טכניקת השתלות Murine Heterotopic לב

Summary

כתב היד מתארת ​​את הצעדים הנדרשים כדי לבצע את השתלת לב heterotopic בעכבר.

Abstract

עכשיו זה יותר מארבעים שנה מאז טכניקה זו דווחה לראשונה על ידי קורי, וין וראסל. למרות שזה לקח כמה שנים למעבדות אחרות כדי להיות מיומנים ובלנצל את הטכניקה הזאת, עכשיו זה בשימוש נרחב על ידי מעבדות רבות ברחבי העולם. עידון משמעותי לטכניקה המקורית שפותח ודווח ב2001 על ידי Niimi. שתוארו כאן הם הטכניקות שהתפתחו במשך יותר מעשור בידיהם של שלושה מנתחים (Plenter, גרציה, Pietra) במרכז שלנו. כעת טכניקות אלו מועברות על דור צעיר של מנתחים וחוקרים.

מבוסס במידה רבה על ניסיון Niimi, הנהלים המשמשים התפתחו בפרטים הקטנים - הפרטים שבו אנו נשתדל להתייחס כאן באופן כזה שאנשים אחרים יוכלו להשתמש במודל זה מאוד שימושי. כמו Niimi, מצאנו שוידאו סיוע ללמידה הוא משאב יקר ערך עבור המתחילים.

Introduction

בעידן שבו ניתן לבצע השתלות כליה, ריאות, כבד ולבלב בעכברים, אבן הפינה של השתלת איברים בסיסית ומחקר אימונולוגיה מאז 1973 ^1-4 נשאר המודל להשתלת לב heterotopic בעכבר. בשנים שחלפו כמה מאמרים שפורסמו מפרטים ^5,6 שיפורים / חידודים להליך זה.

כמודל של השתלה בעיקר vascularized איברים מוצקים הליך זה הוא ראשון במעלה. שולט ברגע שהליך זה משאיל את עצמו למחקר לתגובות אלוגנאית דחיית ^7, הפיתוח של vasculopathies הכרוני ⁸ והמנגנונים של reperfusion איסכמיה פציעה ^9.

המפתחות ללמידת הליך זה בהצלחה הם בדיוק כמו כל ניתוח אחר, סבלנות מצד המאמן והמתאמן ותשומת הלב לפרטים. בתחילתו של התהליך למנתח החדש ימצא לא כיהיי יבלה שעות רבות בכל השתלה. הניסיון הוא צבר, פעמים כירורגית, ולכן איסכמיה, יהיו להפחית באופן דרסטי. שימת לב לפרטים של כל שלב ושלב במוקדם או במאוחר תוביל להצלחה.

בעוד שהמורה יכול לעשות כמיטב יכולתם כדי להעביר הלאה, ולצפות מראש, את כל הנפילות הבור אפשריות שעשויות להיות נתקלים במהלך ניתוחים אלה, החניך "יצירתי" סביר להניח שימצא כמה משלהם!

היסודות של ההליך הם כדלקמן. התורם עולה קשת אב העורקים הוא מקצה לצד anastomosed לאב העורקים בבטן הנמען ועורק הריאה התורם הוא מקצה לצד anastomosed לוריד נמען הבטן הנחות הנבוב (IVC). דם זורם מאב עורקי הנמען בצורה מדרדר דרך אב עורקי התורם לעורקים הכליליים. ברגע שהדם זרם דרך המערכת כלילית הוא מנקז לתוך העלייה הימנית דרך הסינוס כלילית, נשאב לתוך החדר ממני ולאחר מכן דרך עורק הריאה לנמען IVC. בדרך זו המערכת כלילית מסופקת דם העורקי וקצב סינוס חוזר לשתל בתוך 1-2 דקות של reperfusion. מאז התאים השמאליים של הלב הם בעצם לחץ טעון מתחת לקיר החופשי של החדר השמאלי יהיה התנוון לאורך זמן.

Protocol

כל בעלי החיים ששוכנו בתנאי הפתוגן ללא באוניברסיטת מתקן בעלי החיים קולורדו ברברה מרכז דייוויס תחת אישור IACUC וטופלו על פי הנחיות NIH.

