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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Abstract

Notevoli progressi sono stati compiuti nel determinare il meccanismo mitocondriale RNA editing in trypanosomes. Allo stesso modo, sono stati compiuti notevoli progressi nell'identificazione dei componenti del complesso editosome che catalizzano RNA editing. Tuttavia, non è ancora chiaro come queste proteine ​​lavorino insieme. Composti chimici ottenuti da uno schermo ad alta velocità contro il editosome possono bloccare o influenzare una o più fasi del ciclo di editing. Pertanto, l'identificazione di nuovi composti chimici genererà sonde molecolari importanti per sezionare la funzione editosome e assemblaggio. In studi precedenti, in vitro saggi di modifica in sono stati effettuati utilizzando RNA radio-marcato. Questi test sono molto tempo, inefficace e inadatto per scopi di high-throughput. Qui, una con sede a fluorescenza omogenea "mix e misurare" martello ribozyme in vitro giornalista per monitorare RNA editing, viene presentato. Solo come conseguenza di RNA editing diil ribozyme martello una risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET) substrato oligoribonucleotide subisce scissione. Questo a sua volta provoca la separazione del fluoroforo dal quencher producendo così un segnale. Al contrario, quando la funzione editosome è inibita, si spegnerà il segnale di fluorescenza. Questo è un test altamente sensibile e semplice che dovrebbe essere generalmente applicabile per monitorare in vitro RNA editing o high throughput screening delle sostanze chimiche che possono inibire la funzione editosome.

Introduzione

Il processo di editing dell'RNA, una modifica mRNA post-trascrizionale, è stato scoperto nel trypanosomatids 1. Da allora, il lavoro sostanziale è stato condotto nello studio del meccanismo che sta dietro RNA editing in Trypanosoma brucei 2,3. In una serie di reazioni enzimatiche, la editosome, un complesso nucleo di circa 20 proteine, crea mRNA mitocondriali maturi per più componenti del sistema di fosforilazione ossidativa di generazione di energia. L'ordine degli eventi catalitici è scissione endonucleolitico, uridylate (U), aggiunta o cancellazione, e legatura, come dettato dalla RNA guida (gRNAs) 4.

Oltre al nucleo proteine ​​editosome complessi, un numero di fattori accessori sono stati anche identificati 5-7. Queste proteine ​​si osservano principalmente raggruppati in complessi indipendenti. Tuttavia, l'ordine di montaggio proteina nel complesso nucleo editosome e gli schemi di interazione del complesso nucleo con l'accessoriocomplessi sono ancora da determinare. Targeting il processo di editing RNA in trypanosomatids può prevedere dissettori chimici che aiuti a studiare l'assemblaggio e la funzione del complesso editosome. Inoltre, studi funzionali in diverse proteine ​​editosome hanno dimostrato l'essenzialità attraverso diverse fasi della vita, indicando la loro potenziale come bersagli farmacologici 8-12. Pertanto, gli inibitori trovate del editosome possono anche agire come composti di piombo contro trypanosomatids. Questo è tempestivo, in quanto i farmaci attualmente disponibili contro le malattie causate da trypanosomatid sono tossici, inefficiente e costoso 13,14.

