神経高密度コア小胞の超解像イメージング

要約

我々は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）ベースの固定、培養神経細胞内の小胞の研究を実装する方法について説明します。我々のプロトコルの主要な構成要素は、photoconvertibleキメラで小胞を標識する超解像顕微鏡システムでまばらにサンプリングされた生の画像を収集し、超解像画像を生成するために生の画像を処理挙げられる。

要約

蛍光の検出は、現代の生物学的および医学的用途に使用多くの広く利用され、急速に進展顕微鏡技術の基盤を提供します。蛍光の強さは、その感度、特異性、およびライブイメージングとの互換性があります。残念ながら、蛍光顕微鏡の従来の形態は、約250ナノメートルよりも小さな寸法を有する構造の研究を妨げる撮像面における1つの主要な弱点、回折限界分解能、苦しむ。最近では、この制限は、このような光活性化局在化顕微鏡法（PALM）のような超解像蛍光顕微鏡技術の導入により克服された。その従来の対応とは異なり、Palmは数十ナノメートルの横方向の解像度を有する画像を生成することができる。それは、細胞の構造と組織の以前にアクセス不能な属性のスペクトルを解明するために、その無数の強みと、蛍光を使用するようになりましたが可能である。 _content ">残念ながら、Palmは、実装が簡単ではありません、そして成功した戦略は、多くの場合、研究対象のシステムのタイプに合わせて調整する必要があります。この記事では、我々は固定、培養神経細胞内小胞構造の単色ヤシの研究を実装する方法を示しています。 PALMは、理想的には50〜250ナノメートル〜から。我々のアプローチにおける重要なステップが含ま通常、ある範囲の寸法を有し、小胞の研究に適しているとまばらにサンプリングされたRAW画像を集め、photoconvertible（赤と緑）小胞の貨物のキメラで神経細胞を標識し超解像顕微鏡システム、及び高解像度のPALM画像を生成する生の画像を処理する。また反論培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞（DCVS）の非常に良好に解像画像を提示することによって、我々のアプローチの有効性を実証DCVSのシナプス人身売買は、DCVクラスタで主に媒介されるという仮説。

概要

細胞プロセスの数は、特定の細胞内の宛先への生体分子の正確で効率的な小胞が介在する人身売買に依存しています。一顕著な例は、神経細胞体における生物発生の現場から、潜在的に遠位の前と後シナプスのサイト¹へのシナプスの構成成分の長期であった、小胞を介した送達に先行されるシナプスアセンブリである。

蛍光顕微鏡は、小胞輸送を研究する強力かつ一般的な方法です。技術の強みは、感度、特異性、およびライブイメージング²との互換性があります。残念ながら、比較的最近まで、技術は〜250ナノメートルより小さい寸法の構造の研究を妨げる一つの大きな弱点、回折限界分解能^2、苦しんでいる。近年、蛍光顕微鏡の横解像度は、超解像蛍光マイルの導入により回折限界を超えパーム³などcroscopy技術。手のひらの横方向の解像度が、数十ナノメートルは、通常、50〜250ナノメートル^〜4の範囲に寸法を有する小胞の研究に最適です。これは、特定の細胞内のサイトへの人身売買のいくつかの側面を含む小胞の以前にアクセス不能な属性、のスペクトルを解明するために、その無数の強みと、蛍光を使用するようになりましたが可能である。

Palmは実装するのは簡単ではなく、成功した戦略は、多くの場合、研究対象のシステムのタイプに合わせて調整する必要があります。ここでは、小胞構造の掌の研究を実装する方法を説明し、私たちは海馬ニューロンにおけるDCVS例のための我々のアプローチの有効性を示す。特に、我々は、海馬ニューロンにおけるシナプスへのDCVSの人身売買は、DCVクラスタ^5-8によって媒介されるという仮説に対応するために手のひらを使用しています。

Nの開発にシナプス小胞へのクラスタ媒介人身売買euronsそれは急速なシナプスの安定化およびアセンブリ^9,10を容易にすることができるので、魅力的な可能性である。 DCVSのクラスタ化された人身売買の支持者は、クラスタリング^6を支持する証拠として、外因性のDCV貨物を保有シナプス外蛍光涙の大見かけの大きさを挙げている。しかしながら、これらの斑点は、クラスタリングから生じるものからの回折に起因する特徴的なサイズ効果に適していない回折限界の蛍光顕微鏡技術を用いて生成された画像に現れる。

