ARN catalyseur en tant que reporter pour le criblage de médicaments contre l'ARN Édition dans trypanosomes

Résumé

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Résumé

Des progrès substantiels ont été accomplis dans la détermination du mécanisme de l'édition de l'ARN mitochondrial chez les trypanosomes. De même, des progrès considérables ont été réalisés dans l'identification des composants du complexe de éditosome qui catalysent édition de l'ARN. Cependant, il n'est pas encore clair comment ces protéines fonctionnent ensemble. Les composés chimiques obtenus à partir d'un écran à haut débit contre la éditosome peuvent bloquer ou affecter une ou plusieurs étapes du cycle d'édition. Par conséquent, l'identification de nouveaux composés chimiques va générer des sondes moléculaires utiles pour disséquer la fonction de éditosome et l'assemblage. Dans des études antérieures, des essais in vitro de modification ont été réalisées en utilisant l'ARN radiomarqué. Ces tests prennent du temps, inefficace et inadapté à des fins à haut débit. Ici, une base de fluorescence homogène "mélanger et mesurer" marteau ribozyme test in vitro de reporter à surveiller édition de l'ARN, est présenté. Qu'à la suite de l'édition d'ARN d'le ribozyme en tête de marteau d'un substrat de oligoribonucléotide transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) subit un clivage. Ceci à son tour conduit à la séparation du fluorophore de l'agent d'extinction en produisant ainsi un signal. En revanche, lorsque la fonction de éditosome est inhibé, le signal de fluorescence est éteinte. Il s'agit d'un test très sensible et simple qui devrait être généralement applicables à surveiller dans l'édition de l'ARN in vitro ou criblage à haut débit de produits chimiques qui peuvent inhiber la fonction de éditosome.

Introduction

Le processus d'édition de l'ARN, une modification de l'ARNm post-transcriptionnelle, a été découvert en trypanosomatidés ^1. Depuis lors, d'importants travaux ont été réalisés en étudier le mécanisme derrière édition de l'ARN chez T. brucei ^2,3. Dans une série de réactions enzymatiques, la éditosome, un complexe de base de l'ordre de 20 protéines, crée des ARNm matures mitochondriales pour plusieurs composants du système de la phosphorylation oxydative de la production d'énergie. L'ordre des événements est catalytiques clivage endonucléolytique, uridylate (U) ajout ni suppression, et la ligature, comme dicté par ARN guides (ARNg) ^4.

En plus des protéines essentielles éditosome complexes, un certain nombre de facteurs accessoires ont également été identifiés ^5-7. Ces protéines sont observés essentiellement regroupés dans les complexes indépendants. Cependant, l'ordre d'assemblage des protéines dans le complexe de éditosome de base et les modèles d'interaction du complexe de base de l'accessoirecomplexes sont encore à déterminer. Cibler le processus d'édition de l'ARN dans trypanosomatidés peut fournir aux ciseaux chimiques que l'aide à l'étude de l'assemblage et de la fonction du complexe éditosome. En outre, des études fonctionnelles sur plusieurs protéines éditosome ont montré essentialité dans les différents stades de la vie, en indiquant leur potentiel en tant que médicament cible ^8-12. Par conséquent, les inhibiteurs de la éditosome trouvés peuvent également agir en tant que composés de plomb contre trypanosomatidés. C'est rapide, comme les médicaments actuellement disponibles contre les maladies causées par trypanosomatide sont toxiques, inefficace et coûteux ^13,14.

