Murine Heterotope Heart Transplant-Technik

Zusammenfassung

Das Manuskript beschreibt die erforderlich sind, um die heterotopen Herztransplantation in der Maus führen Sie die Schritte.

Zusammenfassung

Es ist nun über vierzig Jahre her, seit diese Technik wurde zuerst von Corry, Wynn und Russell berichtet. Es dauerte zwar einige Jahre für andere Labors beherrschen zu werden und nutzen diese Technik, wird es jetzt von vielen Labors auf der ganzen Welt eingesetzt. Ein erheblicher Verfeinerung der Originaltechnik wurde entwickelt und im Jahr 2001 von Niimi berichtet. Beschrieben werden hier die Techniken, die über mehr als ein Jahrzehnt in den Händen von drei Chirurgen (Plenter, Grazia, Pietra) in unserem Zentrum entwickelt haben. Diese Techniken werden nun auf eine jüngere Generation von Chirurgen und Forscher weitergegeben.

Details, die wir uns bemühen, hier in einer Weise, die andere kann in der Lage, diese sehr nützliches Modell zu verwenden beziehen - basiert weitgehend auf der Niimi Erfahrung haben die verwendeten Verfahren in den feinen Details entwickelt. Wie Niimi, haben wir festgestellt, dass ein Video-Lernhilfe ist eine unschätzbare Ressource für den Anfänger.

Einleitung

In einer Zeit, als es möglich ist, Nieren-, Lungen-, Leber-und Pankreastransplantationen an Mäusen durchgeführt, die Grundpfeiler der Organtransplantation und Immunologie Forschung seit 1973 ^1-4 bleibt der heterotopen Herztransplantationsmodell in der Maus. In den dazwischenliegenden Jahren mehrere Arbeiten veröffentlicht worden Detaillierung Verbesserungen / Weiter ^5,6 auf dieses Verfahren.

Als Modell für Organtransplantation in erster Linie gefäß diese Prozedur ist unübertroffen. Einmal bewältigt dieses Verfahren eignet sich in allogenen Abstoßungsreaktionen ^7, die Entwicklung der chronischen Gefäßerkrankungen ⁸ und die Mechanismen der Ischämie-Reperfusionsverletzung ⁹ Forschung.

Die Schlüssel, um erfolgreich zu lernen, dieses Verfahren sind wie jede andere Operation, Geduld auf Seiten der Ausbilder und der Auszubildenden und Liebe zum Detail. Zu Beginn des Verfahrens wird der neue Chirurg wird, dass t findenhey viele Stunden auf jeder Transplantation zu verbringen. Wie die Erfahrung gewonnen, werden chirurgische Zeiten und damit Ischämie, drastisch zu reduzieren. Die Aufmerksamkeit auf die Details jeder Schritt wird früher oder später zum Erfolg führen.

Während die Lehrer können ihr Bestes tun, um weiterzugeben und zu antizipieren, zu allen möglichen Grube fällt, die während dieser Operationen auftreten können, wird die "kreative" Trainee wahrscheinlich feststellen, einige ihrer eigenen!

Die Grundlagen des Verfahrens sind wie folgt. Der Spender aufsteigend Aortenbogen ist End-zu-Seite zu dem Empfänger abdominalen Aorta und Lungenarterie des Spenders ist anastomosiert Ende-zu-Seite zu dem Empfänger abdominalen Vena cava inferior (IVC) anastomosiert. Blut fließt aus der Empfänger Aorta retrograd durch die Aorta Spender zu den Koronararterien. Wenn das Blut durch die Herzkranzsystem über den Koronarsinus in den rechten Vorhof abfließt geflossen ist, in die rechte Herzkammer gepumpt unddann über die Lungenarterie in den Empfänger IVC. Auf diese Weise wird die koronare Arteriensystem blutet und Sinusrhythmus zurückkehrt, um das Transplantat innerhalb von 1-2 min Reperfusion. Da die linke Herzkammern sind im wesentlichen unter Druck belasteten der linksventrikulären freien Wand wird mit der Zeit verkümmern.

Protokoll

Alle Tiere wurden unter keimfreien Bedingungen an der Universität von Colorado Barbara Davis-Center Tierhaltung unter IACUC Genehmigung untergebracht und versorgt nach den NIH-Richtlinien.

