Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst

Özet

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Özet

Önemli bir ilerleme trypanosom mitokondriyal RNA düzenleme mekanizmasını belirleyen yapılmıştır. Benzer bir şekilde, önemli bir ilerleme RNA düzenlemeyi katalize editosome kompleksin bileşenleri tespit yapılmıştır. Ancak, bu proteinlerin nasıl birlikte çalıştığını hala net değildir. Editosome karşı yüksek verimli bir ekrandan edilen kimyasal bileşikler, düzenleme çevrimi içinde bir veya daha fazla aşamasını bloke eden ya da etkileyebilir. Bu nedenle, yeni kimyasal bileşiklerin tanımlanması editosome fonksiyonu ve kesme düzeneği için değerli moleküler problar üretecektir. Önceki çalışmalarda, in vitro deneyler, düzenleme, radyo-etiketli RNA kullanılarak gerçekleştirildi. Bu deneyler zaman verimsiz ve yüksek verimli amaçlar için uygun, alıcıdır. Burada, homojen floresans-esaslı "karıştır ve ölçmek" RNA düzenleme izlemek için bir çekiç ribozim in vitro haberci deneyi sunulmuştur. Sadece bir RNA düzenleme bir sonucu olarakçekiç ribozim, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) oligonükleotid alt-tabaka bölünme geçirmektedir. Bu da, böylece bir sinyal üreten söndürücüden fluorofor ayrılması ile sonuçlanır. Editosome fonksiyonu bloke edildiğinde aksine, floresans sinyali söndürülür olacaktır. Bu in vitro RNA ya da düzenleme editosome fonksiyonunu inhibe kimyasallar yüksek yayılımlı tarama esnasında izlenmesi için genel olarak uygulanabilir olması gerekir, son derece hassas ve basit bir testtir.

Giriş

RNA düzenleme, bir post-transkripsiyonel mRNA modifikasyon bir işlem olup, ilk tripanosomatidlerde ¹ keşfedilmiştir. O zamandan beri, önemli iş Tiypanosoma brucei ^2,3 RNA düzenleme arkasındaki mekanizmayı inceleyerek yapılmıştır. Enzimatik reaksiyonlar bir dizi olarak, editosome, yaklaşık 20 protein bir çekirdek kompleksi, enerji üretim oksidatif fosforilasyon sisteminin çoklu bileşenleri için olgun mRNA mitokondriyal oluşturur. Katalitik olayların sırası kılavuzu RNA'lar (gRNAs) tarafından dikte gibi, endonükleolitik bölünme, üridilat (U) ekleme veya silme, ve ligasyon ^4.

Çekirdek editosome kompleks proteinlerine ilave olarak, yardımcı bir dizi faktör de ^5-7 tespit edilmiştir. Bu proteinler daha çok bağımsız kompleksleri gruplandırılmıştır görülür. Ancak, çekirdek editosome kompleks protein montaj sırası ve aksesuar ile çekirdek kompleks etkileşim kalıplarıkompleksleri belirlenecek henüz. Tripanosomatidlerde RNA düzenleme işlemini hedefleme kimyasal Disektörler sağlayabilir ki editosome kompleksinin oluşumu ve işlevi okuyan yardım. Ayrıca, birkaç editosome proteinler üzerinde fonksiyonel çalışmalar ilaç ^8-12 hedef olarak potansiyellerini gösteren, farklı yaşam evrelerinde genelinde zorunluluk göstermiştir. Bu nedenle, editosome en bulunan inhibitörleri aynı zamanda tripanosomatidlerde karşı kurşun bileşikleri olarak hareket edebilir. Tripanosomatid neden olduğu hastalıklara karşı mevcut ilaçlar, toksik verimsiz ve ^13,14 pahalı gibi bu, zamanında.