この問題を解決するために、我々は、従来の広視野蛍光とDCVSを対象とキメラを表現する海馬ニューロンの手のひらの画像を収集した。これらの画像の解析は、従来の画像中の推定シナプス外のDCVクラスターの> 92パーセントが80 nmのPALM画像内の（個々のDCVサイズ^）11涙点として解決されることを明らかにした。 hippoca開発にDCVSに適用されるしたがって、これらのデータは、大部分のクラスタリング仮説を無効MPALニューロン。

プロトコル

1。サンプルの調製

1. 標準的な分子生物学的技術を用いて、DCVSに標的photoconvertible又は光活性化キメラをコードするDNAを調製する。
   注意：一つの可能​​性は、組織プラスミノーゲン活性化因子-Dendra2キメラ因子（tPA-Dendra2）をコードするDNAである。 Dendra2紫外光¹²に曝露されると緑色から赤色の発光に切り替えるphotoconvertibleタンパク質である。
2. 高性能＃1.5カバーの培養海馬ニューロンは、標準的なプロトコル¹³以下、〜5-10日のためにスリップ。
3. カチオン性脂質試薬を用いて海馬ニューロンを現像トランスフェ。
   注意：ウイルス媒介感染は、成熟した神経細胞のためのより効果的である。この代替アプローチは、他の箇所¹⁴で詳細に記載されている。
   1. 〜1μgのDNAおよび最小必須培地（MEM）とカチオン性脂質試薬の4μLと250μLを含む第二の1.5mlチューブを250μlを含む1.5 mlチューブを準備しますMEMの。
   2. 5分のためのソリューションをインキュベートする。
   3. 二つの溶液を混合し、さらに30分間、得られた混合物をインキュベートする。
   4. インキュベーション中、培地の数mlを含有する皿を37℃に温め調製
   5. 優しく温かい培地を含む皿に神経細胞を含むカバースリップを転送し、トランスフェクション混合物を追加します。
   6. そっとお皿を傾け、その後90分間37℃のインキュベーターに入れてください。
   7. 彼らの "ホームディッシュ」に神経細胞を戻し、〜12月18日時間を待つ。
4. 37℃に加温し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）中4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロース中で45分間細胞を固定
   注：PALM実験では、超微細構造の良好な保存を達成するために重要であり、免疫蛍光染色に使用される標準的なホルムアルデヒド固定プロトコルは、典型的には¹⁵不十分である。貧困層の構造的保存のための1つの重要な理由は、不十分であるFixation時間ホルムアルデヒド固定は、付加物形成およびタンパク質の架橋を伴い、後者のプロセスは非常に遅いので^、16である。 45分固定は、蛍光の検出可能なoverfixation誘発性の損失でこの問題を緩和するのに役立ちます。
5. 洗浄カバーをろ過し、PBSで〜10倍にスリップ。
   注意：これは蛍光汚染物質を低減します。サンプル画像は、比較的迅速に固定後。光を通さない容器内に濾過したPBS中で4℃、その間、店舗細胞。
6. 濾過したPBS中のチャンバー内のニューロンを含む、マウントカバースリップ。
   注：サンプルは、全内部反射蛍光（TIRF）ベースの照明を実現するために、ガラスの屈折率よりも低い屈折率を用いて、PBSのように、水性媒体中に取り付けなければならない。唯一のカバースリップ近位のフルオロフォアが励起され、バックグラウンドの蛍光¹⁷の大きな関連するドロップがあるので、TIRFベースの照明は非常に便利です。

