쥐 이소성 심장 이식 기술

요약

원고는 마우스에 이소성 심장 이식을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

초록

이 기술이 처음 코리, 윈 러셀에 의해보고 된 이후 지금은 40 년이다. 다른 실험실에서 능숙하게이 기술을 활용하는 것이 어떤 년이 소요되지만, 그것은 널리 전세계의 많은 실험실에서 사용됩니다. 독자적인 기술에 상당한 세련미가 개발 니 이미 2001 년에보고되었다. 우리 센터에있는 3 개의 외과 (Plenter, 그라 지아, 피에트라)의 손에 년 이상에 걸쳐 진화 한 기술이 여기에 설명. 이 기술은 현재 외과 의사와 연구자의 젊은 세대에 전달되고있다.

자세한 내용은 우리가 다른 사람들이 매우 유용한 모델을 사용할 수 있습니다 방식으로 여기에 관련하기 위해 노력할 것입니다 - 주로 니 이미 경험을 바탕으로, 사용 절차는 좋은 정보에 진화했습니다. 니 이미와 마찬가지로, 우리는 학습 비디오 지원은 초보자를위한 귀중한 자원 것으로 나타났습니다.

서문

이 생쥐의 신장, 폐, 간, 췌장 이식을 수행 할 수 있습니다 시대에, 1973 년 이후 기본 장기 이식 면역학 연구의 초석 ^1-4 마우스의 이소성 심장 이식 모델 남아있다. 개입 년 동안 여러 논문이 절차 개선 / 분류의 ^5,6 선발 발표되었다.

고체 장기 주로 혈관 이식의 모델로이 절차는 타의 추종을 불허합니다. 일단 마스터이 절차는 동종 거부 반응 ^7, 만성 vasculopathies ⁸ 허혈 재관류 손상 ^(9)의 메커니즘의 개발에 대한 연구 자체를 준다.

성공적으로이 과정을 학습 할 수있는 키는 다른 수술, 강사 및 세부 사항에 연수생과 관심의 부분에 인내 같습니다. 과정의 시작 부분에서 새로운 의사는 그 t를 찾을 수헤이 각각의 이식에 많은 시간을 보낼 것입니다. 경험을 얻었을 때, 수술 시간, 따라서 국소 빈혈은 크게 줄일 수 있습니다. 각 단계의 세부 사항에주의를 지불하는 것은 조만간 성공으로 이어질 것입니다.

강사가 전달하는 데 최선을 다 할 수 있고, 이러한 수술시 발생할 수있는 가능한 피트 폭포 모두를 예상 할 수 있지만, "창조적 인"연수생 가능성이 자신의 일부를 찾을 수 있습니다!

다음과 같이 절차의 기본입니다. 대동맥 궁을 상승 기증자는 엔드 - 투 - 사이드받는 사람 복부 대동맥과 기증자의 폐 동맥 문합입니다 엔드 - 투 - 사이드받는 사람 복부 하대 정맥 (IVC)에 문합. 혈액은 관상 동맥에 기증자의 대동맥을 통해 역행 방식으로받는 사람의 대동맥에서 흐른다. 혈액이 관상 정맥동 통해 우심방으로 빼낸 관상 시스템을 통해 유입되면, 우심실로 펌핑되며다음받는 사람 IVC에 폐동맥을 통해. 이러한 방법으로 관상 시스템은 동맥 혈액을 공급 및 동 율동은 재관류 1 ~ 2 분 이내에 이식을 반환합니다. 심장의 왼쪽 챔버에서로드 기본적으로 압력 때문에 왼쪽 심실 무료 벽은 시간이 지남에 위축됩니다.

프로토콜

모든 동물은 IACUC 승인 아래 콜로라도 바바라 데이비스 센터의 동물 시설의 대학에서 무균 조건 하에서 보관 및 NIH의 지침에 따라 마음에 든다고했다.

절차가 시작되면 마취의 깊이는 처음에 발가락 핀치에 의해 호흡 속도의 준수에 의해 판단된다.

