Murini eterotopica cuore Tecnica Trapianto

Riepilogo

Il manoscritto descrive i passaggi necessari per eseguire il trapianto di cuore eterotopico nel topo.

Abstract

E 'ormai più di 40 anni da quando questa tecnica è stata riportata da Corry, Wynn e Russell. Anche se ci sono voluti alcuni anni per altri laboratori per diventare esperti in e utilizzano questa tecnica, è ora ampiamente utilizzato da molti laboratori di tutto il mondo. Una raffinatezza significativo alla tecnica originale è stato sviluppato e riportato nel 2001 da Niimi. Qui descritte sono le tecniche che si sono evoluti per oltre un decennio nelle mani di tre chirurghi (Plenter, Grazia, Pietra) nel nostro centro. Queste tecniche sono ora passati a una nuova generazione di chirurghi e ricercatori.

In gran parte basato sull'esperienza Niimi, le procedure utilizzate sono evoluti nei minimi dettagli - particolari che cercheremo di raccontare qui, in modo che altri possano essere in grado di utilizzare questo modello molto utile. Come Niimi, abbiamo scoperto che un aiuto di video apprendimento è una risorsa inestimabile per il principiante.

Introduzione

In un'epoca in cui è possibile effettuare rene, polmone, fegato e pancreas trapianti nei topi, la pietra angolare di trapianto di organi ricerca di base e immunologia dal 1973 ^1-4 rimane il cuore del modello di trapianto eterotopico nel topo. Negli anni successivi sono stati pubblicati diversi articoli dettagliare miglioramenti / ^5,6 filtri per questa procedura.

Come modello di trapianto di organo solido principalmente vascolarizzato questa procedura è secondo a nessuno. Una volta imparato questo procedimento si presta alla ricerca sulle reazioni di rigetto allogenico ^7, lo sviluppo delle vasculopatie croniche ⁸ e meccanismi di danno da ischemia riperfusione ^9.

Le chiavi per imparare correttamente questa procedura sono proprio come qualsiasi altro intervento chirurgico, pazienza da parte dell'istruttore e il tirocinante e attenzione al dettaglio. All'inizio del processo, il nuovo chirurgo troverà che they spenderà molte ore per ogni trapianto. Come l'esperienza è maturata, i tempi chirurgici, e quindi ischemia, si ridurrà drasticamente. Prestare attenzione ai dettagli di ogni passo prima o poi porterà al successo.

Mentre l'istruttore può fare del loro meglio per trasmettere, e per anticipare, tutte le possibili cadute fossa che si possono incontrare nel corso di questi interventi chirurgici, il tirocinante "creativo" probabilmente trovare alcuni di loro!

Le basi della procedura sono i seguenti. Il donatore crescente arco aortico è end-to-side anastomosi all'aorta addominale destinatario e l'arteria polmonare donatore è end-to-side anastomosi al destinatario addominale vena cava inferiore (IVC). Il sangue scorre dall'aorta destinatario in via retrograda attraverso l'aorta donatore alle arterie coronarie. Una volta che il sangue è fluita attraverso il sistema coronarico drena nell'atrio destro attraverso il seno coronarico, viene pompato nel ventricolo destro epoi attraverso l'arteria polmonare nel ricevente IVC. In questo modo il sistema coronarico è fornito sangue arterioso e ritmo sinusale ritorna al trapianto in 1-2 minuti di riperfusione. Poiché le camere sinistro del cuore sono essenzialmente pressione sotto-caricato parete libera ventricolare sinistra si atrofizza nel tempo.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni presso l'Università del Colorado Barbara Davis Animal Center Strutture in approvazione IACUC e curati secondo le linee guida NIH.

Profondità di anestesia viene giudicato da un pizzico punta inizialmente e per il rispetto della frequenza respiratoria volta che la procedura è iniziata.