Un test efficiente e conveniente in vitro è necessario per esplorare l'universo chimica per inibitori specifici che bloccano RNA editing. Tre saggi sono stati sviluppati e utilizzati per monitorare editosome attività: (a) ciclo completo in vitro RNA editing saggio di 15, (b) pre-spaccati in vitro RNA editing saggio di 16,17, unnd dosaggio 18 (c) martello ribozyme (HHR)-based. I primi due saggi si basano sulla visualizzazione diretta del prodotto modificato (ATPasi 6 mRNA) con l'aiuto di radioattività. Il saggio basato HHR utilizza una versione modificata del ATPasi 6 mRNA che viene modellato a comportarsi come un ribozima su editing. Il ribozima funzionale poi specificamente ad un substrato RNA radiomarcato, che serve come reporter. Recentemente, Moshiri et al. Sviluppato un 'mescolare e misurare' HHR-basato in vitro reporter per monitorare RNA editing dove il substrato RNA radiomarcato viene sostituito con un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) substrato 19. I vantaggi principali di questo saggio sono: (a) è un mix rapido e conveniente e misura tipo di dosaggio, come la produzione di ribozima attivo e substrato fenditura si verificano simultaneamente nella stessa provetta a basso volume (cioè 20 microlitri), (b ) evita l'uso di materiali marcati radioattivamente, (c) sensibilità che è unfforded da fluorescenza strumentazione in un formato di piastra di micro-titolazione, e (d) un alto rapporto segnale-rumore. Usando questo test, l'effetto di inibitori noti RNA editing ligasi contro editosome purificato è stato confermato 19. Questo esperimento convalidato il test per la rapida identificazione di inibitori di RNA editing, soprattutto contro editosomes interi da T. brucei.

La figura 1 è uno schema dettagliato passo-passo del saggio in vitro RNA editing basato sulla fluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato sia per il monitoraggio RNA editing in vitro o facilmente essere adattato per lo screening di librerie di composti di varie scale.

Protocollo

Il protocollo che segue descrive la procedura per eseguire il test RNA editing basato sulla fluorescenza. L'analisi può essere eseguita in un unico tubo PCR, 96 ben-, o 384 pozzetti a seconda del campo di applicazione dell'esperimento. Successivamente il segnale di fluorescenza può essere visualizzato su un sistema di rilevazione adeguato tempo reale PCR. Il saggio qui è descritta nel contesto di piastre a 384 pozzetti.

1. Culturing T. Le cellule brucei

  1. Preparare un terreno di coltura per T. brucei prociclico cellule formano. Per 1 L di terreno:
    1. Sciogliere 25.4 g SDM-79 polvere in acqua 800 ml miliQ.
    2. Aggiungere 2 g di NaHCO3 e il pH a 7,3 con NaOH 10 M.
    3. Aggiungere acqua Nanopure ad un volume finale di 900 ml, filtro sterilizzare.
    4. Aggiungere siero fetale bovino (FBS), penicillina-streptomicina soluzione e emina (2,5 mg / ml) a concentrazioni finali di 10% (v / v), 100 U / ml e 7,5 mg / L rispettivamente.
  2. Grow 300 ml di T. brucei 1.7A wild type (forma prociclico) le cellule a 28 ° C, si stringono a 70 giri per una densità di 1,5 x 10 7 cellule / ml. NOTA: Questo dovrebbe produrre 3 ml di editosome attivo con ~ 0,5 mg di proteine ​​totali, sufficienti per 600 reazioni di editing.
  3. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min a 4 ° C.
  4. Lavare il pellet con 50 ml di tampone PBSG refrigerati (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 145 mM NaCl e 6 mM di glucosio), e centrifugare le cellule di nuovo per centrifugazione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C.

2. Isolamento di greggio mitocondri

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite su ghiaccio oppure a 4 ° C per preservare editosome attività.

