RNA catalizador como reportero para rastrear fármacos contra ARN de edición en tripanosomas

Resumen

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Resumen

Se ha avanzado considerablemente en la determinación del mecanismo de edición del ARN mitocondrial en tripanosomas. Del mismo modo, se ha avanzado considerablemente en la identificación de los componentes del complejo editosome que catalizan la edición del ARN. Sin embargo, todavía no está claro cómo estas proteínas trabajan juntos. Los compuestos químicos obtenidos a partir de una pantalla de alto rendimiento contra el editosome pueden bloquear o afectar a una o más etapas en el ciclo de edición. Por lo tanto, la identificación de nuevos compuestos químicos generará valiosos sondas moleculares para disecar la función editosome y montaje. En estudios anteriores, los ensayos in vitro de edición en se llevaron a cabo utilizando ARN radiomarcado. Estos ensayos consumen mucho tiempo, ineficiente e inadecuada para fines de alto rendimiento. Aquí, una basada en la fluorescencia homogénea "de mezcla y medida" reportero de ensayo martillo ribozima in vitro para monitorear la edición de ARN, se presenta. Sólo como consecuencia de la edición de ARN dela ribozima cabeza de martillo un sustrato oligorribonucleótido transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) se somete a la escisión. Esto a su vez resulta en la separación del fluoróforo de la inhibidor de la fluorescencia produciendo de este modo una señal. En contraste, cuando la función de editosome se inhibe, se apagará la señal de fluorescencia. Se trata de un ensayo altamente sensible y simple que debe ser de aplicación general para vigilar en la edición de ARN in vitro o cribado de alto rendimiento de los productos químicos que pueden inhibir la función editosome.

Introducción

El proceso de edición de ARN, una modificación post-transcripcional del mRNA, fue descubierto por primera vez en tripanosomátidos ^1. Desde entonces, el trabajo sustancial se ha llevado a cabo en el estudio del mecanismo detrás de la edición de ARN en Trypanosoma brucei ^2,3. En una serie de reacciones enzimáticas, la editosome, un complejo de núcleo de aproximadamente 20 proteínas, crea ARNm mitocondriales maduros para múltiples componentes del sistema de la fosforilación oxidativa de generación de energía. El orden de los eventos catalíticos es la escisión endonucleolítica, uridilato (U) adición o supresión, y la ligadura, según lo dictado por los ARN guía (gRNAs) ^4.

Además de las principales proteínas editosome complejos, un número de factores accesorios también se han identificado ^5-7. Estas proteínas se consideran sobre todo agrupadas en complejos independientes. Sin embargo, el orden de ensamblaje de proteínas en el complejo editosome núcleo y los patrones de interacción del complejo central con el accesoriocomplejos están aún por determinar. Orientación del proceso de edición del ARN en tripanosomátidos puede proporcionar disectores químicas que ayudan en el estudio de la asamblea y función del complejo editosome. Además, los estudios funcionales en varias proteínas editosome han demostrado esencialidad a través de diferentes etapas de la vida, lo que indica su potencial como medicamento actúa ^8-12. Por lo tanto, los inhibidores de la editosome han encontrado también pueden actuar como compuestos de plomo contra los tripanosomátidos. Esto es oportuna, ya que los fármacos actualmente disponibles contra las enfermedades causadas por trypanosomatid son tóxicos, ineficiente y costoso ^13,14.