1. 기증자 심장 수확

1. (60 ㎎ / ㎏ IP)을 펜토 바르 비탈을 주입하여 기증자 마우스를 마취.
2. 4 방향 감금하여 마우스를 고정화 및 모피 클립. 알코올로 피부를 닦아냅니다.
3. 피부를 멀리 해부 후 격막 횡 절개 단지 열등함으로써 복강을 열고.
4. 늑골 삽입에 다이어프램 후방을 차단하고 전방과 우량 마음을 노출 전방 흉벽을 들어 올립니다.
5. 가슴의 왼쪽과 오른쪽에있는 후방 측면 흉강을 잘라 전체 두께를 확장 할 수 있습니다.
6. 격리하대 정맥 (IVC)과 우심방으로의 삽입에 인접한 IVC 주변의 느슨한 5-0 실크 봉합사를 놓습니다.
7. IVC에 4 ° C 헤파린 식염수 (200 U / CC)의 1.0 CC를 주입 후 5-0 실크 봉합사와 분열과 혈관을 결찰.
8. 비슷한 방식으로 오른쪽 우수한 대정 맥 (rSVC)를 분리하고 5-0 실크 봉합사 및 분할로 결찰.
9. 부드럽게 동물의 오른쪽을 향해 마음을 굴러 왼쪽 우수한 대정 맥 (lSVC)를 분리, 5-0 실크 봉합사로 결찰 왼쪽 폐의 동맥을 노출 나눕니다.
10. 흉선은 거리의 주요 폐동맥 (PA)와 왼쪽과 오른쪽 PA 지점에서 해부 및 대동맥 궁을 상승 무디게하는 동안 젖은 거즈 아래에 마음을 고정합니다.
11. 주변 조직의 대동맥 궁 무료 해부 무딘. 마이크로 가위가 오른쪽 상완 - 두부 동맥 대동맥 근위부를 구분하는 데 사용되는, 즉 심장과 부문 사이에 지점이 없어야합니다대동맥의 포인트.
12. 대동맥이 섹션에서는 임플란트 처리를위한 동맥 커프를 형성한다.
13. PA 트렁크와 PA의 왼쪽과 오른쪽 지점을 노출 하방 대동맥 커프를 반영합니다.
14. 멀리 가능한 한 마음에서 주변 조직에서 왼쪽과 오른쪽 PA 지점을 해부하다 무딘. 이 주변 조직에서 PA 트렁크 쉽게 절개 할 수 있습니다.
15. 같은 원심의 분기점에 가능한 단지 근위와 PA 트렁크를 나눈다. 폐동맥의이 섹션에서는 임플란트 프로세스의 정맥 팔목을 형성한다.
16. 마음과 넥타이의 기지 주변 5-0 실크 봉합사를 놓습니다. 마음은 그 기본에서 무료로 절단하고, 4 ° C의 식염수에 배치됩니다. 총 수확 시간이 약입니다. 10 ~ 15 분.