Un essai in vitro efficace et pratique est nécessaire d'explorer l'univers chimique d'inhibiteurs spécifiques qui bloquent édition de l'ARN. Trois tests ont été mis au point et utilisé pour surveiller éditosome activités: (a) tour complet test in vitro de l'édition de l'ARN ^15, (b) pré-coupés test in vitro de l'édition de l'ARN ^16,17, une (c) ribozyme en tête de marteau (RHS) à base de dosage ^18. Les deux premiers essais reposent sur la visualisation directe du produit modifié (ATPase six ARNm) avec l'aide de la radioactivité. L'analyse basée sur la HHR utilise une version modifiée de l'ATPase 6 ARNm qui est modélisée à se comporter comme un ribozyme à l'édition. Le ribozyme fonctionnelle clive ensuite spécifiquement un substrat d'ARN radiomarqué, servant en tant que journaliste. Récemment, Moshiri et al. Développé un "mélange et mesure" HHR-fondé en essai rapporteur in vitro pour surveiller édition de l'ARN, où le substrat de l'ARN radiomarqué est remplacé par un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) du substrat ^19. Les principaux avantages de ce dosage sont les suivants: (a) il s'agit d'un mélange rapide et commode et le type de dosage de mesure, comme la production de ribozyme actif et clivage du substrat se produisent simultanément dans le même tube à faible volume (20 ul), (b ) elle permet d'éviter l'utilisation de matières radiomarquées, (c) la sensibilité qui est unfforded par fluorescence instrumentation dans un format de plaque de micro-titrage, et (d) un signal de niveau haut par rapport au bruit. En utilisant ce dosage, l'effet des inhibiteurs connus de l'ARN ligase de montage de contre éditosome purifié a été confirmée ^19. Cette expérience a validé le test pour l'identification rapide des inhibiteurs de l'édition de l'ARN, principalement contre editosomes entiers de T. brucei.

La figure 1 est un schéma détaillé étape par étape de l'essai in vitro de l'édition de l'ARN à base de fluorescence. Ce protocole peut être utilisé soit pour la surveillance de l'édition de l'ARN in vitro ou facilement être adapté pour le criblage de banques de composés de diverses échelles.

Protocole

Le protocole ci-dessous décrit la procédure pour effectuer l'ARN essai de montage à base de fluorescence. Le dosage peut être effectué dans un seul tube de PCR, 96 puits ou 384 puits en fonction de la portée de l'expérience. Ensuite, le signal de fluorescence peut être lu sur un système de détection de PCR en temps réel approprié. Le dosage est décrit ici dans le contexte de plaques à 384 puits.

1. T. La culture Les cellules brucei

1. Préparer un milieu de croissance de T. brucei procyclique forment des cellules. Pour 1 litre de milieu:
   1. Dissoudre SDM-79 poudre de 25,4 g dans l'eau de 800 ml.
   2. Ajouter 2 g de NaHCO ₃ et pH à 7,3 avec du NaOH 10.
   3. Ajouter de l'eau nanopure jusqu'à un volume final de 900 ml, stériliser par filtration.
   4. Ajouter de sérum bovin fœtal (FBS), de la pénicilline-streptomycine et de la solution d'hémine (2,5 mg / ml) à des concentrations finales de 10% (v / v), 100 U / ml et 7,5 mg / L respectivement.
2. Cultivez 300 ml de T. brucei 1.7A type sauvage (de forme procyclique) cellules à 28 ° C, en agitant à 70 tours par minute à une densité de 1,5 x 10 ⁷ cellules / ml. NOTE: Ceci devrait produire 3 ml de éditosome actif avec ~ 0,5 mg de protéine totale, suffisante pour 600 réactions de modification.
3. Récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
4. Laver le culot avec 50 ml de tampon de PBSG refroidi (10 mM de Na ₂ HPO _4, 10 mM de NaH ₂ PO _4, NaCl 145 mM et glucose 6), et centrifuger les cellules à nouveau par centrifugation à 10 000 xg pendant 10 min à 4 ° C.

2. Isolement des mitochondries brut

NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace ou à 4 ° C pour préserver éditosome activité.