Un ensayo eficiente y conveniente in vitro es necesario explorar el universo químico de inhibidores específicos que bloquean la edición del ARN. Tres ensayos se han desarrollado y utilizado para monitorear editosome actividades: (a) ronda completa en el ensayo de la edición de ARN in vitro ^15, (b) pre-troceados en el ensayo de la edición de ARN in vitro ^16,17, unnd ensayo ¹⁸ (c) de martillo ribozimas (HHR)-basado. Los dos primeros ensayos se basan en la visualización directa del producto editado (ATPasa 6 ARNm) con la ayuda de la radiactividad. El ensayo basado en HHR utiliza una versión modificada de la ATPasa 6 ARNm que se modela a comportarse como una ribozima en la edición. La ribozima funcional entonces hiende específicamente a un sustrato de ARN radiomarcado, que sirve como un reportero. Recientemente, Moshiri et al. Desarrolló una 'mezcla y medir' HHR-basado en reportero de ensayo in vitro para monitorizar la edición del ARN en el que el sustrato de ARN radiomarcado se sustituye con una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) sustrato ^19. Las ventajas principales de este ensayo son: (a) es una mezcla rápida y conveniente y el tipo de medida de ensayo, como la producción de ribozima activa y de escisión de sustrato se producen simultáneamente en el mismo tubo en bajo volumen (es decir, 20 l), (b ) que evita el uso de materiales marcados radiactivamente, (c) la sensibilidad que es unfforded por la instrumentación de fluorescencia en un formato de placa de microtitulación, y (d) una elevada relación señal-ruido. Utilizando este ensayo, el efecto de los inhibidores de la edición de ARN ligasa conocidos contra editosome purificado se confirmó ^19. Este experimento valida el ensayo para la identificación rápida de los inhibidores de la edición de ARN, principalmente contra editosomes enteros de T. brucei.

La figura 1 es un esquema detallado paso a paso del ensayo en la edición de ARN in vitro basado en la fluorescencia. Este protocolo puede ser utilizado para el seguimiento de la edición de ARN in vitro o ser fácilmente adaptado para el cribado de bibliotecas de compuestos de diversas escalas.

Protocolo

El protocolo siguiente se describe el procedimiento para realizar el ensayo de edición de ARN basado en la fluorescencia. El ensayo se puede realizar en un único tubo de PCR, 96 así-, o placas de 384 pocillos dependiendo del alcance del experimento. Posteriormente, la señal de fluorescencia se puede leer en un tiempo real, sistema de detección de PCR adecuados. El ensayo que aquí se describe en el contexto de las placas de 384 pocillos.

1. El cultivo de T. Las células brucei

1. Preparar un medio de crecimiento para T. brucei células procíclico de formulario. Para 1 l de medio:
   1. Disolver 25,4 g de polvo SDM-79 en agua 800 ml MiliQ.
   2. Añadir 2 g de _NaHCO3 y pH a 7,3 con 10 M de NaOH.
   3. Añadir agua nanopura a un volumen final de 900 ml, esterilizar filtro.
   4. Añadir suero fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina y solución de hemina (2,5 mg / ml) a concentraciones finales de 10% (v / v), 100 U / ml y 7,5 mg / L, respectivamente.
2. Grow 300 ml de T. tipo salvaje 1.7A brucei (forma procíclico) las células a 28 º C, agitando a 70 rpm a una densidad de 1,5 x 10 ⁷ células / ml. NOTA: Esto debería producir 3 ml de editosome activa con ~ 0,5 mg de proteína total, suficiente para 600 reacciones de edición.
3. Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Lavar el precipitado con 50 ml de tampón de PBSG enfriada (10 mM de Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, NaCl 145 mM, y glucosa 6 mM), y girar hacia abajo las células de nuevo por centrifugación a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.

2. Aislamiento de crudo mitocondrias

NOTA: Todos los pasos deben realizarse en hielo oa 4 ° C para preservar editosome actividad.