2。画像取得

1. 超解像イメージングシステムの電源をオンにします。
   1. アークランプをオンにします。
   2. への（電源のリモートスイッチ上の）「システム/ PC」と「成分」のスイッチフリップ「ON」にしてください。
   3. （顕微鏡制御後のタブレット/ドッキングステーションが点灯）コンピュータの電源を入れます。
      注：ドッキングステーションは、光学系と光路の多くの属性、対物レンズと焦点特に選択を制御および監視するために使用することができる。
   4. ダブルソフトウェアのアイコンをクリックして、ログインダイアログの「システムの起動」オプションを選択します。
2. サンプルを調べます。
   1. レーザー安全キャビネットの前面と上部アクセスパネルを開きます。
   2. 舞台と目標をアクセスするために、透過光の腕を傾ける。
   3. アルファプランアポクロマート100X開口数/ NA = 1.46（TIRF）客観的に油を入れてください。
      注：63X高NA対物レンズは100Xの代わりに使用することができる。
   4. ステージにサンプルをマウントし、目を上げるサンプルに向けてE目標。
   5. ドッキングステーションのXYZ関数を用いてレンズ位置を監視する。レンズは、焦点の球場（ 例えば 、Z〜2.50ミリメートル）のときに停止します。
   6. 完全にアクセスパネルを閉じます。
      注意：レーザー安全に係合する。
   7. 微調整見つけるタブに接眼レンズとボタンを使用して焦点。
      注意：タブは、アーク灯ベース照明を作り出すのボタンへのアクセスを提供し、接眼レンズで試料を直接観察を容易に検索します。同様に、取得]タブには、レーザーベース照明を生産し、カメラによる画像取り込みを促進するツールにアクセスできます。
      1. 探しタブに移動し、選択した「トランスオン。」
      2. 眼のエキスパンション·シンボルをクリックします。
         注意：これは、光路の概略が表示されます。光パスの属性は、左図に適切なアイコンをクリックするか、ドッキングステーション上のタッチスクリーンを使用することによって変更することができる。例えば、フィルタDendra2からの発光を観察する場合に適切な反射器は、リボルバーアイコンを使用して選択することができる。
      3. 接眼レンズに見て、ガイドとして、ドッキングステーションを使用して焦点に細胞をもたらす。
         注：海馬神経細胞がトランスフェクトすることは困難であるため、サンプルでは、​​非常にまばらに蛍光細胞が設定されます、そして、それは、このように反射した照明を使用して焦点を合わせるために少し注意が必要です。この場合、ガイドとして透過照明とドッキングステーションのz読み取りを使用する。
      4. ピントを合わせたあと、「オフ」光を切り替える。
3. かなり明るい点状の蛍光を示し、良好な健康状態の指標である古典的な形態を有する細胞を特定します。
   1. 反射光とDendra2から緑色の発光を観察するためのフィルタの適切なを選択します。
   2. 低強度の励起光を用いてDendra2キメラを発現する細胞のカバースリップをスキャンする。
4. ACQに切り替えるuisitionタブ。
   1. 適切に設計されたか、簡単に修正されるPALM取得フィギュレーションをロードするために "実験マネージャ」を使用してください。
      注：そのような実験が存在しない場合には、ガイドとして次の設定を使用して起動実験的な構成を設計します。レーザーパワースライダー：405 nmの（50 mWのレーザー用〜0.01％）; 488 nmの（100 mWのレーザーのための〜10％）; 561 nmの（100 mWのレーザーのための〜40％）;露出時間：〜50ミリ秒;カメラゲイン：〜200;多次元買収：時系列（サイクル= 30,000間隔= 0）;トラック：落射照明と488 nmであり、TIRFベースの照明と561ナノメートル（ステップ2.5.1を参照のこと）;目的：100X（NA = 1.46）; TIRF角スライダー：入射角〜67-72°;ピクセルサイズ：100ナノメートル;視野：TIRF（代替選択肢は、より高いレーザー強度が得られるし、漂白するのがより困難である蛍光プローブのために使用されます）。
   2. ポップアップメニューがレーザーのスイッチを入れるの問い合わせと表示されたら「はい」をクリックしてください。
5. イメージを持って来るカメラ平面でのフォーカスへの細胞の。
   1. 488nmの落射照明レーザートラックを選択してください。
      注意：トラックは、撮像中に使用されるビームの構成です。ここで、トラック名、カメラに渡される発光を生成する励起波長によって決定される。例えば、561 nmのトラックは405と561 nmのレーザーラインの両方を使用しますが、フィルターキューブは、カメラへの561 nmの光で励起さphotoconverted Dendra2から発光のみを通過させる。
   2. 「連続」取得ボタンを使用してカメラの細胞の画像の焦点を合わせる。
6. 従来の広視野画像を収集しています。
   1. 「スナップ」ボタンを使用します。
   2. 「ファイル」メニューに移動し、選択して画像を保存」で保存/保存します。 "
7. TIRFベース照明をセットアップします。
   1. 488トラックを選択し、EPI / TIRFボタンを使用して、「全反射」に切り替えます。
   2. 「連続」の取得を選択します。
   3. Tを調整彼は、TIRFベース照明スライダー。
      注：TIRF背景の突然の黒ずみがある場合に達成されるAND検体がONE面¹⁸に集束することができる。新機能は、サン​​プルに分かれて集中を通じて明らかになる場合は、TIRFに焦点面を1面のみが存在するため、入射角が低すぎる。
   4. ダブル405 nmのレーザーで561トラックを使用した全反射角を確認して「オフ」
   5. PALM実験を開始する前に」の「背面405 nmのレーザーをオンにします。
8. PALMデータを収集。
   1. 「実験を開始します。「ヒット
      注：必要に応じて、「オンライン処理オプション」タブを開き、生のデータ収集中に再構成されたPALM画像を監視する（実験を開始する前に）「オンライン処理PALM」と「フィットGauss2D "をチェック。これは、データの品質および比較的時間のかかるデータ収集プロセスを継続従って価値の評価を容易にする。
   2. 視覚的に光変換を監視します。
   3. 405 nmの（通常は〜万RAW画像の取得後）（photoconverting）レーザーDendra2光変換減少するにつれての強度を高める。
   4. 光変換が増加した場合の実験を続ける。それ以外の場合は、「停止」、現在のステップボタンを押すことで（データの損失なし）の実験を停止します。
   5. データ収集が（〜15分後）が完了したときの画像を保存します。