עומק ההרדמה נשפט על ידי קמצוץ הבוהן בתחילה ועל ידי שמירה על קצב נשימה ברגע שהחל את ההליך.

1. תורם לב קציר

1. להרדים את עכבר התורם על ידי הזרקת pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם IP).
2. לשתק את העכבר על ידי ריסון 4-way וקליפ הפרווה. לנגב את העור עם אלכוהול.
3. לאחר לנתח את העור, פותח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך רוחבי נחות רק לסרעפת.
4. חותכים את הסרעפת אחורית לכניסת costal והרם את בית החזה הקדמי anteriorly וsuperiorly חושף את הלב.
5. הרחב את עובי מלא לחתוך את חלל בית החזה לרוחב האחורי בצדדים ימני והשמאליים של החזה.
6. לבודד אתנחות וריד נבוב (IVC) ולמקם את תפר רופף 5-0 משי סביב IVC בסמוך לכניסתה לעלייה הימנית.
7. הזרק 1.0 סמ"ק של 4 ° C מלוחים heparinized (200 u / סמ"ק) לIVC, ולאחר מכן לקשור את הכלי עם תפר משי 5-0 ולהתחלק.
8. לבודד את הווריד הנבוב מעולה תקין (rSVC) באופן דומה ולקשור עם 5-0 תפר משי ולהתחלק.
9. בעדינות מגלגל את הלב לכיוון הצד הימני של החיות ולבודד את הווריד הנבוב מעולה השאיר (lSVC), ולקשור עם תפר משי 5-0 ולחלק חושף את עורק הריאה השמאלי.
10. אבטח את הלב תחת גזה רטובה תוך התימוס בוטה גזור מהעורק הראשי הריאתי (PA) והשמאל וסניפי הרשות הפלסטינית הנכונים ועולה קשת אב העורקים.
11. בוטה לנתח אב העורקים קשת החופשית של הרקמות הסובבות. מיקרו המספריים משמשים לחלק את הפרוקסימלי אב העורקים לעורק זרוע-cephalic תקין, כלומר לא צריכה להיות שום סניפים בין הלב והחלוקהנקודה של אב העורקים.
12. חלק זה של קשת אב העורקים מהווה את השרוול העורקי לתהליך השתל.
13. משקף את שרוול אב העורקים inferiorly לחשוף את תא המטען של הרשות הפלסטינית וסניפי ימין ועל השמאל ברשות הפלסטינית.
14. בוטה לנתח סניפי הרשות הפלסטינית ימין ועל שמאל מהרקמות הסובבות כרחוקה מלב ככל האפשר. זה מאפשר לנתיחה קלה של תא המטען של הרשות הפלסטינית מרקמות הסובבות.
15. מחלקים את תא המטען של הרשות הפלסטינית כdistally כהפרוקסימלי אפשרי, רק כדי הסתעפותה. חלק זה של עורק הריאה מהווה את השרוול ורידית לתהליך השתל.
16. הנח תפר משי 5-0 סביב הבסיס של הלב והעניבה. הלב לאחר מכן לחתוך חופשי בבסיס, והניח ב4 מלוח מעלות צלזיוס. זמן קציר כולל הוא כ. 10-15 דקות.