Narkosetiefe wird durch Zeh Prise zunächst und durch Einhaltung der Atmungsrate beurteilt, sobald das Verfahren begonnen hat.

1. Donor Heart Ernte

1. Betäuben Donor Maus durch Injektion von Pentobarbital (60 mg / kg IP).
2. Unbeweglichkeitseffekt der Maus durch 4-Wege-Clip Stützen und das Fell. Wischen Sie die Haut mit Alkohol.
3. Nach sezieren entfernt die Haut, öffnen Sie die Bauchhöhle, indem sie einen Querschnitt unmittelbar unterhalb des Zwerchfells.
4. Schneiden Sie die Membran hinter Rippen Einsetzen und heben Sie den vorderen Brustwand nach vorn und oben Aussetzen des Herzens.
5. Erweitern einer vollen Dicke die hinteren seitlichen Brusthöhle geschnitten auf der linken und der rechten Seite der Brust.
6. Isolieren Sie dieVena cava inferior (IVC) und setzen eine lose 5-0 Seidennaht um den IVC angrenzend an sein Einsetzen in das rechte Atrium.
7. Spritzen 1,0 ml 4 ° C Heparin Kochsalzlösung (200 u / cm ³) in die IVC, dann ligieren das Schiff mit dem 5-0 Seidennaht und sich teilen.
8. Isolieren Sie die rechte obere Hohlvene (rSVC) in ähnlicher Art und Weise und zu ligieren mit 5-0 Seidennaht und sich teilen.
9. Rollen Sie das Herz auf der rechten Seite der Tiere und zu isolieren, die linke obere Hohlvene (lSVC), abzubinden mit einem 5-0 Seidennaht und teilen Aussetzen der linken Lungenarterie.
10. Sichern Sie das Herz unter einer feuchten Gaze während der Thymus ist stumpf vom Hauptlungenarterie (PA) und der linken und rechten PA Filialen seziert und aufsteigend Aortenbogen.
11. Blunt sezieren die Aortenbogen frei von den umgebenden Gewebe. Mikroscheren verwendet werden, um die Aorta proximal zu der rechten Arteria brachialis-Kopfteilen, dh es sollte keine Verzweigungen zwischen dem Herzen und der Teilung seinPunkt der Aorta.
12. Dieser Abschnitt des Aortenbogens bildet die arterielle Manschette für den Implantationsprozess.
13. Spiegeln die Aorten-Manschette inferior, um die PA Stamm und die linken und rechten Zweige der PA aus.
14. Blunt die linken und rechten PA Zweige von den umgebenden Geweben weit vom Herzen wie möglich zu sezieren. Dies ermöglicht eine einfache Zerlegung des PA Stamm von umgebenden Geweben.
15. Teilen Sie die PA Stamm als distal wie möglich, nur in der Nähe seiner Gabelung. Dieser Abschnitt der Lungenarterie bildet die Venenmanschette für den Implantationsprozess.
16. Legen Sie ein 5-0 Seidenfaden um die Basis des Herzens und Krawatte. Das Herz wird dann an der Basis frei geschnitten und in 4 ° C Salzlösung gelegt. Gesamterntezeit ca. 10-15 min.