3。画像処理、表示、および分析

1. オンライン処理がない場合には、RAW画像を処理するには、ディスクに保存されたこと。
   1. 、[処理]タブをクリックし、メソッドタブを開き、選択し、 "手のひらを。"
   2. 4サブオプションから再び「PALM」を選択します。
   3. オープンは、[ファイル]メニューに移動し、関心のあるファイルを表示し、ヒット "を選択します。"
   4. ヒット」が適用されます。 "
      注意：これは、デフォルトの最適ピーク/蛍光体の発見とピークのローカライズを開始しますアドオン。必要に応じて、ピークはまた、「PAL-グループ」タブを使用してグループ化することができます。グループ化は、ピーク座標が十分に類似している場合は、単一の分子に複数の連続した​​フレームに表示されたピークが割り当てられます。また、データは、ソフトウェアのモデルベースの​​ドリフト配置オプションを使用して、サンプルのドリフトを補正することができる。
2. ピークローカライズされたデータに難局在化し、不十分なサンプリングされたコンポーネントを除外する。
   1. ローカリゼーション精度で蛍光団を破棄、σ、>「PAL-FILTER」ツールを使用して35ナノメートル。
   2. ピーク間の平均距離の分野で蛍光団を破棄し、D、直径の小胞を解決するには大きすぎる、D.
      1. ローカリゼーション精度ヒストグラムから、σ、平均ローカライズ精度を抽出します。
      2. = D =σに基づいて、Dの最大許容値を計算し^、20 R解像度近似に具体化として、シャノン·ナイキストは^、19を criteron^{[（2.35σ）2} +（2d）の^{2] 1/2。}
      3. 半径D / 2の円内^πD2 /（4D ^2）近隣諸国よりも少ないに囲まれたピークを削除するには」PALMの外れ値を削除」ツールでしきい値を設定します。
   3. 「PAL-レンダリング」ツールを使用してPALM画像に加工PALMデータを変換する; 図1を参照してください。
   4. 「プロファイル」機能を選択することで、サイズと分離を定量化する。
      1. 関連する行とテーブルオプションをチェックして、画像内の所望の方向に沿って線を引きます。
      2. 最大半減の強度で完全な幅を決定することにより、直径を定量化する。
      3. 強度プロファイルのピーク·ツー·ピークの間隔を決定することによって分離を定量化する。

結果

図1は、撮像処理の一端生成物を示す。このPALM画像では、ローカライズされたフルオロフォアの横座標は、重心の表示モードを使用して示されており、関連したDCVの超解像は、ガウス表示モードを使用して示されている。

図2Aは、類似広視野およびTPA-Dendra2を表現体外海馬ニューロンにおける 8日間の相馬と近位プロセスの手のひら...

ディスカッション

PALMおよび関連する超解像蛍光顕微鏡技術は、最近、光学顕微鏡および電子顕微鏡^{（EM）22-24}の良好に確立された形態に貴重な補体として浮上している。手のひらの正の属性は、比較的単純なサンプル調製と最小限のサンプル摂動が含まれています。原理的には、PALMはまた、生きた細胞を研究するために使用することができる。おそらく、PALMの主負属性が有意に生細胞におけるより高...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss PALM	Carl Zeiss, Inc.	Elyra PS.1	With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Life Technologies	11668-019
Minimum Essential Medium	Life Technologies	11095-080
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010049
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-8501
Growth Glass Coverslips 18 mm 1.5D	Fisher Scientific	NC0059095