2. טכניקה שתל לב

1. להרדים את עכברי נמען עם pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם מינון ראשוני ה-IP, אם נדרש 25 מ"ג / קילוגרם המינון משלים IP).
2. קליפ הפרווה ולשתק את העכבר על ידי ריסון 4 כיוונים ומכין את העור עם povidone-יוד ולעטוף בצורה סטרילית.
3. לעשות חתך בבטן קו האמצע אנכי 2 סנטימטר ולהיכנס לחלל הבטן.
4. לחזור בי המעי superiorly ומוחצן על החזה. שמור עטוף בגזה סטרילית לחה (תמיסת מלח סטרילית) לאורך כל המקרה.
5. לבודד את אב העורקים בבטן ונחות וריד נבוב (IVC) מתחת לכלי הכליות ומקום 4-0 קשרי כותנה סביב אב העורקים וIVC מעולה אז נחותים לאתר ההשקה.
6. לזהות כל כלי המותני בתחום ולקשור עם 10-0 תפר ניילון.
7. קשר קשרי הכותנה, ראשון ואחרי נחותים על ידי מעולה. בדרך זו קצת דם נשמרים באב העורקים עושים aortotomy קל יותר.
8. טופס aortotomy עם מחט 30 G כדי להיכנס ללומן של אב העורקים. להאריך את החתך עם מספריים מיקרו קנס באורך של כ -2 מ"מ. חתך זה הוא עשה בקו ישר לאורך זמן רבציר itudinal של כלי השיט.
9. הפוך קץ להשקת צד של אב העורקים התורם לאב העורקים הנמען באופנה הבאה. הנח תפר שהות תפר 10-0 ניילון באב העורקים ותורם לזווית הנחותה של החתך באב העורקים הנמען והעניבה. מניחים ניילון 10-0 שני מול הראשון באב העורקים התורמים והפינה מעולה של החתך באב העורקים ובעניבה בבטן.
10. הפוך קו תפר פועל ממעולה לנחות בקיר לרוחב של אב העורקים ולקשור נגד תפר השהות הניח בעבר. הקפד להביא intimas (משטח כלי פנימי) יחד כמו שאתה תופר. אז תפר את הצד המדיאלי באופנת ריצה ובעניבה. התפר הראשון ואחרון בכל צד צריך להיות ממוקם קרוב לתפרי השהות ככל האפשר. אז שואף להיות 3 תפרים במרווחים שווים בין שני אלה עושים בסך הכל 5 תפרים.
11. הפוך קץ להשקת צד של עורק הריאה התורם למקבל IVC באופנה הבאה. Punctיור IVC עם מחט G 30 ולהרחיב את החתך עבור כ. 2 מ"מ עם מספריים מיקרו בסדר. חתך זה הוא עשה בקו ישר לאורך ציר האורך של כלי השיט.
12. לקשור את עורק הריאה התורם לפינה הנחות של החתך בIVC עם 10-0 ניילון. מניחים ניילון 10-0 שני מול הראשון בעורק התורם והפינה מעולה של החתך בIVC והעניבה.
13. הפוך קו תפר פועל בין עורק הריאה וIVC ועניבה. התפר הראשון ואחרון בכל צד צריך להיות ממוקם קרוב לתפרי השהות ככל האפשר. אז שואף להיות 5 תפרים במרווחים שווים בין שני אלה עושים בסך הכל 7 תפרים.
14. שחרר את זרימת דיסטלי 4-0 הכותנה העניבה מחדש הקמת ורידים.
15. ברגע עצירת דימום של ההשקה הוורידים נצפתה עניבת הכותנה הפרוקסימלי 4-0 הוא התיר בהדרגה וההשקה העורק נצפתה לעצירת דימום. כאשר שני anastomoses נחשב מאובטח, להסיר את גotton קושר מהעכבר.
16. להחזיר את המעי בבטן. דופן הבטן סגורה בשתי שכבות באמצעות 5-0 תפר משי באופנת ריצה.
17. לנהל בולוס 1.0 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית, חמה נורמלית לתוך הבטן כהחייאת נוזלים במועד הסגירה, ו0.8 מיליליטר של תמיסת מלח רגילה מוזרק מתחת לעור לאחר ניתוח. אין צעדים תומכים נוספים נדרשים במהלך הניתוח. לשחזר את החיה על שמיכה מחממת. זמן שתל כולל הוא כ. 90-120 דקות למתחילים, דקות 45-60 עם ניסיון. לנהל שיכוך כאבים עצירות, 0.05 מ"ג / קילוגרם, SC, 0.1-0.2 מיליליטר בתחילת ההליך ובכל שעה 6-12 ל72 מנותחות שעה.

3. הערכת שתל

1. הערכת תפקוד שתל מדי יום על ידי מישוש טרנס בטן.
2. החזק את העכבר כאילו היו שיש לתת זריקת intraperitoneal.
3. לחץ בעדינות את קצה אצבע על קיר הבטן ולברר את str המכותength וסדירות של השתל.
4. תן איכות מישוש ציון מ4 (משרעת ותדירות נורמליות) ל -0 (לא מכות דחו שתל).