1. Resuspender las células recolectadas en 30 ml de tampón de DTE (1 mM de Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM). Utilice un homogeneizador Dounce de 40 ml estéril (previamente enfriado) para interrumpir la membrana celular por acariciar arriba y hacia abajo al menos 10 veces en el hielo.
2. Inmediatamente después, añadir 4,3 ml de 60% ​​de sacarosa (w / v, es decir, 1,75 M) al homogenado hasta una concentración final de 0,25 M. Se centrifuga a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C, para llevar preferentemente hacia abajo mitocondrias.
3. Resuspender el sedimento mitocondrial en 4,6 ml de tampón STM (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, sacarosa 250 mM y 2 mM de MgCl _2). Añadir 13,8 l de 0,1 M de CaCl ₂ y 4 l de RNasa libre de DNasa I a concentraciones finales de 0,3 mM y 9 U / ml, respectivamente. Incubar la mezcla durante 1 hora en hielo.
4. Añadir 4,6 ml de tampón STE (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, sacarosa 250 mM y EDTA 2 mM) para inactivar la DNasa I. Se centrifuga a 15.800 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Resuspender el sedimento en 400 l de tampón de lisis (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM _MgCl2, KCl 100 mM, 1 mg / ml de pepstatina, DTT 1 mM, y 1x de inhibidor de proteasa completo sin EDTA) y la transferencia a un tubo de microcentrífuga.
6. Añadir 10% de Triton X-100 a una concentración final de 1% de unND incubar el lisado durante 15 min a 4 ° C en un rotador tubo.
7. Desactive la lisado mitocondrial por centrifugación dos veces a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C; conservando el sobrenadante aclarado cada vez.

3. Editosome Purificación

1. Verter 10 ml de un 10% -30% (v / v) de glicerol gradiente lineal (Tabla 1) en un tubo de ultracentrífuga usando tampón de gradiente de 2x HHE (40 mM de HEPES pH 7,9, 20 mM de Mg (OAc) _2, 100 mM KCl, y 2 mM EDTA) y una máquina de gradiente, siguiendo el manual de instrucciones.
2. Retire cuidadosamente 500 l de solución de la parte superior de la gradiente de glicerol y cargar suavemente 500 l de lisado mitocondrial despejado. Giran a 178.000 xg durante 6 horas a 4 ° C utilizando una ultracentrífuga.
3. Recoger fracciones de 500 l secuencialmente desde la parte superior a la parte inferior del gradiente a 4 ° C. Entonces complemento congelar las fracciones usando nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.

4. Preparación de ARN

1. Recocer el molde de ADN correspondiente que contiene la secuencia complementaria a la secuencia del promotor de T7 (Tabla 2) con un oligonucleótido promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') en una relación molar 1:1 por calentamiento a 90 ° C durante 3 min y enfriamiento a TA durante al menos 10 min.
2. Transcribir ARN usando un kit de transcripción in vitro siguiendo el manual de instrucciones.
3. Detenga la reacción de transcripción mediante la adición de un volumen igual de 7 M tinte urea (urea 7 M, 0,05% Xileno Cynol, y 0,05% Azul de bromofenol). Ejecutar en un filtro esterilizado 9% de desnaturalización en gel de poliacrilamida (9% de acrilamida, 7 M urea, 1x TBE).
4. Utilice la sombra la luz ultravioleta (UV) con una lámpara UV de onda corta para localizar e impuestos especiales correspondiente ARN. Coloque la pieza de gel escindido en un tubo de microcentrífuga y añadir 400 l de tampón de elución en gel (20 mM de Tris-HCl pH 7,5, mM de NaOAc 250, EDTA 1 mM y 0,25% de SDS). Eluir noche a temperatura ambiente en un mezclador de tubo.
5. PreciPitate el ARN se eluyó mediante la adición de 1 ml de etanol frío al 100% e incubando ya sea a -80 ° C durante 30 min o -20 ° C durante la noche.
6. Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C, para sedimentar por la ARN.
7. Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 75%. Centrifugar a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
8. Resuspender el sedimento de ARN apropiadamente en RNasa libre de agua para alcanzar las concentraciones deseadas, como se muestra en la Tabla 2.