2. 심장 임플란트 기술

1. 펜토 바르 비탈로받는 생쥐를 마취 (60 ㎎ / ㎏ IP 초기 용량 / kg IP 보충 량 25 ㎎을 필요한 경우).
2. 모피 클립과4 방향 감금하여 마우스를 무력화하고 멸균 방식으로 포비돈 - 요오드와 드레이프로 피부를 예비 학교.
3. 2cm의 중간 선 수직 복부 절개를 복강을 입력합니다.
4. 우량 창자를 집어 가슴에 구체화. 케이스를 통해 멸균 촉촉한 거즈 (멸균 식염수)에 싸서 보관하십시오.
5. 신장 혈관 아래의 복부 대동맥과 하대 정맥 (IVC)를 분리하고 4-0면 대동맥 주위 관계와 문 합부에 IVC 우수한 다음 열등을 배치합니다.
6. 필드 내의 허리 혈관을 확인하고 10-0 나일론 봉합사로 결찰.
7. 면 넥타이 매듭, 먼저 열등는 뛰어난 하였다. 이 방법으로 몇 가지 혈액 aortotomy 쉽게 만드는 대동맥에서 유지됩니다.
8. 대동맥의 루멘을 입력 30 G 바늘로 aortotomy를 형성한다. 대략 2 mm의 길이에 미세한 마이크로 가위로 절개를 확장합니다. 이 절개 긴 따라 직선으로 이루어진다용기의 itudinal 축.
9. 다음과 같은 방식으로받는 사람의 대동맥에 기증자의 대동맥 측 문합에 끝을 확인합니다. 기증자의 대동맥과받는 사람의 대동맥과 넥타이 절개의 떨어지는 각도에 10-0 나일론 봉합사 숙박 스티치를 놓습니다. 기증자의 대동맥과 복부 대동맥과 넥타이에 절개의 우수한 코너의 첫 번째 반대 제 10-0 나일론을 놓습니다.
10. 대동맥의 측면 벽에 뛰어난에서 열등에 실행 봉합 라인을 확인하고 이전에 배치 숙​​박 스티치에 넥타이. 당신이 스티치로 함께 intimas (내부 용기면)을 가지고해야합니다. 그런 다음 실행중인 패션과 넥타이 안쪽면을 봉합. 각 측의 처음과 마지막 스티치 가능한 숙박 바늘에 가깝게 배치한다. 그런 다음 5 바늘의 총을 만드는 두 가지 사이에 3 균등하게 스티치를하는 것을 목표로하고 있습니다.
11. 다음과 같은 방식으로받는 사람 IVC에 기증자의 폐 동맥 측 문합에 끝을 확인합니다. Punct우레 30 G 바늘 IVC와 약에 대한 절개를 확장 할 수 있습니다. 미세한 마이크로 가위로 2mm. 이 절개 용기의 종축을 따라 직선으로 이루어진다.
12. 10-0 나일론으로 IVC의 절개의 하부 모서리에 기증자의 폐 동맥을 묶어. 기증자의 동맥과 IVC와 넥타이 절개의 우수한 코너의 첫 번째 반대 제 10-0 나일론을 놓습니다.
13. 폐동맥과 IVC와 넥타이 사이의 실행 봉합 라인을 확인합니다. 각 측의 처음과 마지막 스티치 가능한 숙박 바늘에 가깝게 배치한다. 그런 다음 7 바늘의 총을 만드는 두 가지 사이에 5 균등하게 스티치를하는 것을 목표로하고 있습니다.
14. 원심 4-0면 넥타이 재 구축 정맥의 흐름을 놓습니다.
15. 정맥 문합의 지혈이 관찰되면 근위 4-0면 넥타이는 점차 느슨해 및 동맥 문합은 지혈에 관찰된다. 모두 문합이 안전한 것으로 간주되는 경우, C를 제거년 otton 마우스에서 넥타이.
16. 복부에 창자를 반환합니다. 복부 벽은 실행 방식 5-0 실크 봉합사를 사용하여 두 층으로 닫힙니다.
17. 폐쇄시 유체 인공 호흡으로 복부에 멸균, 따뜻한 생리 식염수 1.0 ml의 알약을 관리하고, 생리 식염수 0.8 ml의 수술 후 피하로 주입된다. 다른 지원 조치는 수술하는 동안 필요하지 않습니다. 온난화 담요에 동물을 복구 할 수 있습니다. 총 주입 시간이 약입니다. 초보자를위한 90 ~ 120 분, 경험이있는 45 ~ 60 분. 부 프레 노르 핀 진통제, 0.05 ㎎ / ㎏, SC, 프로 시저의 시작 부분에서 0.1 ~ 0.2 ㎖ 및 72 시간의 수술 후마다 6 ~ 12 시간을 관리 할 수​​ 있습니다.

3. 이식 평가

1. 트랜스 복부 촉진으로 매일 이식 기능을 평가합니다.
2. 이 복강 내 주사를 부여하는 것처럼 마우스를 누르고 있습니다.
3. 조심스럽게 복부 벽에 집게 손가락의 끝을 눌러 박동 STR를 확인이식의 ength 및 규칙.
4. 0으로 촉진 질 4의 점수 (표준 진폭과 주파수)를 제공 (비 박동는 이식 거부).