2. Herzimplantattechnik

1. Betäuben die Empfängermäuse mit Pentobarbital (60 mg / kg IP Initialdosis 25 mg / kg IP zusätzliche Dosis, falls erforderlich).
2. Clip der Pelz-undImmobilisierung der Maus durch 4-Wege-prep Stützen und die Haut mit PVP-Jod und Fall steril.
3. Machen Sie eine 2 cm vertikale Mittellinie Bauchschnitt und geben Sie die Bauchhöhle.
4. Fahren Sie den Darm nach oben und auf der Brust externalisiert. Halten Sie in sterilen feuchten Gaze (sterile Kochsalzlösung) in der gesamten Fall gewickelt.
5. Isolieren Sie die Bauch-Aorta und untere Hohlvene (IVC) unterhalb der Nierengefäße und legen 4-0 Baumwolle Krawatten um die Aorta und IVC überlegen dann schlechter als die Anastomose.
6. Identifizieren Sie alle Schiffe in der Lendenfeld und Ligation mit 10-0 Nylonnaht.
7. Knoten Sie die Baumwoll Krawatten, zuerst die untere, gefolgt von der überlegen. Auf diese Weise wird etwas Blut in der Aorta so dass die Aortotomie leichter beibehalten.
8. Bilden die Aortotomie mit einer 30 G-Nadel, um das Lumen der Aorta zu gelangen. Erweitern Sie den Schnitt mit feinen Mikro Schere auf eine Länge von etwa 2 mm. Dieser Schnitt wird in einer geraden Linie entlang der langen hergestelltitudinal Achse des Behälters.
9. Machen Sie Schluss mit Anastomose der Spender Aorta Aorta an den Empfänger in der folgenden Weise. Legen Sie ein 10-0 Nylonnaht Aufenthalt Stich in der Spender Aorta und an den unteren Winkel des Einschnitts in der Empfänger Aorta und Krawatte. Legen Sie eine zweite 10-0 Nylon gegenüber der ersten in der Spender Aorta und der überlegenen Ecke der Schnitt in der Bauchaorta und Krawatte.
10. Mit Anlauf Nahtlinie aus überlegen, unterlegen in der Seitenwand der Aorta und Krawatte gegen die zuvor platzierten Aufenthalt Stich. Seien Sie sicher, die Intimas (innere Gefäßoberfläche) zusammen zu bringen, wie Sie nähen. Dann Naht der medialen Seite in einem laufenden Mode und Krawatte. Die erste und die letzte Masche auf jeder Seite sollte möglichst nahe an den Aufenthalt Stiche wie möglich platziert werden. Dann wollen drei gleichmäßig verteilten Stiche zwischen diesen beiden so dass insgesamt 5 Stiche haben.
11. Machen Sie Schluss mit Anastomose der Spenderlungenarterie an den Empfänger IVC in der folgenden Weise. PunctAbbildung der IVC mit einem 30-G-Nadel und erweitern den Schnitt für ca. 2 mm mit feinen Mikro Schere. Dieser Schnitt wird in einer geraden Linie entlang der Längsachse des Behälters hergestellt.
12. Binden Sie die Spenderlungenarterie in der unteren Ecke der Schnitt in der IVC mit 10-0 Nylon. Legen Sie eine zweite 10-0 Nylon gegenüber der ersten in der Spenderarterie und der überlegenen Ecke der Schnitt in der IVC und Krawatte.
13. Mit Anlauf Nahtlinie zwischen Lungenarterie und der IVC und Krawatte. Die erste und die letzte Masche auf jeder Seite sollte möglichst nahe an den Aufenthalt Stiche wie möglich platziert werden. Dann sollen bis 5 Stiche gleichmäßig verteilt zwischen diesen beiden so dass insgesamt sieben Stiche haben.
14. Lassen Sie die distalen 4:0 Baumwolle Krawatte Wiederherstellung Venenfluss.
15. Sobald die Blutstillung der venösen Anastomose beobachtet worden, der proximale 4:0 Baumwolle Krawatte allmählich gelockert und die arterielle Anastomose zur Blutstillung beobachtet. Wenn beide Anastomosen gelten als sicher, entfernen Sie die cotton Binder von der Maus.
16. Bringen Sie den Darm auf den Bauch. Die Bauchwand wird in zwei Schichten mit 5-0 Seidennaht in einem laufenden Mode geschlossen.
17. Verwalten eines Bolus von 1,0 ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung in warmem Abdomen als Flüssigkeitszufuhr beim Schließen, und 0,8 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan post-operativ injiziert werden. Während der Operation sind keine weiteren unterstützenden Maßnahmen erforderlich. Recover das Tier auf eine wärmende Decke. Insgesamt Implantat Zeit beträgt ca.. 90-120 min für Anfänger, 45-60 min mit Erfahrung. Verwalten Buprenorphin Analgesie, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml zu Beginn des Verfahrens und alle 6-12 h für 72 Stunden nach der Operation.

3. Graft Beurteilung

1. Bewerten Transplantatfunktion täglich von trans-abdominale Palpation.
2. Halten Sie die Maus, als ob es um eine intraperitoneale Injektion verabreicht werden.
3. Drücken Sie vorsichtig die Spitze eines Zeigefinger gegen die Bauchwand und festzustellen, das Schlagen strength und Ordnungsmäßigkeit des Transplantats.
4. Geben Palpation Qualität eine Punktzahl von 4 (normale Amplitude und Frequenz) bis 0 (nicht-schlag abgelehnt Transplantat).

