Murino heterotópico Corazón Trasplante Técnica

Resumen

El manuscrito describe los pasos necesarios para llevar a cabo el trasplante cardíaco heterotópico en el ratón.

Resumen

Ahora es de más de cuarenta años desde que esta técnica fue reportada primero por Corry, Wynn y Russell. Aunque tomó algunos años para otros laboratorios para ser competentes en y utilizan esta técnica, ahora es ampliamente utilizado por muchos laboratorios de todo el mundo. Un refinamiento importante a la técnica original fue desarrollado y reportado en 2001 por Niimi. Se describen aquí son las técnicas que se han desarrollado durante más de una década en manos de tres cirujanos (Plenter, Grazia, Pietra) en nuestro centro. Estas técnicas están siendo transmitidos a una generación más joven de cirujanos e investigadores.

Basado en gran parte en la experiencia Niimi, los procedimientos utilizados han evolucionado en los pequeños detalles - detalles que haremos todo lo posible para relacionar aquí de una manera tal que otros pueden ser capaces de utilizar este modelo de gran utilidad. Como Niimi, hemos encontrado que una ayuda de video para el aprendizaje es un recurso de valor incalculable para el principiante.

Introducción

En una era en la que es posible realizar trasplantes de riñón, pulmón, hígado y páncreas en ratones, la piedra angular de un trasplante de órgano la investigación básica y la inmunología desde 1973 ^1-4 sigue siendo el modelo de trasplante heterotópico de corazón en el ratón. En los años transcurridos varios trabajos se han publicado detalles de mejoras / mejoras ^{de 5,6} a este procedimiento.

Como modelo de trasplante de órganos sólidos principalmente vascularizado este procedimiento es insuperable. Una vez dominado este procedimiento se presta a la investigación de respuestas de rechazo alogénico ^7, el desarrollo de vasculopatías crónicas ⁸ y los mecanismos de la lesión de isquemia-reperfusión ^9.

Las claves para el aprendizaje con éxito este procedimiento son como cualquier otra cirugía, la paciencia por parte del instructor y el alumno y la atención al detalle. Al comienzo del proceso de la nueva cirujano encontrará que Tbueno pasará muchas horas en cada trasplante. Medida que se adquiere experiencia, los tiempos quirúrgicos, y por lo tanto de isquemia, se reducirá drásticamente. Prestar atención a los detalles de cada paso, tarde o temprano llevará al éxito.

Mientras que el instructor puede hacer su mejor esfuerzo para transmitir, y para anticipar, todas las posibles caídas del hoyo que se pueden encontrar durante estas cirugías, el aprendiz "creativo" es probable encontrar algunos de los suyos!

Los fundamentos del procedimiento son los siguientes. El donante ascendente arco aórtico es de extremo a lado anastomosa a la aorta abdominal receptor y la arteria pulmonar del donante es de extremo a lado anastomosada al destinatario abdominal de la vena cava inferior (VCI). La sangre fluye desde la aorta destinatario en forma retrógrada a través de la aorta del donante a las arterias coronarias. Una vez que la sangre ha pasado a través del sistema coronario que drena en la aurícula derecha a través del seno coronario, se bombea hacia el ventrículo derecho ya continuación, a través de la arteria pulmonar en el receptor IVC. De esta manera el sistema coronario se suministra la sangre arterial y el ritmo sinusal devuelve al injerto dentro de 1-2 min de reperfusión. Desde las cámaras izquierdas del corazón son la presión esencialmente bajo-cargado la pared libre del ventrículo izquierdo se atrofia con el tiempo.

Protocolo

Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en la Universidad de Colorado Barbara Davis Center Animalario en proceso de aprobación del IACUC y atendidos de acuerdo a las directrices del NIH.

La profundidad de la anestesia es juzgado por los pies pizca inicialmente y por la observancia de la tasa de respiración una vez iniciado el procedimiento.