1. Donatore di cuore Harvest

1. Anestetizzare il mouse donatore iniettando pentobarbital (60 mg / kg ip).
2. Immobilizzare il mouse vincoli a 4 vie e agganciare la pelliccia. Pulire la cute con alcool.
3. Dopo dissezione via la pelle, aprire la cavità addominale facendo una incisione trasversale appena inferiormente al diaframma.
4. Tagliare la parte posteriore del diaframma per l'inserimento costale e sollevare la parete toracica anteriore anteriormente e superiormente esponendo il cuore.
5. Estendere a tutto spessore tagliare la parte posteriore laterale cavità toracica sui lati destro e sinistro del torace.
6. Isolare l'vena cava inferiore (IVC) e posizionare un sciolto 5-0 sutura di seta intorno al IVC adiacente al suo inserimento nell'atrio destro.
7. Iniettare 1,0 cc di soluzione fisiologica a 4 ° C eparina (200 u / cc) in IVC, poi legare il vaso con la sutura di seta 5-0 e si dividono.
8. Isolare il diritto vena cava superiore (RSVC) in modo simile e legare con 5-0 sutura di seta e dividere.
9. Rotolare delicatamente il cuore verso destra degli animali e isolare la vena cava superiore sinistra (lSVC), legare con una sutura di seta 5-0 e dividere esporre l'arteria polmonare sinistra.
10. Fissare il cuore sotto una garza umida, mentre il timo è blunt sezionato dalla principale arteria polmonare (PA) e il diritto di rami PA e sinistro e ascendente dell'arco aortico.
11. Blunt sezionare l'arco aortico libera dei tessuti circostanti. Micro-forbici vengono utilizzati per dividere prossimale aorta a destra dell'arteria brachiale-cefalico, cioè non ci dovrebbero essere i rami tra il cuore e la divisionepunto dell'aorta.
12. Questa sezione dell'arco aortico costituisce il bracciale arterioso per il processo di impianto.
13. Riflettere il bracciale aortico inferiormente per esporre il tronco PA ei rami destro e sinistro della PA.
14. Blunt sezionare i rami PA sinistro e destro lontano dai tessuti circostanti fino dal cuore come possibile. Questo permette una facile dissezione del tronco PA dai tessuti circostanti.
15. Dividere il tronco PA più distalmente possibile, appena prossimale alla sua biforcazione. Questa sezione dell'arteria polmonare costituisce il bracciale venoso per il processo di impianto.
16. Collocare una sutura di seta 5-0 intorno alla base del cuore e cravatta. Il cuore viene quindi tagliato libera alla base, e posto in 4 ° C salina. Tempo di raccolta totale è di ca. 10-15 min.

2. Cuore tecnica di impianto

1. Anestetizzare topi riceventi con pentobarbital (60 mg / kg IP dose iniziale, 25 mg / kg IP dose supplementare se necessario).
2. Agganciare la pelliccia eimmobilizzare il mouse da vincoli a 4 vie e preparare la pelle con povidone-iodio e drappeggio in modo sterile.
3. Fare un 2 centimetri linea mediana verticale incisione addominale e entrare nella cavità addominale.
4. Ritrarre l'intestino superiormente ed esternato al petto. Conservare avvolto in una garza umida sterile (soluzione fisiologica sterile) in tutto il caso.
5. Isolare l'aorta addominale e la vena cava inferiore (IVC) al di sotto dei vasi renali e posizionare 4-0 legami di cotone in tutto il aorta e vena cava inferiore superiore poi inferiore al sito anastomosi.
6. Identificare eventuali vasi lombari all'interno del campo e legare con 10-0 nylon sutura.
7. Annodare i lacci di cotone, in primo luogo l'inferiore seguita dal superiore. In questo modo alcuni sangue viene mantenuta in aorta rendendo il aortotomy facile.
8. Formare la aortotomy con un ago 30 G per entrare nel lume dell'aorta. Estendere l'incisione con sottili micro forbici per una lunghezza di circa 2 mm. Questa incisione viene effettuata in linea retta lungo l'all'asse longitudinale della nave.
9. Effettuare la fine anastomosi lato dell'aorta donatore al destinatario aorta nel modo seguente. Collocare un 10-0 nylon soggiorno sutura punto nell'aorta donatore e all'angolo inferiore dell'incisione nell'aorta destinatario e cravatta. Posizionare un secondo 10-0 nylon opposto al primo nell'aorta donatore e l'angolo superiore dell'incisione in aorta addominale e cravatta.
10. Effettuare una linea di sutura in esecuzione da superiore a inferiore nella parete laterale dell'aorta e cravatta contro la permanenza del punto precedentemente posizionato. Assicuratevi di portare i intimas (superficie recipiente interno) insieme come si ricamate. Poi suturare lato mediale in modo consecutivo e cravatta. Il primo e ultimo punto su ogni lato deve essere collocato il più vicino possibile i punti di soggiorno possibile. Poi puntare ad avere 3 punti equidistanti tra questi due per un totale di 5 punti.
11. Effettuare la fine anastomosi lato dell'arteria polmonare donatore al ricevente IVC nel modo seguente. Puncture la IVC con un ago G 30 ed estendere l'incisione per ca. 2 mm con raffinati micro forbici. Questa incisione viene effettuata in linea retta lungo l'asse longitudinale della nave.
12. Legare l'arteria polmonare donatore verso l'angolo inferiore della incisione nel IVC, con 10-0 nylon. Posizionare un secondo 10-0 nylon opposto al primo nell'arteria donatore e l'angolo superiore dell'incisione nella IVC e cravatta.
13. Effettuare una linea di sutura che corre tra l'arteria polmonare e l'IVC e cravatta. Il primo e ultimo punto su ogni lato deve essere collocato il più vicino possibile i punti di soggiorno possibile. Poi puntare ad avere cinque punti equidistanti tra questi due per un totale di 7 punti.
14. Rilasciare il distale 4-0 cotone tie ripristina il flusso venoso.
15. Una volta che è stata osservata emostasi dell'anastomosi venosa prossimale 4-0 cotone cravatta è gradualmente allentata e l'anastomosi arteriosa osservata per emostasi. Quando entrambe le anastomosi sono considerati sicuri, rimuovere il cOtton lega dal mouse.
16. Ritorno l'intestino all'addome. La parete addominale è chiusa in due strati con sutura di seta 5-0 in un modo esecuzione.
17. Somministrare un bolo di 1,0 ml di sterile, caldo normale soluzione fisiologica nell'addome come rianimazione fluido alla chiusura, e 0,8 ml di soluzione salina viene iniettata sottocute post-operatorio. Senza altre misure di supporto durante l'intervento sono obbligatori. Recuperare l'animale su una coperta di riscaldamento. Tempo totale dell'impianto è di ca. 90-120 min per i principianti, 45-60 min con l'esperienza. Amministrare buprenorfina analgesia, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml all'inizio della procedura e ogni 6-12 ore per 72 ore post-op.

