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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Zusammenfassung

Erhebliche Fortschritte bei der Bestimmung des Mechanismus der mitochondrialen RNA-Editing in Trypanosomen gemacht worden. Ebenso hat erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung der Komponenten des editosome Komplex, der RNA-Editing katalysieren gemacht worden. Es ist jedoch noch nicht klar, wie diese Proteine ​​zusammen zu arbeiten. Von einem Hochdurchsatz-Screening gegen die editosome erhalten Chemische Verbindungen können blockieren oder beeinträchtigen einen oder mehrere Schritte im Bearbeitungszyklus. Daher wird die Identifizierung von neuen chemischen Verbindungen wertvolle molekulare Sonden zur Zerlegung der editosome Funktion und Anordnung zu erzeugen. In früheren Studien wurden in vitro-Assays unter Verwendung von Bearbeitungsradioaktiv markierten RNA durchgeführt. Diese Assays sind zeitaufwendig, ineffizient und für Hochdurchsatz-Zwecke ungeeignet. Hier eine homogene Fluoreszenz-basierten "zu mischen und zu messen" Hammerhead-Ribozym in-vitro-Reporter-Assay von RNA-Editing zu überwachen, wird vorgestellt. Nur als Folge von RNA-Editingdas Hammerhead-Ribozym ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Substrat Oligoribonukleotid Spaltung erfährt. Dies führt wiederum zu einer Trennung des Fluorophors vom Quencher, wodurch ein Signal erzeugt wird. Im Gegensatz dazu, wenn die editosome Funktion gesperrt ist, wird das Fluoreszenzsignal gelöscht werden. Dies ist eine sehr empfindliche und einfache Tests, der allgemein für in vitro-RNA-Editing oder Hochdurchsatz-Screening von Chemikalien, die die editosome Funktion hemmen können überwacht werden sollte.

Einleitung

Der Prozess der RNA-Editing, ein Post-Transkriptions mRNA Änderung, wurde zuerst in Trypanosomatiden 1 entdeckt. Seitdem hat umfangreiche Arbeit bei der Untersuchung der Mechanismus hinter RNA-Editing in Trypanosoma brucei 2,3 durchgeführt. In einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die editosome ein Kernkomplex von etwa 20 Proteinen, erstellt reifen mitochondrialen mRNAs für mehrere Komponenten der oxidativen Phosphorylierung Energieerzeugungssystems. Die Reihenfolge der Ereignisse ist endonukleolytische katalytische Spaltung Uridylat (U) Hinzufügen oder Löschen, und Ligation, wie durch Führungs RNAs (gRNAs) diktiert 4.

Neben den Kern editosome komplexe Proteine ​​haben eine Reihe von Hilfsfaktoren auch identifiziert 5-7. Diese Proteine ​​sind meist gesehen in unabhängigen Komplexen gruppiert. Jedoch ist die Reihenfolge der Proteinanordnung in den Kern editosome komplex und die Interaktionsmuster des Kernkomplex mit dem ZubehörKomplexe noch bestimmt werden. Targeting der RNA-Editing-Prozess in Trypanosomatiden können chemische Dissectoren sorgen, dass die Hilfe bei der Untersuchung der Montage und Funktion der editosome komplex. Darüber hinaus haben funktionelle Untersuchungen auf mehreren editosome Proteine ​​Wesentlichkeit in verschiedenen Lebensphasen dargestellt, was auf ihr Potenzial als Medikament zielt 12.08. Daher kann die gefundenen Inhibitoren der editosome auch als Bleiverbindungen gegen Trypanosomatiden handeln. Dies ist an der Zeit, wie sie derzeit gegen Krankheiten, die durch Trypanosomatida verursacht verfügbaren Medikamente sind giftig, ineffizient und teuer 13,14.

Eine effiziente und bequeme in-vitro-Test ist notwendig, um die chemische Universum für spezifische Inhibitoren, RNA-Editing blockieren erkunden. Drei Tests wurden entwickelt und verwendet werden, um Aktivitäten zu überwachen editosome: (a) volle Runde in vitro RNA-Editing-Test 15, (b) in vitro RNA-Editing-Assay 16,17, vorge gespalten einnd (c) Hammerhead-Ribozym (HHR) basierenden Assay 18. Die ersten beiden Tests beruhen auf direkte Visualisierung des bearbeiteten Produktes (6 ATPase mRNA) mit Hilfe von Radioaktivität. Der HHR-basierten Assay verwendet eine modifizierte Version der ATPase 6 mRNA, die modelliert wird als ein Ribozym nach Bearbeitung verhalten. Die funktionelle Ribozym dann spaltet spezifisch eine radioaktiv markierte RNA-Substrat, als Reporter dient. Kürzlich Moshiri et al. Entwickelt ein "mischen und zu messen" In-vitro-Reporter-Assay HHR-Basis von RNA-Editing überwachen, wo das radioaktiv markierte RNA-Substrat mit einem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Substrat 19 ersetzt. Die prinzipiellen Vorteile dieses Tests sind: (a) es ist eine schnelle und bequeme Mischen und Messen Assaytyp, die Herstellung von aktiven Ribozym und Substratspaltung gleichzeitig erfolgen im gleichen Röhrchen in geringen Mengen (z. B. 20 ul), (b ) es die Verwendung von radioaktiv markierten Materialien vermeidet, (c) die Empfindlichkeit dass Adurch Fluoreszenz Instrumentierung in einem Mikrotiter-Plattenformat, und (d) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis fforded. Unter Verwendung dieses Tests wurde die Wirkung von bekannten RNA-Editing-Ligase Inhibitoren gegen gereinigtes editosome 19 bestätigt. Dieses Experiment bestätigt der Test für die schnelle Identifizierung von RNA-Editing-Hemmer, in erster Linie gegen ganze editosomes von T. brucei.