1. Remettre en suspension les cellules récoltées dans 30 ml de tampon DTE (1 mM Tris-HCl pH 8,0 et 1 mM EDTA). Utilisez un 40 ml stérile homogénéisateur Dounce (pré-réfrigérées) pour perturber la membrane cellulaire en caressant de haut en bas au moins 10 fois sur la glace.
2. Immédiatement ajouter 4,3 ml de saccharose à 60% (poids / volume, c'est à dire 1,75 M) à l'homogénat à une concentration finale de 0,25 M. Centrifuger à 15 800 g pendant 10 min à 4 ° C, de préférence vers le bas pour amener les mitochondries.
3. Reprendre le culot mitochondrial dans 4,6 ml de tampon STM (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM de saccharose et 2 mM de _MgCl2). Ajouter 13,8 ul de 0,1 M de _CaCl2 et 4 ul de DNase sans RNase I à des concentrations finales de 0,3 mM et de 9 U / ml, respectivement. Faire incuber le mélange pendant 1 heure sur de la glace.
4. Ajouter 4,6 ml de tampon STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM de saccharose et de l'EDTA 2 mM) pour inactiver la DNase I. Centrifuger à 15 800 g pendant 10 min à 4 ° C.
5. Remettre en suspension le culot dans 400 pl de tampon de lyse (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl _2, 100 mM de KCl, 1 ug / ml de pepstatine, 1 mM de DTT, et l'inhibiteur de protéase de 1x complet sans EDTA) et le transfert à un tube de centrifugeuse.
6. Ajouter 10% de Triton X-100 à une concentration finale de 1% parnd incuber le lysat pendant 15 minutes à 4 ° C sur un agitateur de tubes.
7. Désactivez le lysat mitochondrial par centrifugation à deux reprises à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C; en conservant le surnageant clarifié chaque fois.

3. Éditosome Purification

1. Verser 10 ml de 10% -30% (v / v) gradient linéaire de glycérol (tableau 1) dans un tube d'ultracentrifugation en utilisant un tampon à gradient 2x HHE (40 mM HEPES pH 7,9, mM de Mg 20 (OAc) _2, 100 mM de KCl, et 2 mM EDTA) et une machine à gradient en suivant le manuel d'instruction.
2. Retirez délicatement 500 pi de solution à partir du haut de la pente de glycérol et charger doucement 500 pi du lysat mitochondrial dégagé. Spin à 178 000 g pendant 6 heures à 4 ° C en utilisant une ultracentrifugation.
3. Collecter des fractions de 500 ul de manière séquentielle à partir du haut vers le bas de la pente à 4 ° C. Puis enclenchez geler les fractions en utilisant de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.

4. Préparation de l'ARN

1. Recuire la matrice d'ADN respective contenant une séquence complémentaire de T7 séquence promotrice (tableau 2) avec un oligonucléotide promoteur T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') dans un rapport molaire de 1:1 par chauffage à 90 ° C pendant 3 min et le refroidissement à la température ambiante pendant au moins 10 min.
2. Transcrire l'ARN en utilisant un kit de transcription in vitro en suivant le manuel d'instruction.
3. Arrêter la réaction de transcription en ajoutant un volume égal d'urée 7 M colorant (7 M d'urée, 0,05% Xylène Cynol, et 0,05% de bleu de bromophénol). Fonctionner sur un filtre stérilisé à 9% gel de polyacrylamide dénaturant (9% d'acrylamide, urée 7 M, TBE 1x).
4. Utilisez l'observation ultraviolet (UV) avec une lampe UV à ondes courtes pour localiser et accise ARN respectif. Placer le morceau de gel excisée dans un tube de centrifugeuse et ajouter 400 ul de tampon d'élution de gel (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM de NaOAc, EDTA 1 mM et SDS 0,25%). Éluer nuit à température ambiante sur un agitateur de tube.
5. Precipitate élue l'ARN en ajoutant 1 ml d'éthanol à 100% froid et incubation soit à -80 ° C pendant 30 min ou à -20 ° C pendant une nuit.
6. Centrifuger à 16 000 g pendant 30 min à 4 ° C, pour former un culot vers le bas de l'ARN.
7. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifuger à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
8. Remettre en suspension le culot d'ARN de manière appropriée dans l'eau exempte de RNase pour atteindre les concentrations désirées, comme indiqué dans le tableau 2.