3. Valutazione Graft

1. Valutare la funzione del trapianto quotidianamente dalla palpazione trans-addominale.
2. Tenere il mouse come se fosse da dare un'iniezione intraperitoneale.
3. Premere delicatamente la punta di un dito contro la parete addominale e accertare la str pestaggiolength e la regolarità del trapianto.
4. Dare qualità palpazione un punteggio da 4 (ampiezza e frequenza normale) a 0 (non-pestaggio respinto innesto).

NOTE IMPORTANTI:

Tutti gli strumenti sono sterilizzati, guanti sterili sono indossati durante tutta la procedura e di un campo sterile viene mantenuta. Gli interventi chirurgici donatore e ricevente sono eseguite con l'uso di un microscopio operatorio. Assicurarsi che le anastomosi sono "puliti". Cioè, che le pareti posteriori non vengono catturati durante il posizionamento di punti. Ciò causerà un restringimento significativo flusso che sarà più che probabile risultato in un trapianto fallito e in casi estremi a posteriori paralisi degli arti. E 'anche estremamente importante che l'intero spessore compreso passa avventizia vascolare e l'intima dell'ago di sutura vengono raggiunti. Evertion dei bordi assicura anche che non vi è intima-to-intima contatto, che aiuta nella tenuta e la guarigione delle anastomosi. Un altro fatto di vitale importanzao è garantire che la tensione delle linee di sutura anastomotica è anche ottimale. Troppo lenta e ci saranno perdite irreversibili, troppo stretto e stenosi di fluire si tradurrà. Se sul lato arterioso questo si tradurrà in scarsa perfusione dell'innesto, se dal lato venoso comporterà un cuore congestionato.

Risultati

L'utilizzo di questa tecnica chirurgica apre la strada sia per studi di sopravvivenza dell'innesto / rigetto semplici o protocolli sperimentali piuttosto complessi. Nello studio brevemente descritto in figura, si è cercato di definire il coinvolgimento eventuale di Fas e / o perforina come meccanismi di CD4 cellule T mediata rigetto cardiaco. Ciò è stato reso possibile dalla straordinaria varietà di ceppi di topi che sono oggi disponibili. I risultati dimostrano che il rifiuto diretto di allotrapianti cardiaci da parte delle cellule T effettrici CD4 richiede il contributo alternativo di innesto espressione Fas e di espressione perforina cellule T. A nostra conoscenza, questa è la prima dimostrazione che l'attività citotossica da parte delle cellule T CD4 può svolgere un ruolo di obbligato principale per rigetto acuto in vivo.