  1. Risospendere le cellule raccolte in 30 ml di tampone DTE (1 mM Tris-HCl pH 8,0 e EDTA 1 mM). Usare un 40 ml sterile omogeneizzatore Dounce (pre-refrigerata) per distruggere la membrana cellulare da accarezzare su e giù almeno 10 volte su ghiaccio.
  2. Immediatamente aggiungere 4,3 ml di 60% di saccarosio (w / v; cioè 1,75 M) al omogenato ad una concentrazione finale di 0,25 M. Centrifugare a 15.800 xg per 10 min a 4 ° C, per portare preferenzialmente giù mitocondri.
  3. Risospendere il pellet mitocondriale in 4,6 ml di tampone STM (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM saccarosio e 2 mM MgCl 2). Aggiungere 13,8 ml di 0,1 M CaCl 2 e 4 ml di DNasi I RNasi-free a concentrazioni finali di 0,3 mm e 9 U / ml, rispettivamente. Incubare la miscela per 1 ora su ghiaccio.
  4. Aggiungere 4,6 ml di tampone STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, saccarosio 250 mM e EDTA 2 mM) per inattivare la DNasi I. Centrifugare a 15.800 xg per 10 min a 4 ° C.
  5. Risospendere il pellet in 400 ml di tampone di lisi (10 mM Tris-HCl pH 7.2, 10 mM MgCl 2, KCl 100 mM, 1 mg / ml pepstatina, 1 mM DTT, e 1x completo inibitori della proteasi libero-EDTA) e trasferimento ad un provetta per microcentrifuga.
  6. Aggiungere 10% Triton X-100 ad una concentrazione finale di 1% and incubare il lisato per 15 min a 4 ° C su un rotatore tubo.
  7. Cancellare il lisato mitocondriale mediante centrifugazione due volte a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C; mantenendo il surnatante eliminato ogni volta.

3. Editosome Purificazione

  1. Versare 10 ml 10% -30% (v / v) di glicerolo gradiente lineare (Tabella 1) in un tubo un'ultracentrifuga utilizzando tampone gradiente HHE 2x (40 mM HEPES pH 7.9, 20 mM Mg (OAc) 2, KCl 100 mM, e 2 mM EDTA) e una macchinetta del gradiente seguendo il manuale di istruzioni.
  2. Rimuovere con cautela 500 ml di soluzione dalla parte superiore del gradiente di glicerolo e caricare delicatamente 500 ml di lisato mitocondriale eliminato. Spin a 178.000 xg per 6 ore a 4 ° C utilizzando un'ultracentrifuga.
  3. Raccogliere 500 microlitri frazioni sequenzialmente dall'alto verso il basso del gradiente a 4 ° C. Quindi far scattare congelare le frazioni utilizzando azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al loro utilizzo.

4. RNA Preparazione

  1. Ricuocere stampo di DNA contenente rispettiva sequenza complementare alla sequenza del promotore T7 (Tabella 2) con un oligonucleotide promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') in rapporto molare 1:1 in riscaldamento a 90 ° C per 3 min e raffreddamento a temperatura ambiente per almeno 10 min.
  2. Trascrivere RNA utilizzando un kit di trascrizione in vitro seguendo il manuale di istruzioni.
  3. Fermare la reazione di trascrizione con l'aggiunta di volume uguale di 7 M urea colorante (7 M urea, 0.05% xilene Cynol, e lo 0,05% blu di bromofenolo). Eseguito su un filtro sterilizzato 9% gel di poliacrilammide denaturante (9% acrilammide, 7 M urea, 1x TBE).
  4. Utilizzare il pedinamento raggi ultravioletti (UV) con una lampada UV ad onde corte per individuare e accise rispettivi RNA. Posizionare il pezzo gel asportata in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 400 ml di tampone di eluizione gel (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 NaOAc mM, EDTA 1 mM e 0,25% SDS). Eluire notte a RT su un rotatore tubo.
  5. Precipitate l'RNA eluito aggiungendo 1 ml di etanolo 100% freddo e incubando sia a -80 ° C per 30 minuti oa -20 ° C per una notte.
  6. Centrifugare a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C, per far sedimentare per RNA.
  7. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C.
  8. Risospendere il pellet di RNA opportunamente in acqua RNasi libero per ottenere le concentrazioni desiderate, come illustrato nella Tabella 2.