Bir etkili ve uygun in vitro deney RNA düzenlemeyi engelleyen özel inhibitörler için kimyasal evreni keşfetmek için gereklidir. Üç deneyleri geliştirilmiş ve editosome aktivitelerini izlemek için kullanılmıştır: vitro RNA düzenleme tahlilinde ¹⁵ (a) tam yuvarlak, (b) in vitro RNA düzenleme tahlilinde ^16,17, ön ayrıldı and (c) çekiç ribozimi (HHR) deneyi ^18-tabanlı. İlk iki deney radyoaktivite yardımıyla düzenlenmiş ürün (ATPase 6 mRNA) doğrudan görselleştirme dayanır. HHR-bazlı analiz düzenleme üzerine bir Ribozim davranmasına modellenmiştir ATPaz 6 mRNA değiştirilmiş bir sürümünü kullanır. Fonksiyonel Ribozim sonra özellikle bir muhabir olarak hizmet veren, radyo etiketli RNA substrat Cleaves. Son zamanlarda, Moshiri'nin et al. Geliştirilmiş bir 'karışımı ve ölçmek' radyo işaretli RNA alt-tabaka, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) alt-tabaka ¹⁹ ile değiştirildiği burada RNA düzenleme izlemek için in vitro tahlilinde raportör HHR-göre. Bu testin prensibi avantajlar şunlardır: (a) aktif ribozim ve alt-tabaka bölünme üretim düşük hacimli (örneğin 20 ul) aynı tüp içerisinde aynı anda meydana gibi, hızlı ve uygun bir karışım ve tahlilin ölçmek tür, (b ) bu radyoaktif etiketli malzemelerin kullanımı önler, (c) bir hassasiyeti olduğufloresan bir mikro-titre plaka biçiminde enstrümantasyon, ve (d)-gürültü oranı yüksek bir sinyal ile fforded. Bu tayin kullanılarak, saflaştırılmış editosome karşı bilinen RNA ligaz düzenleme inhibitörlerinin etkisi ^19, teyit edilmiştir. Bu deney esas olarak T'den bütün editosomes karşı, RNA düzenleme önleyicilerinin hızlı tespit edilmesi için tahlil doğrulanmış brucei.

Şekil 1 ayrıntılı bir adım adım şemadır flüoresan bazlı vitro RNA düzenleme deneyde gösterilebilir. Bu protokol, ya in vitro RNA ya da düzenleme izleme kolayca çeşitli ölçekler bileşik kütüphanelerinin taranması için adapte edilmesi için kullanılabilir.

Protokol

Aşağıdaki protokol floresan RNA dayalı düzenleme tahlilini yapmak için prosedür açıklanmaktadır. Deney, tek bir PCR tüpü, deney kapsamına bağlı olarak, 96 oyuklu, veya 384 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Daha sonra, floresans sinyali uygun bir gerçek zamanlı PCR algılama sistemi üzerinde okunabilir. Burada deney 384 oyuklu plakalar bağlamında tarif edilmektedir.

1.. Kültürleme T. brucei Hücreler

1. T. için bir büyüme ortamı hazırlayın brucei formu hücreleri procyclic. Ortamı, 1 L için:
   1. 800 ml'lik mili Q suyu içinde 25.4 g SDM-79 tozu çözülür.
   2. 10 M NaOH ile 7.3 'e 2 NaHCO ₃ g ve pH ekleyin.
   3. 900 ml, filtre ile sterilize bir son hacme nanopure su ekleyin.
   4. % 10 son konsantrasyonlara Fetal Bovine Serum (FBS), penisilin-streptomisin çözeltisi ve hemin (2.5 mg / ml) (v / v), 100 U / ml ve 7.5 mg / L idi.
2. T <300 ml büyümekem> 1.5 x 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir yoğunluğa kadar 70 rpm'de çalkalanarak 28 ° C'de brucei 1.7A vahşi tip (procyclic form) hücreleri. Not: Bu aktif editosome 3 ml üretmelidir ~ 600 düzenleme reaksiyonlar için yeterli toplam protein, 0.5 mg.
3. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj ile hücreler hasat
4. Soğutulmuş PBSG tamponu, 50 ml (10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, 145 mM NaCl ve 6 mM glukoz) ile pelet yıkayın ve 10 dk için 10,000 x g'de santrifüj ile tekrar hücrelerin aşağı spin 4 ° C.

Ham Mitokondri 2.. İzolasyonu

Not: Tüm adımlar editosome aktivitesini korumak için buz üzerinde ya da 4 ° C'de gerçekleştirilmelidir.