5. Base de fluorescence test ARN édition

1. Pour une seule réaction, combiner 1 pmol (1 pi) de preA6Rbz et 2,5 pmol (1 pi) de gA6Rbz (rapport molaire 1:2,5) dans un tube de centrifugeuse, incuber à 70 º C pendant 3 minutes et laisser reposer à température ambiante pendant au moins de 10 min.
2. Pendant ce temps préparer un mélange maître en utilisant le tableau 3, sans le preA6Rbz et gA6Rbz, pour la réaction de l'édition contenant un tampon 1x HHE (25 mM HEPES pH 7,9 mM Mg 10 (OAc) _2, KCl 50 mM et 10 mM d'EDTA), 1 mMATP, 5 mM de _CaCl2, 16 ng / ul d'ARN de levure Torula, 0,1% de Triton X-100, et le éditosome purifiée.
3. Ajouter recuit preA6Rbz et gA6Rbz pour compléter le mélange maître.
4. Distribuer 18 ul de la solution mère (Tableau 3) dans les puits contenant soit 2 ul d'eau exempte de RNase (puits sans composés) ou 2 pi de 200 composés uM chimiques et comprennent des échantillons de contrôle de la plaque selon la Figure 5.
5. Sceller la plaque avec un scellant pour plaques et tourner la plaque vers le bas, pour éliminer les bulles d'air. Incuber à 28 ° C pendant 4 heures.
6. Ajouter 25 pmol (2 pi) de gA6Rbz concurrent à chaque puits. Placez un nouveau scellant, tourner la plaque et placez-le sur une machine de PCR en temps réel. Programmer l'expérience suivante:
   Etape 1: 85 ° C pendant 5 min; Etape 2: 24 ° C pendant 10 min; Étape 3: Arrêtez.
7. Ajouter 15 pmol (1 pi) de substrat FRET à chaque puits pour un volume final de 23 ul. Sceller la plaque avec un nouveau scellant.Tourner rapidement la plaque et le replacer sur la machine PCR en temps réel.
8. Programmer une nouvelle expérience avec les étapes suivantes:
   Etape 1: 37 ° C pendant 1 min; Étape 2: Lire; Étape 3: Passez à l'étape 1, 40 fois; Étape 4: Stop.
9. Configuration de la plaque en sélectionnant tous les puits qui nécessitent la lecture et de choisir le filtre de FAM. Le volume d'entrée que 23 pi et commencer la course.
10. Calculer la pente des valeurs obtenues à partir de chaque / puits d'échantillon pour obtenir une mesure cinétique en traçant des pistes sur un graphique à barres pour l'analyse. REMARQUE: La lecture cinétique améliore le rapport signal-sur-bruit entre l'échantillon et l'arrière-plan; que l'échantillon de fond aurait une pente proche de zéro. Un point de lecture de fin a plus de bruit de fond.

Résultats

Pour démontrer les étapes nécessaires pour la mise en place d'un écran de grande envergure, les figures 2-5 sont des expériences de contrôle représentatifs liés à la qualité de l'analyse. Ce sont des expériences de contrôle essentielles pour une analyse cohérente sur plusieurs jours de dépistage ou de comparaison des différents écrans.

Évaluer le ratio fluorescence signal-bruit

Pour assurer la stabilité ...

Discussion

Une méthode de criblage à haut débit roman pour identifier des inhibiteurs contre le complexe d'édition de l'ARN de trypanosomes a été présenté, en fournissant un nouvel outil pour la découverte de médicaments pour lutter contre les maladies causées par trypanosomatidés. Dosage de ribozyme à base de FRET a été largement utilisé à des fins différentes ^{de 20 à 22;} Cependant, nous avons utilisé le test de capacité de ribozyme à base de FRET pour la surveillance in vitro de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDM-79 Medium	Gibco by Life Technologies
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020	heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%	Sigma	H5533-10G
Penicillin-Streptomycin Sollution	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free	Roche	4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production system	Promega	P1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders	Fisher Scientific	K885300-0040
Gradient Master, ver 5.25	Biocomp	107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 ml	Beckman Coulter	344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392052
SW 41 Ti ROTOR	Beckman Coulter	331336
MicroSeal 'B' Seal, Seals	Biorad	MSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)	Bio Basic	A0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kg	Life Technologies	AM9902