imagem super-resolução.
   1. Ligue a lâmpada de arco.
   2. Virar o "sistema / pc" e interruptores "componentes" (no interruptor remoto de energia) para "on".
   3. Ligue o computador (após o posto de tablet / encaixe controle microscópio acende).
      Nota: A estação de base pode ser usado para controlar e monitorar muitos atributos dos óptica e caminho da luz, nomeadamente escolha de objetivo e foco.
   4. Clique duas vezes no ícone do software e escolha a opção "Sistema start" na caixa de diálogo de login.
2. Examine a amostra.
   1. Abra a parte frontal e painéis de acesso no topo da cabine de segurança laser.
   2. Incline o braço de luz transmitida para acessar o palco e objetivos.
   3. Coloque óleo no alfa Plan-Apochromat 100X abertura numérica / NA = 1,46 (TIRF) objetiva.
      Nota: A maior 63X NA objectivo pode ser utilizado em vez do 100X.
   4. Monte a amostra no palco, e elevar ªe objetivo em direção à amostra.
   5. Monitorar a posição da lente usando a função XYZ da estação de ancoragem. Pare quando a lente está no estádio de foco (por exemplo, z ~ 2,50 milímetros).
   6. Totalmente fechar os painéis de acesso.
      Nota: Para ativar a segurança do laser.
   7. Afinar o foco usando as oculares e os botões na guia localizar.
      Nota: A guia localizar fornece acesso aos botões que produzem iluminação baseados em lâmpada de arco e facilita a observação direta da amostra com as oculares. Da mesma forma, a guia aquisição fornece acesso a ferramentas que produzem iluminação a laser e facilita a captura da imagem pela câmera.
      1. Vá até a aba localizar, escolha "Trans On".
      2. Clique no símbolo de expansão ocular.
         Nota: Isso traz um esquema do caminho da luz. Atributos do caminho da luz pode ser alterada clicando esquerda ícones apropriados no esquema ou usando a tela sensível ao toque na docking station. Por exemplo, um filtroapropriada para visualização de emissão de Dendra2 pode ser escolhido usando o ícone refletor revólver.
      3. Olhe pelas oculares, e trazer as células para o foco usando a estação de ancoragem como um guia.
         Nota: A amostra será muito pouco povoada com células fluorescentes porque neurônios do hipocampo são difíceis de transfecção, e, portanto, pode ser um pouco complicado de se concentrar com uma iluminação refletida. Se este for o caso, usam iluminação transmitida e a leitura Z da estação de base como um guia.
      4. Alterne a luz "Off" depois de focar.
3. Identificar uma célula que é bastante brilhante, apresenta ponteada fluorescência, e tem uma morfologia clássico que é indicativo de uma boa saúde.
   1. Escolha a luz refletida eo filtro apropriado para a visualização de emissão verde Dendra2.
   2. Digitalize a lamínula para células expressando quimeras Dendra2 utilizando luz baixa excitação intensidade.
4. Mude para o ACQguia uisition.
   1. Use o "gerente experimento" para carregar uma configuração de aquisição PALM que adequadamente concebido ou modificado facilmente.
      Nota: Se tais experiências não existir, criar uma configuração experimental começar usando as seguintes configurações como um guia: sliders potência do laser: 405 nm (~ 0,01% para um laser mW 50); 488 nm (~ 3% de um laser de 100 mW); 561 nm (~ 40%, para um laser de 100 mW); Tempo de exposição: ~ 50 ms; Ganho Camera: ~ 200; Aquisição Multidimensional: séries temporais (ciclos = 30.000, interval = 0); Faixas: 488 nm com epi-iluminação, e 561 nm com iluminação baseada em TIRF (veja o passo 2.5.1); Objetivo: 100X (NA = 1,46); Deslizante ângulo TIRF: ângulo de incidência ~ 67-72 °; O tamanho do pixel: 100 nm; Campo de visão: TIRF (as escolhas alternativas produzir intensidades superiores a laser e são utilizados para fluoróforos que são mais difíceis de lixívia).
   2. Clique em "sim" quando um menu pop-up aparece com uma consulta sobre a mudança em lasers.
5. Traga a imagemda célula para o foco no plano da câmara.
   1. Escolha a 488 nm epi-iluminação pista laser.
      Nota: As faixas são configurações de feixe utilizados durante o exame. Aqui, os nomes das faixas são determinadas pelo comprimento de onda de excitação que produz a emissão que é passado para a câmara. Por exemplo, a faixa de 561 nm usa tanto o 405 e 561 linhas de laser nm, mas o cubo de filtro passa apenas emissão de photoconverted Dendra2 animado com 561 nm de luz para a câmera.
   2. Foque a imagem da célula na câmara usando o botão de aquisição "contínuo".
6. Coletar uma imagem de campo amplo convencional.
   1. Use o botão "Ajustar".
   2. Salve a imagem, indo para o menu "Arquivo" e escolha "Salvar / Salvar como."
7. Configure a iluminação à base de TIRF.
   1. Escolha a faixa de 488 e mudar para "TIRF" utilizando o botão EPI / TIRF.
   2. Escolha aquisição "contínuo".
   3. Ajuste tele TIRF baseada iluminação slider.
      Nota: TIRF é conseguido quando existe um escurecimento súbita de fundo E a amostra pode ser focada num plano ^18. Se novas características tornam-se aparentes através focando-se na amostra, o ângulo de incidência é muito baixa, porque em TIRF existe apenas um plano de foco.
   4. Duplo verificar o ângulo TIRF usando a faixa 561 com o laser de 405 nm "off".
   5. Ligue o laser de 405 nm de volta "on" antes de iniciar um experimento PALM.
8. Coletar dados de palma.
   1. Hit "start experimento."
      Nota: Se desejar, abra a aba "opções de processamento on-line" e marque "PALM linha de processamento" e "Fit Gauss2D" (antes do início do experimento) para monitorar a imagem PALM reconstruído durante a coleta de dados brutos. Isto irá facilitar a avaliação da qualidade dos dados e, consequentemente, o valor de continuar o processo de recolha de dados relativamente demorada.
   2. Visualmentemonitorar fotoconversão.
   3. Aumente a intensidade do laser de 405 nm (photoconverting) quando diminui fotoconversão Dendra2 (normalmente após a aquisição de ~ 10.000 imagens RAW).
   4. Continue o experimento se fotoconversão aumenta. Caso contrário, parar o experimento (sem perda de dados) clicando no botão "stop" atual etapa.
   5. Salve as imagens quando a coleta de dados seja concluída (após ~ 15 min).