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. Figura 1 perforina e Fas Rappresenti Obbligatori e percorsi paralleli di CD4 T cellulo-mediata rigetto cardiaco B6, B6 PFPKO (perforina knock-out), e B6 GLD (carenti Fas-ligando) CD4 cellule T sono stati utilizzati per ricostituire B6 rag ^{- / -} destinatari di C3H tipo selvatico o C3H Fas-deficienti LPR alloinnesti cardiaci. La rimozione della sola Fas (♦, p = NS vs controllo Wt C3H + B6 cellule T CD4) dai cuori donatori o rimozione o solo perforina dalle cellule T CD4 (■, p = NS vs controllo Wt C3H + B6 CD4 T cellule) non abrogano rifiuto. È interessante notare che la rimozione di FasL da effettrici cellule T CD4 fatto rigetto ritardo significativo (●, p <0,02 vs cellule Wt C3H B6 + CD4 T, p <0,01 vs cellule Wt C3H + B6 PFPKO T CD4, e p <0,01 vs . C3H lpr + B6 cellule T CD4). Tuttavia, la maggior parte dei documenti non autografo erano ancora respinte (4 su 5). Significativamente, la rimozione simultanea del donatore Fas e CD4 T perforina cellulerifiuto completamente abrogata (○, p <0.002 vs controllo Wt C3H + B6 cellule T CD4, Wt C3H + B6 cellule PFPKO T CD4, e C3H lpr B6 cellule T CD4 +). Tale abrogazione è stata significativamente più robusto rispetto alla rimozione individuale di FasL cellule CD4 T (○, p <0.003 vs controllo Wt C3H + B6 GLD cellule T CD4). Da Grazia et al ^10. Ristampato con il permesso.

Discussione

Questa tecnica chirurgica non è facile da padroneggiare, ma una volta imparato è un potente strumento di ricerca. Il ricercatore / chirurgo viene premiato dal coerenza della tecnica e attenzione al dettaglio. Pazienza durante la fase di apprendimento è fondamentale. Come pubblicato da Niimi 3, con l'ausilio di uno strumento di apprendimento video basato ci vuole una media di 11 tentativi per ottenere la prima procedura di successo e 78 tentativi di raggiungere un tasso di successo del 90%. Video sono diventati un importante strumento didattico in chirurgia ^11,12.

Risoluzione dei problemi

Sanguinamento dalle anastomosi può verificarsi, e questo è probabilmente dovuto a uno mancanza di una corretta tensione nelle suture, o troppo pochi punti di sutura. Mentre un agente che induce la coagulazione come Gelfoam può essere utile per ridurre le perdite, si raccomanda che il chirurgo deve fare affidamento su una buona tecnica. Congestionato cuore non battere è più comunemente causa di anastomosi che sono troppo stretti, in particolare sul lato venoso. Un non-beating, innesto non perfuso è generalmente causata da una bolla d'aria che ha viaggiato in una delle arterie coronarie. È importante mantenere un campo umido a bagnato per evitare l'ingresso di bolle nei vasi.

Limitazioni della Tecnica

Questa tecnica non è adatto se un ricercatore vuole studiare gli effetti su un cuore pienamente funzionante. Ciò richiederebbe una tecnica di trapianto ortotopico, che fino ad oggi si è dimostrato impossibile da eseguire.

Significative in relazione a metodi esistenti

Se si vuole studiare gli effetti su un completamente vascolarizzato, trapianto di organi solidi nel topo, allora il modello cuore è probabilmente il più semplice da padroneggiare. Esistono modelli murini di polmone, rene e trapianto di fegato, ma sono molto più difficili da imparare e perfetto.

Fasi critiche all'interno del protocollo

E 'di vitale importanza che l'intero spessore pculi compresi avventizia vascolare e l'intima dell'ago di sutura vengono raggiunti. Evertion dei bordi assicura anche che non vi è intima-to-intima contatto, che aiuta nella tenuta e la guarigione delle anastomosi. Un altro fattore estremamente importante è garantire che la tensione delle linee di sutura anastomotica è anche ottimale. Troppo lenta e ci saranno perdite irreversibili, troppo stretto e stenosi di fluire si tradurrà. Se sul lato arterioso questo si tradurrà in scarsa perfusione dell'innesto, se dal lato venoso comporterà un cuore congestionato.

Soprattutto, la ripetizione, la coerenza del procedimento e continua attenzione ai dettagli produrrà grandi risultati e dei dati finanziabili e pubblicabili.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Straight micro-dissecting forcep #5	RS-5015	11295-51
Curved micro-dissecting forcep #7	RS-5047	11297-00
Curved serrated forcep	RS-5137	11052-10
Vannas micro-dissecting scissors, short	RS-5610		09.140.08
Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long		11.602.11
Micro spring handle needle holder			11.549.15
Straight mosquito forcep		91308-12
Micro-dissecting scissors, straight, blunt	RS-5962	14078-10
Micro-dissecting scissors, curved, blunt	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
Silk suture, 5/0, 22.5 m spool		18020-50
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 silk			E19A05N
Gloves		Biogel from Medex Supply
Drapes		Precept, #64-9012-9
Syringes		B-D 1 cc insulin, #329424
Cotton applicators		Fisher-brand, #23-400-100
Povidone-Iodine swabs		PDI, #B40600
4/0 Cotton ties			Domestic cotton autoclaved with instruments