הערות חשובות:

כל המכשירים הם מעוקרים, כפפות סטריליות שחוקות לאורך כל ההליך, והוא שמר על שדה סטרילי. הניתוחים התורמים והמקבל מבוצעים תוך השימוש במיקרוסקופ הפעלה. ודא שanastomoses הם "נקי". כלומר, שיחזור קירותיו לא נתפסו בעת ביצוע תפרים. זה יגרום להתכווצות משמעותית לזרום שתגרום יותר סביר בשתל נכשל, ובמקרים קיצוניים לאחורית גפי שיתוק. כמו כן, חשוב וחיוני שעובי מלא עובר כולל adventitia כלי הדם ואינטימה של מחט תפר מושגות. Evertion של הקצוות גם מבטיח כי יש קשר אינטימה לאינטימה, אשר מסייע באיטום וריפוי של anastomoses. עוד עובדה חשובה וחיוניאו הוא להבטיח כי המתח של קווי תפר בהשקה הוא גם אופטימלי. רפוי מדי ולא תהיה דליפה בלתי הפיכה, הדוק מדי וצרות לזרום יגרמו. אם בצד העורקים זה יביא זלוף הלקוי של השתל, אם בצד ורידי לב צפוף יגרום.

תוצאות

הניצול של טכניקה ניתוחית זו פותח את הדרך לשני מחקרים פשוטים הישרדות שתל / דחייה, או פרוטוקולי ניסוי מורכבים למדי. במחקר המתואר בקצרה בתרשים שלהלן, בקשנו להגדיר את המעורבות, אם בכלל, של פאס ו / או perforin כמנגנונים של דחיית תאי T מסוג CD4 בתיווך לב. זה התאפשר על ידי המערך יוצא דופן של זני עכבר הזמינים כיום. תוצאות מראות כי הדחייה הישירה של allografts לב על ידי תאי T מסוג CD4 מפעיל דורשת תרומה החלופית של שתל ביטוי פאס וביטוי perforin תא T. למיטב ידיעתנו, זו ההפגנה הראשונה שפעילות cytolytic על ידי תאי T מסוג CD4 יכולה לשחק תפקיד מחייב לדחיית שתל חריפה העיקרית בגוף חי.

"/> 1.jpg
. איור 1 Perforin ופאס לייצג מחייב ומסלולים מקבילים של B6 T מסוג CD4 תא בתיווך דחיית לב, B6 PFPKO (perforin עקום החוצה), וGLD B6 תאים (לקויים פאס ליגנד) T מסוג CD4 נוצלו כדי לשקם סמרטוט B6 ^{- / -} מקבלי סוג C3H בר או C3H פאס הלקוי LPR allografts לב. הסרת פאס לבד (♦, p = NS לעומת שליטת Wt C3H + B6 תאי T מסוג CD4) מלב התורם או ההסרה או perforin לבד מתאי T מסוג CD4 (■, p = NS לעומת שליטת Wt C3H + B6 T מסוג CD4 תאים) לא בטלו דחייה. מעניין לציין, כי הסרת FasL ממפעיל תאי T מסוג CD4 עשתה דחיית עיכוב משמעותית (● p <0.02 לעומת תאי Wt C3H + B6 T מסוג CD4, p <0.01 לעומת תאי Wt C3H + B6 PFPKO T מסוג CD4, וp <0.01 לעומת . LPR C3H + B6 תאי T מסוג CD4). עם זאת, רוב allografts עדיין דחה (4 מתוך 5). באופן משמעותי, להסרת בו זמנית של שני perforin התא התורם פאס וT מסוג CD4דחייה בטלה לחלוטין (○, p <0.002 לעומת שליטת Wt C3H + B6 + תאי T מסוג CD4 +, B6 תאי T מסוג CD4 PFPKO, וLPR C3H Wt C3H B6 תאי T מסוג CD4). ביטול זה היה באופן משמעותי חזק יותר מההסרה בודדת של FasL תא T מסוג CD4 (○, p <שליטה 0.003 לעומת C3H Wt + GLD B6 תאי T מסוג CD4). מגרציה ואח' ^10. הודפס מחדש באישור.