WICHTIGE HINWEISE:

Alle Instrumente sind sterilisiert, sterile Handschuhe sind während des gesamten Verfahrens tragen und einen sterilen Bereich erhalten bleibt. Die Spender und Empfänger-Operationen werden durch die Verwendung eines Operationsmikroskops durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass die Anastomosen sind "sauber". Das heißt, dass die Rückwände sind nicht bei der Platzierung Maschen verfangen. Dadurch wird eine signifikante Verengung fließen mehr als wahrscheinlich, dass Ergebnis wird in einem gescheiterten Transplantat und im Extremfall zu-Hinterbeinlähmung. Es ist auch sehr wichtig, dass die gesamte Dicke geht einschließlich der Gefäß Adventitia und Intima der Nähnadel erreicht. Evertion der Kanten gewährleistet auch, dass es Intima-zu-Intima-Kontakt, der in Dicht-und Heilung der Anastomose hilft. Eine weitere wichtige Tatsache von entscheidenderoder ist sicherzustellen, dass die Spannung der anastomotischen Nahtlinien ist auch optimal. Zu locker und es wird irreversible undicht zu sein, zu eng und zu fließen Stenose führen wird. Wenn auf der arteriellen Seite wird dies zu einer schlechten Durchblutung des Transplantats führen, wenn auf der venösen Seite eine lasteten Herzen resultieren.

Ergebnisse

Die Verwendung dieser chirurgischen Technik wird der Weg für entweder einfache Transplantatüberleben / Ablehnung Studien oder sehr komplex Versuchsprotokollen. In der Studie kurz in der Abbildung unten beschrieben ist, haben wir versucht, die Beteiligung der Fas-und / oder Perforin als Mechanismen der CD4-T-Zell-vermittelte Herzabstoßung zu definieren, wenn überhaupt,. Dies wurde durch die außerordentliche Vielfalt von Mausstämmen, die heute verfügbar sind, ermöglicht. Die Ergebnisse zeigen, dass die direkte Ablehnung der Herztransplantate durch CD4 Effektor-T-Zellen erfordert die Alternative Beitrag von Graft Fas-Expression und T-Zell-Perforin-Expression. Nach unserem Wissen ist dies der erste Nachweis, dass zytolytische Aktivität von CD4 T-Zellen können eine obligate Rolle für die Primär akuten Transplantatabstoßung in vivo zu spielen.

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. Abbildung 1 Perforin und Fas vertreten Pflicht und parallele Wege der CD4-T-Zell-vermittelte Herz Ablehnung B6, B6 PFPKO (Perforin knock-out) und B6 gld (Fas-Ligand-defizienten) CD4-T-Zellen wurden verwendet, um B6 Lappen rekonstruieren ^{- / -} Empfänger von C3H Wildtyp-oder Fas-defizienten lpr C3H Herztransplantate. Entfernung von allein Fas (♦, p = NS vs Steuer Wt C3H + B6 CD4-T-Zellen) von den Spenderherzen oder Entfernung Perforin oder allein von den CD4-T-Zellen (■, p = NS vs Steuer Wt C3H + B6 CD4-T- Zellen) nicht aufhebt Ablehnung. Interessanterweise ist die Entfernung von FasL von Effektor-T-Zellen CD4 hat Verzögerungs Abstoßung signifikant (●, p <0,02 vs Wt C3H + B6 CD4-T-Zellen, p <0,01 vs Wt C3H + B6 PFPKO CD4-T-Zellen, und p <0,01 vs . C3H lpr B6 + CD4-T-Zellen). Allerdings wurden die meisten Allografts noch abgelehnt (4 von 5). Deutlich die gleichzeitige Entfernung von Spender Fas und CD4-T-Zell Perforinvollständig aufgehoben Ablehnung (○, p <0,002 vs Steuer Wt C3H + B6 CD4-T-Zellen, Wt C3H + B6 PFPKO CD4-T-Zellen und C3H lpr B6 + CD4-T-Zellen). Diese Aufhebung war deutlich robuster als das Individuum Entfernung von CD4 T-Zell-FasL (○, p <0,003 vs Steuer Wt C3H + B6 gld CD4-T-Zellen). Von Grazia et al ^10. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung.