5. Ensayo Edición de ARN basados ​​en fluorescencia

1. Para una sola reacción, combine 1 pmol (1 l) de preA6Rbz y 2,5 pmol (1 l) de gA6Rbz (relación molar 1:2,5) en un tubo de microcentrífuga, se incuba a 70 º C durante 3 minutos y dejar reposar a temperatura ambiente durante al menos 10 min.
2. Mientras tanto preparar una mezcla maestra usando la Tabla 3, sin la preA6Rbz y gA6Rbz, para la reacción de edición que contiene tampón 1x HHE (25 mM de HEPES pH 7,9, 10 mM de Mg (OAc) _2, KCl 50 mM y EDTA 10 mM), 1 mMATP, 5 mM de _CaCl2, 16 ng / l de ARN de levadura Torula, 0,1% de Triton X-100, y la editosome purificada.
3. Añadir recocido preA6Rbz y gA6Rbz para completar la mezcla maestra.
4. Dispensar 18 l de la mezcla maestra (Tabla 3) en los pocillos que contenían ya sea 2 l de agua libre de RNasa (pocillos sin compuestos) o 2 l de 200 compuestos químicos y M incluir muestras de control en la placa de acuerdo con la Figura 5.
5. Sellar la placa con un sellador de placas y hacer girar el plato, para eliminar cualquier burbuja de aire. Se incuba a 28 ° C durante 4 horas.
6. Añadir 25 pmol (2 l) de gA6Rbz competidor a cada pocillo. Colocar un sellador fresco, girar la placa de abajo y colocarlo en una máquina de PCR en tiempo real. Programar el siguiente experimento:
   Paso 1: 85 º C durante 5 min; Paso 2: 24 ° C durante 10 min; Paso 3: Detener.
7. Añadir 15 pmol (1 mu l) de sustrato de FRET a cada pocillo para un volumen final de 23 l. Sellar la placa con un sellador fresco.Girar rápidamente la placa y vuelva a colocarlo en la máquina en tiempo real PCR.
8. Programe un nuevo experimento con los siguientes pasos:
   Paso 1: 37 º C durante 1 min; Paso 2: Lee; Paso 3: Vaya al Paso 1, 40 veces; Paso 4: Detener.
9. Configuración de la placa mediante la selección de todos los pozos que requieren la lectura y eligen el filtro FAM. El volumen de entrada de hasta 23 l y empezar la carrera.
10. Calcular la pendiente de los valores obtenidos a partir de cada pocillo / muestra para obtener una medición cinética por el trazado de las pistas en un gráfico de barras para el análisis. NOTA: Una lectura cinética mejora la relación señal a ruido entre la muestra y el fondo; como el fondo de la muestra tendría una pendiente cercana a cero. Una lectura de punto final tiene un mayor ruido de fondo.

Resultados

Para demostrar los pasos necesarios para la creación de una pantalla de gran escala, las figuras 2-5 son experimentos de control representativos relacionados con la calidad del ensayo. Estos son experimentos de control esenciales para un ensayo consistente a lo largo de varios días de cribado o para la comparación de diferentes pantallas.

La evaluación de la relación señal-ruido de fluorescencia

Para garantizar la estabilid...

Discusión

Un método de cribado de alto rendimiento novedoso para identificar inhibidores contra el complejo de la edición de ARN de tripanosomas se presentó, proporcionando una nueva herramienta para el descubrimiento de fármacos para combatir enfermedades causadas por los tripanosomátidos. Ensayo FRET basado ribozima-ha sido ampliamente utilizado para diferentes propósitos ^20-22; Sin embargo, hemos utilizado la capacidad de ensayo de ribozima basada en FRET para el control in vitro de la activi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDM-79 Medium	Gibco by Life Technologies
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020	heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%	Sigma	H5533-10G
Penicillin-Streptomycin Sollution	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free	Roche	4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production system	Promega	P1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders	Fisher Scientific	K885300-0040
Gradient Master, ver 5.25	Biocomp	107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 ml	Beckman Coulter	344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392052
SW 41 Ti ROTOR	Beckman Coulter	331336
MicroSeal 'B' Seal, Seals	Biorad	MSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)	Bio Basic	A0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kg	Life Technologies	AM9902