5. Sede a fluorescenza RNA Editing Assay

  1. Per una singola reazione, unire 1 pmol (1 ml) di preA6Rbz e 2,5 pmol (1 ml) di gA6Rbz (rapporto molare 1:2.5) in una provetta per microcentrifuga, incubare a 70 º C per 3 minuti e lasciate riposare a temperatura ambiente per almeno 10 min.
  2. Nel frattempo preparare un master mix utilizzando la Tabella 3, senza preA6Rbz e gA6Rbz, per la reazione di modifica contenente tampone 1x HHE (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl e EDTA 10 mM), 1 mMATP, 5 mM CaCl 2, 16 ng / ml di RNA Torula lievito, 0,1% Triton X-100, e il editosome purificata.
  3. Aggiungi ricotto preA6Rbz e gA6Rbz per completare il master mix.
  4. Pipettare 18 microlitri della miscela master (Tabella 3) in pozzetti contenente 2 ml di acqua priva di RNasi (pozzetti che non composti) o 2 ml di 200 mM composti chimici e comprendono campioni di controllo nella piastra di figura 5.
  5. Sigillare la piastra con un sigillante piastra e girare il piatto, per eliminare eventuali bolle d'aria. Incubare a 28 ° C per 4 ore.
  6. Aggiungere 25 pmol (2 microlitri) di gA6Rbz concorrente di ogni bene. Posizionare un sigillante fresco, girare il piatto e posizionarlo su una macchina PCR real-time. Programmare il seguente esperimento:
    Passo 1: 85 ° C per 5 min; Passo 2: 24 ° C per 10 min; Passo 3: Stop.
  7. Aggiungere 15 pmol (1 mL) di substrato FRET a ciascun pozzetto per un volume finale di 23 microlitri. Sigillare la piastra con un nuovo sigillante.Girare velocemente la piastra e rimetterlo sulla macchina PCR real-time.
  8. Programmare un nuovo esperimento con le seguenti operazioni:
    Passo 1: 37 ° C per 1 min; Fase 2: Leggi; Fase 3: Andare al passo 1, 40 volte; Fase 4: Stop.
  9. Installazione della piastra selezionando tutti i pozzi che richiedono la lettura e scegliere il filtro FAM. Volume d'ingresso come 23 microlitri e iniziare la corsa.
  10. Calcolare la pendenza dei valori ottenuti da ciascun / pozzetto per ottenere una misurazione cinetica riportando le piste su un grafico a barre per l'analisi. NOTA: Una lettura cinetica di migliorare il rapporto segnale-rumore tra il campione e lo sfondo; come il campione sfondo avrebbe una pendenza prossima allo zero. Un punto di lettura finale ha una maggiore rumore di fondo.

Risultati

Per dimostrare i passi necessari per la creazione di uno schermo di grandi dimensioni, le figure 2-5 sono gli esperimenti rappresentativi di controllo relative alla qualità del test. Questi sono esperimenti di controllo essenziali per un dosaggio costante per diversi giorni di screening o per il confronto di diversi schermi.

Valutare il segnale-rumore rapporto fluorescenza

Per garantire la stabilità e la qualità del substrato ...

Discussione

Un metodo di screening high-throughput romanzo per identificare inibitori contro il complesso RNA editing dei tripanosomi è stato presentato, fornendo un nuovo strumento per la scoperta di farmaci per combattere malattie causate da trypanosomatids. Test ribozyme-based FRET è stato ampiamente utilizzato per diversi scopi 20-22; Tuttavia, abbiamo utilizzato la capacità di dosaggio ribozima basato FRET per il monitoraggio di attività in vitro editing dell'RNA 19. Questa analisi potreb...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
SDM-79 MediumGibco by Life Technologies
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%SigmaH5533-10G
Penicillin-Streptomycin SollutionFisher ScientificMT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free Roche4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production systemPromegaP1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders  Fisher ScientificK885300-0040  
Gradient Master, ver 5.25 Biocomp107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 mlBeckman Coulter344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge Beckman Coulter392052
SW 41 Ti ROTORBeckman Coulter331336
MicroSeal 'B' Seal, SealsBioradMSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)Bio BasicA0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kgLife TechnologiesAM9902

Riferimenti

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