Diskussion

Diese OP-Technik ist nicht einfach zu meistern, aber einmal gemeistert ist eine leistungsstarke Recherche-Tool. Der Forscher / Chirurg durch Konsistenz der Technik und durch die Liebe zum Detail belohnt. Geduld während der Lernphase ist der Schlüssel. Wie von Niimi 3 veröffentlicht, mit Hilfe einer Video-basierten Lernwerkzeug dauert es durchschnittlich 11 Versuche, die erste erfolgreiche Verfahren und 78 Versuche, eine Erfolgsquote von 90% zu erreichen zu erreichen. Videos sind zu einem wichtigen Lehrmittel in der Chirurgie ^11,12.

Fehlerbehebung

Blutungen aus der Anastomosen auftreten und dies ist wahrscheinlich auf entweder fehlende richtige Spannung in den Fäden, oder zu wenige Nähte. Während ein Gerinnungsmittel wie Induktion Gelfoam kann nützlich sein für die Verluste zu verringern, empfehlen wir, dass der Chirurg sollte sich auf die Technik verlassen. Überlastete nicht-schlagende Herz ist meist durch Anastomosen, die zu eng sind, insbesondere auf der venösen Seite. Ein nicht-beating, nicht-perfundierte Transplantat wird gewöhnlich durch eine Luftblase, die in eine der Koronararterien verursacht gereist ist. Es ist wichtig, um eine feuchte benetzbaren Bereich zu halten, um den Eintritt von Blasen in den Behältern zu vermeiden.

Grenzen der Technik

Diese Technik ist nicht geeignet, wenn ein Forscher möchte Auswirkungen auf eine voll funktions Herz zu untersuchen. Das wäre eine orthotope Transplantation Technik, die bislang unmöglich durchzuführen erwies erfordern.

Bedeutung gegenüber den bestehenden Methoden

Wenn man die Auswirkungen auf vollständig vaskularisiert, Organtransplantation in der Maus zu untersuchen will, dann ist das Herz-Modell wohl am einfachsten zu meistern. Mausmodelle von Lungen-, Nieren-und Lebertransplantation nicht vorhanden sind, sind jedoch viel schwieriger zu lernen und perfekt.

Kritische Schritte Innerhalb des Protokolls

Es ist äußerst wichtig, dass die vollständige Dicke pEsel einschließlich der vaskulären Intima-und Adventitia der Nähnadel erreicht. Evertion der Kanten gewährleistet auch, dass es Intima-zu-Intima-Kontakt, der in Dicht-und Heilung der Anastomose hilft. Ein weiterer entscheidender Faktor ist wichtig sicherzustellen, dass die Spannung der anastomotischen Nahtlinien ist ebenfalls optimal. Zu locker und es wird irreversible undicht zu sein, zu eng und zu fließen Stenose führen wird. Wenn auf der arteriellen Seite wird dies zu einer schlechten Durchblutung des Transplantats führen, wenn auf der venösen Seite eine lasteten Herzen resultieren.

Vor allem wird die Wiederholung, die Konsistenz der Verfahren und kontinuierliche Aufmerksamkeit zum Detail großartige Ergebnisse und finanzierbar und publikations Daten ergeben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Straight micro-dissecting forcep #5	RS-5015	11295-51
Curved micro-dissecting forcep #7	RS-5047	11297-00
Curved serrated forcep	RS-5137	11052-10
Vannas micro-dissecting scissors, short	RS-5610		09.140.08
Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long		11.602.11
Micro spring handle needle holder			11.549.15
Straight mosquito forcep		91308-12
Micro-dissecting scissors, straight, blunt	RS-5962	14078-10
Micro-dissecting scissors, curved, blunt	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
Silk suture, 5/0, 22.5 m spool		18020-50
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 silk			E19A05N
Gloves		Biogel from Medex Supply
Drapes		Precept, #64-9012-9
Syringes		B-D 1 cc insulin, #329424
Cotton applicators		Fisher-brand, #23-400-100
Povidone-Iodine swabs		PDI, #B40600
4/0 Cotton ties			Domestic cotton autoclaved with instruments