1. Donante del corazón de la cosecha

1. Se anestesia el ratón donante mediante la inyección de pentobarbital (60 mg / kg IP).
2. Inmovilizar el ratón por 4 vías restricciones y clip de la piel. Limpie la piel con alcohol.
3. Después de la disección de distancia de la piel, abrir la cavidad abdominal haciendo una incisión transversal justo por debajo del diafragma.
4. Cortar la parte posterior del diafragma de la inserción costal y levantar la pared anterior del tórax anterior y superiormente exponer el corazón.
5. Extender un espesor total cortado posterior de la cavidad torácica lateral en los lados izquierdo y derecho del pecho.
6. Aislar elvena cava inferior (VCI) y coloque un flojo 5-0 sutura de seda alrededor de la vena cava inferior adyacente a su inserción en la aurícula derecha.
7. Inyectar 1,0 cc de solución salina 4 ° C heparinizada (200 U / cc) en la vena cava inferior, entonces ligar el vaso con la sutura de seda 5-0 y se dividen.
8. Aislar la vena cava superior derecha (VCSD) de manera similar y se liga con sutura de seda 5-0 y se dividen.
9. Gire suavemente el corazón hacia el lado derecho de los animales y aislar la vena cava superior izquierda (VCSI), se liga con una sutura de seda 5-0 y dividir la exposición de la arteria pulmonar izquierda.
10. Asegure el corazón bajo una gasa húmeda, mientras que el timo es contundente disecado de la principal arteria pulmonar (AP) y la PA ramas izquierda y derecha y ascendiendo arco aórtico.
11. Blunt diseccionar el arco aórtico libre de los tejidos circundantes. Micro-tijeras se utilizan para dividir a la aorta proximal a la arteria braquial-cefálica derecha, es decir, no debe haber ramas entre el corazón y la divisiónpunto de la aorta.
12. Esta sección del arco aórtico forma el manguito arterial para el proceso de implante.
13. Reflejar el manguito aórtica inferiormente para exponer el tronco de la AP y las ramas izquierda y derecha de la AP.
14. Blunt diseccionar las ramas PA izquierda y derecha lejos de los tejidos que rodean la medida del corazón de lo posible. Esto permite una fácil disección del tronco de la AP de los tejidos circundantes.
15. Divida el tronco de la AP lo más distante posible, proximal sólo para su bifurcación. Esta sección de la arteria pulmonar forma el manguito venoso para el proceso de implante.
16. Coloque una sutura de seda 5-0 alrededor de la base del corazón y corbata. El corazón se corta entonces libre en la base, y se coloca en 4 ° C salina. Tiempo total de la cosecha es de aprox. 10-15 min.

2. Implante Corazón Técnica

1. Anestesiar los ratones receptores con pentobarbital (60 mg / kg dosis inicial IP, 25 mg / kg dosis suplementaria IP si es necesario).
2. Clip de la piel yinmovilizar el ratón por 4 vías restricciones y preparar la piel con povidona yodada y la caída de una manera estéril.
3. Haga una incisión abdominal vertical de 2 cm de la línea media y entrar en la cavidad abdominal.
4. Retraer el intestino superior y exteriorizado en el pecho. Mantenga envuelto en una gasa húmeda estéril (solución salina estéril) durante todo el caso.
5. Aislar la aorta abdominal y la vena cava inferior (VCI) por debajo de los vasos renales y colocar 4-0 lazos de algodón alrededor de la aorta y vena cava inferior superior, a continuación, inferior a la sitio de la anastomosis.
6. Identificar los vasos lumbares dentro del campo y se liga con sutura de nylon 10-0.
7. Nudo de los lazos de algodón, primero el inferior seguido por el superior. De esta manera un poco de sangre se retiene en la aorta haciendo más fácil la aortotomía.
8. Formar la aortotomía con una aguja 30 G para entrar en el lumen de la aorta. Extender la incisión con tijeras finas micro a una longitud de aproximadamente 2 mm. Esta incisión se realiza en línea recta a lo largo del tiempotudinal eje del recipiente.
9. Hacer fin a anastomosis lateral de la aorta del donante a la aorta destinatario de la siguiente manera. Coloque un nylon 10-0 estancia sutura puntada en la aorta del donante y para el ángulo inferior de la incisión en la aorta destinatario y corbata. Coloque una segunda nylon 10-0 frente a la primera en la aorta del donante y de la esquina superior de la incisión en la aorta abdominal y corbata.
10. Hacer una línea de sutura de superior a inferior en la pared lateral de la aorta y corbata contra la permanencia de la puntada colocado previamente. Asegúrese de llevar las intimas (superficie interior del vaso) juntos mientras cose. Entonces suturar el lado medial de un modo de funcionamiento y la corbata. La primera y la última puntada en cada lado debe colocarse lo más cerca de los puntos de sutura estancia lo más posible. Entonces tratar de tener 3 puntos espaciados uniformemente entre estos dos hacen un total de 5 puntos.
11. Hacer fin a anastomosis lateral de la arteria pulmonar del donante al receptor IVC de la siguiente manera. Puncture la VCI con una aguja de 30 G y extender la incisión durante aprox. 2 mm con tijeras finas micro. Esta incisión se hace en una línea recta a lo largo del eje longitudinal del buque.
12. Ate la arteria pulmonar del donante a la esquina inferior de la incisión en la vena cava inferior con nylon 10-0. Coloque una segunda nylon 10-0 frente a la primera en la arteria del donante y de la esquina superior de la incisión en la vena cava inferior y corbata.
13. Hacer una línea de sutura continua entre la arteria pulmonar y la vena cava inferior y corbata. La primera y la última puntada en cada lado debe colocarse lo más cerca de los puntos de sutura estancia lo más posible. Entonces tratar de tener 5 puntos espaciados uniformemente entre estos dos hacen un total de 7 puntos de sutura.
14. Suelte el flujo distal 4-0 algodón empate restablecer venosa.
15. Una vez que se ha observado la hemostasia de la anastomosis venosa proximal 4-0 lazo de algodón se afloja gradualmente y la anastomosis arterial observó para la hemostasia. Cuando ambas anastomosis son considerados seguros, quite la cotton vincula desde el ratón.
16. Devuelva el intestino en el abdomen. La pared abdominal se cerró en dos capas con sutura de seda 5-0 en una manera corriente.
17. Administre un bolo de 1,0 ml de, caliente la solución salina normal estéril en el abdomen, como la reanimación con líquidos en el cierre, y 0,8 ml de solución salina normal se inyecta por vía subcutánea después de la operación. No se requieren otras medidas de apoyo durante la cirugía. Recuperar el animal sobre una manta térmica. Tiempo de implante total es de aprox. 90-120 min para principiantes, 45-60 min con experiencia. Administrar la analgesia con buprenorfina, 0,05 mg / kg, SC, 0,1 hasta 0,2 ml al inicio del procedimiento y cada 6-12 horas durante 72 horas después de la operación.