1. DTE tamponu, 30 ml (1 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 1 mM EDTA) içinde yeniden süspanse hasat edilen hücreler. Yukarı okşayarak ve aşağı buz üzerinde en az 10 defa hücre zarı bozmak için bir 40 ml steril Dounce homojenleştirici (pre-soğutulmuş) kullanın.
2. Tercihen mitokondri çökertmek için, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15.800 x g'de 0.25 M. Santrifüj bir son konsantrasyon elde etmek için homojenat için hemen 4.3 ml,% 60 sukroz (örneğin, 1.75 M w / v) ekleyin.
3. STM tampon maddesi (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM sukroz ve 2 mM _MgCI2) 4.6 ml mitokondriyal pelletini. I, sırasıyla 0.3 mM ve 9 U / ml nihai konsantrasyonda 0.1 M _CaCI2 13.8 ul ve RNase-barındırmayan DNase 4 ul ekleyin. Buz üzerinde 1 saat için karışımın inkübe edin.
4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15,800 xg'de DNase I Santrifüjü etkisiz hale getirmek için STE tampon 4,6 ml (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM sukroz ve 2 mM EDTA) ekleyin
5. 400 ul liziz tamponu (10 mM Tris-HCl pH 7.2, 10 mM _MgCl2, 100 mM KCI, 1 ug / ml pepstatin, 1 mM DTT, ve 1 x tam EDTA içermeyen proteaz inhibitörü) ve bir transfer pelletini mikrofüj tüpü.
6. % 1 a bir nihai konsantrasyona kadar% 10 Triton X-100 eklemend bir boru döndürücüde 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe lizat.
7. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g santrifüj ile iki kez mitokondriyal lizat temizleyin; temizlenmiş süpernatan her tutma.

3.. Editosome Arıtma

1. Dökün 10 ml 10% -30% (40 mM HEPES pH 7.9, 20 mM Mg (OAc) _2, 100 mM KCl 2x HHE gradyan tamponu kullanılarak, bir ultra santrifüj tüp içinde (v / v) gliserol lineer gradyan (Tablo 1), ve 2 mM EDTA) ve kullanma kılavuzunu takip ederek bir degrade yapımcısı.
2. Dikkatlice gliserol gradyanın tepesinden çözeltisi 500 ul çıkarıp hafifçe silinir mitokondriyal lizat 500 ul yükleyin. Ultrasantrifüj işlemi kullanılarak 4 ° C'de 6 saat boyunca 178,000 x g'de Spin.
3. 4 ° C 'de, gradyanın alt üst sıralı 500 ul fraksiyonlar toplamak Sonra kullanıma kadar -80 ° C'de sıvı azot ve mağaza kullanarak kesirler dondurma oturtun.

4. RNA hazırlanması

1. 3 dakika boyunca 90 ° C'de ısıtma ile 1:1 'lik bir mol oranında, bir T7 yükseltici oligonükleotid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3') ile T7 promotörü dizisi (Tablo 2) tamamlayıcı bir sekansı içeren ve oda sıcaklığında soğutulduktan ilgili DNA şablonu tavlama en az 10 dakika karıştırıldı.
2. Kullanım kılavuzunu takip ederek in vitro transkripsiyon kiti kullanılarak RNA'yı.
3. 7 M üre boya (7 M üre,% 0.05 ksilen Cynol ve% 0.05 bromofenol mavisi) eşit hacmi eklenerek transkripsiyon reaksiyonu durdurun. 9% poliakrilamid jel (% 9 akrilamid, 7 M üre, 1 x TBE) denatüre steril bir filtre üzerinde çalıştırın.
4. Bir bulmak için kısa dalga boylu UV lamba ve tüketim ilgili RNA ile ultraviyole (UV) gölgeleme kullanın. Bir mikrofüj tüpüne eksize jel parça koyun ve jel elüsyon tampon 400 ul (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA ve% 0.25 SDS) ekleyin. Bir tüpü rotatifine oda sıcaklığında gece boyunca Zehir.
5. Precisoğuk% 100 etanol içinde 1 ml ilave edildi ve 30 dakika, -20 ° C, gece boyunca -80 ° C'de ya da inkübe edilerek elüe RNA pitate.
6. RNA aşağı pelet 4 ° C'de 30 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin.
7. % 75 etanol içinde 1 ml pelet yıkayın. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüje
8. Tablo 2'de gösterildiği gibi, istenen konsantrasyonları elde etmek için RNase içermeyen su içinde uygun bir RNA topağı yeniden süspanse edin.