중요 사항 :

모든 악기는, 살균 멸균 장갑 절차 전반에 걸쳐 착용하고 멸균 필드가 유지됩니다. 도너 및받는 수술이 운영 현미경을 이용하여 수행된다. 문합은 "깨끗한"있는지 확인합니다. 즉, 바늘을 배치 할 때 다시 벽 적발되지 않습니다이다. 이것은 상당한 수축이 마비 사지에게 뒷다리에 실패한 이식 및 극단적 인 경우가 더 많은 것보다는 가능성이 결과를 흐르게됩니다. 또한, 전체 두께가 혈관 외막 및 봉합 바늘의 내막이 달성 등의 전달하는 매우 중요합니다. 가장자리의 Evertion는 밀봉 및 문합의 치유에 도움 내막 - 투 - 내막 연락이 있다는 것을 보장합니다. 또 다른 매우 중요한 사실또는 문 합부 봉합선의 긴장은 또한 최적의 것을 보장하는 것입니다. 너무 느슨하고 돌이킬 수없는 누수가있을 것입니다, 너무 꽉 흐름에 협착이 발생합니다. 정맥 측에 혼잡 한 마음이 발생할 경우 동맥 측이, 이식의 가난한 관류 될 것이다.

결과

이 수술 기법의 활용은 간단한 이식 생존 / 제거 연구, 또는 매우 복잡한 실험 프로토콜을 하나의 길을 엽니 다. 간단하게 아래 그림에서 설명하는 연구에서, 우리는 어떤 경우 공장 자동화 및 / 또는 CD4 T 세포 매개 심장 거부 메커니즘으로 퍼포으로, 참여를 정의하기 위해 노력했다. 이것은 현재 사용할 수있는 마우스 종자의 특별한 배열에 의해 가능하게되었다. 결과는 CD4 이펙터 T 세포에 의한 심장 동종 이식의 직접적인 거절 이식 공장 자동화 표현과 T 세포 퍼포 식의 대안 공헌을 요구하는 보여줍니다. 우리의 상식으로,이 CD4 T 세포에 의한 세포 용해 활성은 생체 내에서 기본 급성 이식 거부 반응에 대한 의무를 역할을 할 수있는 최초의 데모입니다.

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. 그림 1 퍼포 및 공장 자동화가 (공장 자동화 - 리간드 결핍) CD4 T 세포가 B6 걸레를 재구성하기 위해 사용 된 의무와 CD4 T 세포 매개 심장 거부 B6, B6 PFPKO (퍼포 노크 아웃), 그리고 B6의 GLD의 병렬 진학 담당자 ^{- / -} 심장 동종 이식 LPR C3H 야생형 또는 공장 자동화 결핍 C3H받는 사람. 혼자의 FA 제거 (♦, p = NS 제어 중량 C3H 대 + B6 CD4 T 세포) 기증자의 마음 또는 CD4 T 세포 (에서 제거 또는 단독 퍼포에서 ■, p = NS 제어 중량 C3H 대 + B6 CD4 T 세포는) 거부를 폐지하지 않았다. 흥미롭게도, 이펙터 CD4 T 세포에서 FasL의 제거는 대 <●, P <중량 C3H + B6 CD4 T 세포 대 0.02, P <중량 C3H + B6 PFPKO CD4 T 세포 대 0.01이고, p (크게 0.01 지연 거부했다 . C3H의 LPR + B6 CD4 T 세포). 그러나, 대부분의 동종 이식은 여전히​​ (5 4) 거부했다. 중요한 것은, 모두 기증자 공장 자동화 및 CD4 T 세포 퍼포의 동시 제거완전히 폐지 거부 (○, P <0.002 제어 중량 C3H 대 + B6 CD4 T 세포, 중량 C3H + B6 PFPKO CD4 T 세포 및 C3H의 LPR + B6 CD4 T 세포). 이 폐기는 훨씬 더 강력한 CD4 T 세포 FasL의의 개별 파면했다 (○, P <0.003 대 제어 중량 C3H + B6의 GLD CD4 T 세포). 그라 지아 등 ^10. 허가 재판.