3. Evaluación de injerto

1. Evaluar la función del injerto a diario por la palpación trans-abdominal.
2. Mantenga el ratón como si se diera una inyección intraperitoneal.
3. Presione suavemente la punta de un dedo en contra de la pared abdominal y determinar la str palizaength y regularidad del injerto.
4. Dar calidad palpación una puntuación de 4 (amplitud y frecuencia normal) a 0 (no golpiza rechazó injerto).

NOTAS IMPORTANTES:

Todos los instrumentos son esterilizados, guantes estériles se usan durante todo el procedimiento y un campo estéril se mantiene. Las cirugías de donantes y receptores se llevan a cabo con el uso de un microscopio operativo. Asegúrese de que las anastomosis son "limpios". Es decir, que las paredes traseras no queden atrapados al colocar puntos de sutura. Esto hará que una constricción significativa fluya que será más que probable resultado en un injerto fallido y en casos extremos a la parálisis de las extremidades posteriores. También es de vital importancia que el espesor completo pasa incluyendo la adventicia vascular y la íntima de la aguja de sutura se consiguen. Evertion de los bordes también se asegura de que haya contacto-íntima a la íntima, que ayuda en el sellado y la cicatrización de las anastomosis. Otro hecho de vital importanciao es asegurarse de que la tensión de las líneas de sutura de la anastomosis también es óptima. Resultará demasiado flojo y no habrá fugas irreversible, demasiado apretado y estenosis a fluir. Si en el lado arterial esto se traducirá en una pobre perfusión del injerto, si en el lado venoso dará como resultado un corazón congestionado.

Resultados

La utilización de esta técnica quirúrgica se abre el camino para cualquiera de los estudios de supervivencia del injerto / rechazo simples, o protocolos experimentales bastante complejas. En el estudio se describe brevemente en la siguiente figura, hemos tratado de definir la participación, en su caso, de Fas y / o perforina como mecanismos de CD4 de células T mediada por el rechazo cardíaco. Esto fue posible gracias a la extraordinaria variedad de cepas de ratones que están disponibles hoy en día. Los resultados demuestran que el rechazo frontal de los aloinjertos cardiacos de las células T efectoras CD4 requiere la contribución alternativa del injerto de la expresión de Fas y T expresión de perforina celular. Hasta donde sabemos, esta es la primera demostración de que la actividad citolítica de las células T CD4 puede desempeñar un papel obligado para el rechazo agudo del aloinjerto primaria in vivo.