3. Processamento de Imagem, Exibição e Análise

1. Na ausência de tratamento, processar imagens RAW online que foram salvos em disco.
   1. Clique na aba processamento, abra a guia método, e selecione "PALM".
   2. Escolha "PALM" novamente a partir dos quatro sub-opções.
   3. Vá para o menu arquivo, abrir e visualizar o arquivo de interesse, e clique em "selecionar".
   4. Hit "aplicar".
      Nota: Isto irá iniciar pico / constatação fluoróforo e pico localização com opti padrãoons. Se necessário, os picos também podem ser agrupados usando a guia "PAL-grupo". Agrupamento atribui picos que aparecem em várias estruturas consecutivas a uma única molécula, se as coordenadas de pico são suficientemente semelhantes. Além disso, os dados podem ser corrigidos para desvio de amostra usando opção de alinhamento deriva baseado no modelo do software.
2. Filtre componentes mal localizada e mal incluídos na amostra os dados localizados de pico.
   1. Descarte fluoróforos com precisões de localização, σ,> 35 nm usando a função "PAL-Filter".
   2. Descarte fluoróforos em áreas onde a distância média entre os picos, d, é muito grande para resolver vesículas de diâmetro, D.
      1. Extraia a precisão média de localização, σ, a partir do histograma de precisão de localização.
      2. Calcule o valor máximo aceitável para d baseado em σ, ea Criterion Shannon-Nyquist ^19, tal como consagrado na resolução aproximação ²⁰ R = D =[(2.35σ) ² + (2-D) ^{2] 1/2.}
      3. Definir o limite do "Remover discrepantes PALM" ferramenta para eliminar picos cercados por menos de πD ² / (4d ²⁾ vizinhos dentro de um círculo de raio D / 2.
   3. Converta os dados PALM transformado em uma imagem PALM usando a função "PAL-Rendering"; veja a Figura 1.
   4. Quantificar os tamanhos e separações, escolhendo a função "Perfil".
      1. Verifique a linha de associado e opções de tabela, e desenhar uma linha ao longo da direção desejada na imagem.
      2. Quantificar diâmetros, determinando medida da largura à meia máxima intensidade.
      3. Quantificar separações determinando pico-a-pico espaçamentos de perfis de intensidade.

Resultados

A Figura 1 mostra um produto final de imagem e processamento. Nesta imagem PALM, coordenadas laterais fluorophores localizados são mostrados usando o modo de exibição centróide, ea imagem de super-resolução da DCV associado é mostrado usando o modo de exibição de Gauss.

Figura 2A mostra widefield análogo e imagens palma da soma e processos proximais de oito dias em neurônio hipocampo vitro expressando tPA-Dendra2. Característica...

Discussão

PALM e técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução relacionados surgiram recentemente como um complemento valioso para as formas mais bem estabelecidos da microscopia óptica e microscopia eletrônica (EM) ^22-24. Atributos positivos da PALM incluem a preparação da amostra relativamente simples e mínima perturbação da amostra. Em princípio, PALM também pode ser usado para estudar as células vivas. Provavelmente, o principal atributo negativo da Palm é a aquisição de dados demorad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss PALM	Carl Zeiss, Inc.	Elyra PS.1	With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668-019
Minimum Essential Medium	Life Technologies	11095-080
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-8501
Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D	Fisher Scientific	NC0059095