5. Floresans tabanlı RNA Düzenleme Testi

1. Tek bir reaksiyon için, bir mikrofuj tüp içinde preA6Rbz 1 pmol (1 ul) ve 2.5 pmol gA6Rbz (1 ul) (1:2.5 mol oranı) bir araya 3 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edilir ve bu da oda sıcaklığında bekletin en az 10 dak.
2. Bu arada (25 mM HEPES pH 7.9, 10 mM Mg (OAc) _2, 50 mM KCI ve 10 mM EDTA), 1 mM 1x HHE tampon içeren düzenleme reaksiyonu için, preA6Rbz ve gA6Rbz olmadan Tablo 3 kullanarak bir ana karışım hazırlamakATP, 5 mM _CaCl2, Torula maya RNA,% 0.1 Triton X-100 ve saflaştırılmış editosome 16 ng / ml.
3. Ana karışımı tamamlamak için tavlı preA6Rbz ve gA6Rbz ekleyin.
4. RNase içermeyen su 2 ul (no bileşikleri ile kuyu) veya 200 uM kimyasal bileşiklerin birinin veya 2 ul birini içeren kuyu içine ana karışımı (Tablo 3) 18 ul koyun ve şekil 5'e göre olan bir plaka içerisinde kontrol örneklerini içerir.
5. Bir plaka kapatıcı ile plaka Seal ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için aşağı plaka döndürün. 4 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edilir.
6. Her bir oyuğa gA6Rbz yarışmacının 25 pmol (2 ul) ilave edin. Plakayı aşağı spin ve gerçek-zamanlı PCR makinesine koyun, taze bir mühürleyen yerleştirin. Aşağıdaki deney Programı:
   Adım 1: 5 dakika boyunca 85 ° C; Adım 2: 10 dakika boyunca 24 ° C; Adım 3: kes.
7. 23 ul son hacim olması için her bir oyuğa FRET alt-tabakanın 15 pmol (1 ul) ilave edin. Taze bir mühürleyen ile plaka mühür.Çabuk plaka spin ve real-time PCR makinede geri yerleştirin.
8. Aşağıdaki adımlara yeni bir deneme Programı:
   Adım 1: 1 dakika için 37 ° C; Adım 2: oku; Adım 3: 1, 40 kez Git Adım; Adım 4: durdurun.
9. Okuma gerektiren ve FAM filtresi seçmek tüm kuyuları seçerek Kur plaka. 23 ul ve çalışma başlatmak gibi giriş seviyesi.
10. Analizi için bir çubuk grafik üzerinde yamaçları çizilerek kinetik bir ölçümünü elde etmek için her bir oyuğa / numuneden elde edilen değerlerin eğimi hesaplanır. NOT: Bir kinetik okuma numune ve arka plan arasındaki sinyal-gürültü oranını iyileştirir; arkaplan örneği sıfıra yakın bir eğime sahip gibi. Bir uç nokta okuma yüksek bir arka plan gürültü vardır.

Sonuçlar

Büyük çaplı bir ekranı set edilmesi için gereken gerekli adımları göstermek için, 2-5 tahlilin kalitesine ilişkin temsili kontrol deneyleri Şekil. Bu tarama birkaç gün boyunca tutarlı bir deney için ya da farklı ekranlar karşılaştırılması için gerekli kontrol deneyleri bulunmaktadır.

Floresan Sinyal-gürültü Oranı değerlendirilmesi

Büyük çaplı bir kurulumunda fosforla etiketlenmi?...

Tartışmalar

Trypanosom RNA düzenleme kompleksine karşı inhibitörlerini teşhis etmek için yeni bir yüksek veri akışı tarama yöntemi tripanosomatidlerde neden olduğu hastalıkların karşı ilaç keşfi için yeni bir araç temin sunuldu. FRET tabanlı tahlil ribozim yaygın olarak farklı amaçlar ^20-22 için kullanılmıştır; ancak, RNA düzenleme aktivitesi ¹⁹ in vitro izlenmesi için FRET bazlı ribozim tahlilin kapasitesini kullanılmıştır var. Bu deney, potansiyel olarak, memelile...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDM-79 Medium	Gibco by Life Technologies
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020	heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%	Sigma	H5533-10G
Penicillin-Streptomycin Sollution	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free	Roche	4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production system	Promega	P1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders	Fisher Scientific	K885300-0040
Gradient Master, ver 5.25	Biocomp	107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 ml	Beckman Coulter	344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392052
SW 41 Ti ROTOR	Beckman Coulter	331336
MicroSeal 'B' Seal, Seals	Biorad	MSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)	Bio Basic	A0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kg	Life Technologies	AM9902