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. Figura 1 perforina y Fas Representa Obligatorios y Caminos Paralelos de CD4 T B6 mediada por células rechazo cardíaco, B6 PFPKO (perforina knock-out), y gld B6 (deficientes Fas-ligando) las células T CD4 se utilizaron para reconstituir trapo B6 ^{- / -} los destinatarios de C3H tipo salvaje o C3H Fas deficiente lpr aloinjertos cardíacos. La eliminación de solo Fas (♦, p = NS vs control de peso C3H + B6 células T CD4) de los corazones de donantes o extracción o perforina sola de las células T CD4 (■, p = NS vs control de peso C3H + B6 T CD4 células) no anulan el rechazo. Curiosamente, la eliminación de FasL a partir de las células T CD4 efectoras hizo rechazo de retardo significativamente (●, p <0,02 vs células WT C3H + B6 T CD4, p <0,01 vs células WT C3H + B6 PFPKO T CD4, y p <0,01 vs . C3H lpr + B6 células T CD4). Sin embargo, la mayoría de los aloinjertos seguían rechazaron (4 de 5). Cabe destacar que la eliminación simultánea del donante Fas y CD4 T perforina celularrechazo completamente abrogada (○, p <0,002 frente a control Wt C3H + B6 células T CD4, Peso C3H + B6 células PFPKO T CD4, y lpr C3H + B6 células T CD4). Esta abrogación fue significativamente más robusto que la eliminación individual de FasL de células T CD4 (○, p B6 células T CD4 de control 0.003 vs Peso C3H +). De Grazia et al ^10. Reproducido con permiso.

Discusión

Esta técnica quirúrgica no es fácil de dominar, pero una vez dominado es una poderosa herramienta de investigación. El investigador / cirujano se ve recompensado por la consistencia de la técnica y por la atención a los detalles. Paciencia durante la fase de aprendizaje es la clave. Según lo publicado por Niimi 3, con la ayuda de una herramienta de aprendizaje de vídeo basado toma un promedio de 11 intentos para lograr el primer procedimiento exitoso y 78 intentos de lograr una tasa de éxito del 90%. Videos se han convertido en una herramienta de enseñanza importante en la cirugía ^11,12.

Solución de problemas

Sangrado de las anastomosis se puede producir y esto es probablemente debido a la falta de cualquiera de tensión correcta en los puntos de sutura, o muy pocos puntos de sutura. Mientras que un agente inductor de la coagulación como Gelfoam puede ser útil para reducir las fugas, se recomienda que el cirujano debe contar con una buena técnica. Congestionado corazón no late es más común debido a la anastomosis que son demasiado apretados, sobre todo en el lado venoso. Un no-beatosng, injerto no perfundido es causada comúnmente por una burbuja de aire que ha viajado en una de las arterias coronarias. Es importante mantener un campo húmedo a húmedo para evitar la entrada de burbujas en los vasos.

Limitaciones de la Técnica

Esta técnica no es adecuada si un investigador desea investigar los efectos sobre un corazón en pleno funcionamiento. Eso requeriría una técnica de trasplante ortotópico, que hasta la fecha ha sido imposible de realizar.

Significativas en relación con los métodos existentes

Si se desea estudiar los efectos sobre un trasplante de órgano totalmente vascularizado, sólido en el ratón, entonces el modelo de corazón es probablemente la más sencilla de dominar. Existen modelos de ratón de cáncer de pulmón, el riñón y el trasplante de hígado, pero son mucho más difíciles de aprender y perfecto.

Los pasos críticos dentro del protocolo

Es de vital importancia que todo su espesor, pasnos incluyendo la adventicia vascular y la íntima de la aguja de sutura se consiguen. Evertion de los bordes también se asegura de que haya contacto-íntima a la íntima, que ayuda en el sellado y la cicatrización de las anastomosis. Otro factor muy importante es asegurarse de que la tensión de las líneas de sutura de la anastomosis también es óptima. Resultará demasiado flojo y no habrá fugas irreversible, demasiado apretado y estenosis a fluir. Si en el lado arterial esto se traducirá en una pobre perfusión del injerto, si en el lado venoso dará como resultado un corazón congestionado.

Por encima de todo, la repetición, la consistencia del procedimiento y la atención continua al detalle producirá grandes resultados y los datos que puedan ser financiados y publicables.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Straight micro-dissecting forcep #5	RS-5015	11295-51
Curved micro-dissecting forcep #7	RS-5047	11297-00
Curved serrated forcep	RS-5137	11052-10
Vannas micro-dissecting scissors, short	RS-5610		09.140.08
Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long		11.602.11
Micro spring handle needle holder			11.549.15
Straight mosquito forcep		91308-12
Micro-dissecting scissors, straight, blunt	RS-5962	14078-10
Micro-dissecting scissors, curved, blunt	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
Silk suture, 5/0, 22.5 m spool		18020-50
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 silk			E19A05N
Gloves		Biogel from Medex Supply
Drapes		Precept, #64-9012-9
Syringes		B-D 1 cc insulin, #329424
Cotton applicators		Fisher-brand, #23-400-100
Povidone-Iodine swabs		PDI, #B40600
4/0 Cotton ties			Domestic cotton autoclaved with instruments