토론

이 수술 기법을 마스터하는 것은 쉽지 않다, 그러나 한 번 마스터는 강력한 연구 도구입니다. 연구원 / 의사는 기술의 일관성에 의해 및 세부 사항에 대한 관심에 의해 보상된다. 학습 단계에서 인내심이 핵심입니다. ,는 그것이 최초의 성공적인 절차 및 90 % 성공률을 달성하기 위해 78 시도를 달성하기 위하여 11 시도의 평균 소요 비디오 기반의 학습 도구의 도움으로 니미 (3)에 의해 공표. 영화는 수술 ^{11, 12에서} 중요한 교육 도구가되었다.

문제 해결

문합에서 출혈이 발생하고이 때문에 봉합의 올바른 긴장의 부족, 또는 너무 적은 봉합 하나에 가능성이있다. 이러한 Gelfoam으로 에이전트를 유도 응고 누출을 감소하는 데 유용 할 수 있지만, 우리는 외과 의사가 좋은 기술에 의존해야하는 것이 좋습니다. 혼잡 비 심장 박동으로 인해 특히 정맥 측에 너무 꽉 문합에 가장 일반적입니다. 비 beatiNG, 비 관류 이식은 일반적으로 관상 동맥 중 하나에 여행이 기포에 의해 발생합니다. 이는 혈관에 기포의 유입을 방지하기 위해 습기 - 대 - 습식 필드를 유지하는 것이 중요하다.

기술의 한계

연구원은 완벽하게 작동하는 마음에 미치는 영향을 조사하고자하는 경우이 방법은 적합하지 않습니다. 즉, 현재까지 수행하는 것은 불가능 입증했다 동소 이식 기술을 필요로한다.

기존의 방법에 대한 중요성

한 마우스에서 완전 혈관 고체 기관 이식에 대한 효과를 연구하기를 원하는 경우, 심장 모델은 아마도 마스터 가장 간단하다. 폐, 신장 및 간 이식의 마우스 모델은 존재하지만, 많이 배우고 열심히하고 완벽 않습니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계

그것은 매우 중요합니다 그 전체 두께 P혈관 외막 및 봉합 바늘의 내막을 포함 엉덩이가 달성된다. 가장자리의 Evertion는 밀봉 및 문합의 치유에 도움 내막 - 투 - 내막 연락이 있다는 것을 보장합니다. 또 다른 매우 중요한 요인은 문합 봉합선의 장력이 또한 최적임을 보장한다. 너무 느슨하고 돌이킬 수없는 누수가있을 것입니다, 너무 꽉 흐름에 협착이 발생합니다. 정맥 측에 혼잡 한 마음이 발생할 경우 동맥 측이, 이식의 가난한 관류 될 것이다.

특히, 반복, 절차 및 세부 사항에 지속적인 관심의 일관성은 좋은 결과와 fundable이지 및 게시 가능한 데이터를 얻을 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Straight micro-dissecting forcep #5	RS-5015	11295-51
Curved micro-dissecting forcep #7	RS-5047	11297-00
Curved serrated forcep	RS-5137	11052-10
Vannas micro-dissecting scissors, short	RS-5610		09.140.08
Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long		11.602.11
Micro spring handle needle holder			11.549.15
Straight mosquito forcep		91308-12
Micro-dissecting scissors, straight, blunt	RS-5962	14078-10
Micro-dissecting scissors, curved, blunt	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
Silk suture, 5/0, 22.5 m spool		18020-50
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 silk			E19A05N
Gloves		Biogel from Medex Supply
Drapes		Precept, #64-9012-9
Syringes		B-D 1 cc insulin, #329424
Cotton applicators		Fisher-brand, #23-400-100
Povidone-Iodine swabs		PDI, #B40600
4/0 Cotton ties			Domestic cotton autoclaved with instruments