Discussion

טכניקה ניתוחית זו אינה קלה לשלוט, אבל ברגע שמשתלט עליו היא כלי מחקר רב עצמה. החוקר / המנתח מתוגמל על ידי עקביות של טכניקה ועל ידי תשומת לב לפרטים. הסבלנות במהלך שלב הלמידה היא מפתח. כפי שפורסם על ידי Niimi 3, בסיועם של כלי למידה מבוססת וידאו זה לוקח בממוצע של 11 ניסיונות להשגת ההליך המוצלח הראשון ו78 ניסיונות להשיג שיעור הצלחה 90%. וידאו הפכו לכלי חשוב בהוראת הניתוח ^11,12.

פתרון בעיות

דימום מanastomoses עלול להתרחש וזה כנראה עקב או חוסר המתח נכון בתפרים, או מעט מדי תפרים. בעוד קרישת גרימת סוכן כגון Gelfoam יכולה להיות שימושית לצמצום דליפות, אנו ממליצים שהמנתח צריך להסתמך על טכניקה טובה. לב אינו פועם צפוף הוא נפוץ ביותר עקב anastomoses כי הם הדוקים מדי, במיוחד בצד הוורידים. הלא beating, שתל אינו perfused נגרם בדרך כלל על ידי בועות אוויר שנסעה לאחד מהעורקים הכליליים. זה חשוב לשמור על שדה לח לרטוב, כדי למנוע את כניסתם של בועות לתוך כלי הדם.

מגבלות של הטכניקה

טכניקה זו אינה מתאימה אם חוקר רוצה לחקור השפעות על תפקוד לב באופן מלא. שיחייב טכניקת השתלת orthotopic, שעד כה הוכיחה את הבלתי אפשרית לביצוע.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

אם האדם רוצה לחקור את ההשפעות על השתלת vascularized באופן מלא, מוצקה איבר בעכבר, ולאחר מכן את מודל הלב הוא כנראה הפשוט ביותר כדי לשלוט. מודלים עכבר של ריאות, כליה והשתלה כבד אכן קיימים, אבל הם הרבה יותר קשים ללמוד ומושלמים.

שלבים קריטיים במסגרת הפרוטוקול

זה חשוב ביותר, כי עמ 'עובי מלאהתחת כולל adventitia כלי הדם ואינטימה של מחט תפר מושגות. Evertion של הקצוות גם מבטיח כי יש קשר אינטימה לאינטימה, אשר מסייע באיטום וריפוי של anastomoses. גורם חשוב וחיוני נוסף הוא להבטיח שהמתח של קווי תפר בהשקה הוא גם אופטימלי. רפוי מדי ולא תהיה דליפה בלתי הפיכה, הדוק מדי וצרות לזרום יגרמו. אם בצד העורקים זה יביא זלוף הלקוי של השתל, אם בצד ורידי לב צפוף יגרום.

מעל לכל, חזרה, עקביות של הליך ואת תשומת לב מתמדת לפרטים תניב תוצאות מצוינות ונתונים fundable ופרסום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Straight micro-dissecting forcep #5	RS-5015	11295-51
Curved micro-dissecting forcep #7	RS-5047	11297-00
Curved serrated forcep	RS-5137	11052-10
Vannas micro-dissecting scissors, short	RS-5610		09.140.08
Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long		11.602.11
Micro spring handle needle holder			11.549.15
Straight mosquito forcep		91308-12
Micro-dissecting scissors, straight, blunt	RS-5962	14078-10
Micro-dissecting scissors, curved, blunt	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
Silk suture, 5/0, 22.5 m spool		18020-50
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 silk			E19A05N
Gloves		Biogel from Medex Supply
Drapes		Precept, #64-9012-9
Syringes		B-D 1 cc insulin, #329424
Cotton applicators		Fisher-brand, #23-400-100
Povidone-Iodine swabs		PDI, #B40600
4/0 Cotton ties			Domestic cotton autoclaved with instruments