Fig. 1 ist eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Schema des fluoreszenzbasierten In-vitro-RNA-Editing-Assay. Dieses Protokoll kann entweder für die Überwachung der RNA-Editing in vitro oder einfach für das Screening von Substanzbibliotheken von verschiedenen Maßstäben angepasst werden verwendet werden.

Protokoll

Die folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zur Durchführung der fluoreszenzbasierten Assays RNA-Editierung. Der Assay kann in einem PCR-Röhrchen, 96-Well-oder 384-Well-Platten in Abhängigkeit von dem Umfang des Experiments durchgeführt werden. Anschließend wird das Fluoreszenzsignal kann auf einem geeigneten Echtzeit-PCR-Nachweissystem gelesen werden. Der Assay wird hier im Zusammenhang mit der 384-Well-Platten beschrieben.

1. Kultivierung T. brucei Cells

  1. Bereiten Sie ein Wachstumsmedium für T. brucei prozyklischen Form Zellen. Für 1 l Medium:
    1. Lösen 25,4 g SDM-79-Pulver in 800 ml MilliQ-Wasser.
    2. 2 g NaHCO 3 und pH-Wert auf 7,3 mit 10 M NaOH.
    3. In Nanopure-Wasser auf ein Volumen von 900 ml, Filter zu sterilisieren.
    4. Hinzufügen Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin-Streptomycin-Lösung und Hämin (2,5 mg / ml) bis zu Endkonzentrationen von 10% (v / v), 100 U / ml und 7,5 mg / l auf.
  2. Wachsen 300 ml T. brucei 1.7A Wildtyp (prozyklischen Form)-Zellen bei 28 ° C, Schütteln bei 70 Umdrehungen pro Minute bis zu einer Dichte von 1,5 x 10 7 Zellen / ml. HINWEIS: Dies sollte 3 ml der aktiven editosome produzieren mit ~ 0,5 mg Gesamtprotein, ausreichend für 600 Bearbeitung Reaktionen.
  3. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
  4. Mit 50 ml gekühltem PBSG-Puffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 145 mM NaCl und 6 mM Glucose) Waschen des Pellets und Spin-down Zellen werden erneut durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C.

2. Isolierung von Mitochondrien Crude

HINWEIS: Alle Schritte sollten auf Eis oder bei 4 ° C durchgeführt, um editosome Aktivität zu bewahren.

  1. Resuspendieren der geernteten Zellen in 30 ml DEE-Puffer (1 mM Tris-HCl pH 8,0 und 1 mM EDTA). Verwenden Sie eine 40 ml sterile Dounce Homogenisator (vorgekühlte), um die Zellmembran durch Streicheln auf und ab mindestens 10-mal auf Eis zu stören.
  2. 4,3 ml 60% Saccharose (w / v, dh 1,75 M) unmittelbar in den Homogenat zu einer Endkonzentration von 0,25 M Zentrifugieren bei 15.800 × g für 10 min bei 4 ° C, bevorzugt zu bringen Mitochondrien.
  3. Resuspendieren des Mitochondrienpellet in 4,6 ml STM-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM Saccharose und 2 mM MgCl 2). Hinzufügen 13,8 ul 0,1 M CaCl 2 und 4 &mgr; l RNase-freier DNase I, um Endkonzentrationen von 0,3 mM und 9 U / ml. Inkubieren der Mischung für 1 Stunde auf Eis.
  4. Hinzufügen von 4,6 ml STE-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM Saccharose und 2 mM EDTA), um das DNase I. Zentrifugieren bei 15.800 × g für 10 min bei 4 ° C inaktiviert
  5. Das Pellet in 400 ul Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl 2, 100 mM KCl, 1 ug / ml Pepstatin, 1 mM DTT und 1x komplett EDTA-freie Protease-Inhibitor) und Übertragung auf eine Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. Hinzufügen von 10% Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 1%nd bebrüten das Lysat für 15 min bei 4 ° C auf einem Schwenker.
  7. Deaktivieren des mitochondrialen Lysat durch Zentrifugieren zweimal bei 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C; Beibehaltung der geklärte Überstand jeder Zeit.

3. Editosome Reinigung

  1. Pour à 10 ml 10% -30% (v / v) Glycerin linearen Gradienten (Tabelle 1) in ein Ultrazentrifugenröhrchen mit 2x HHE Gradienten-Puffer (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, und 2 mM EDTA) und ein Gradient Maker, indem Sie die Gebrauchsanleitung.
  2. Entfernen Sie vorsichtig 500 ul Lösung von der Spitze der Glycerin-Gradienten und schonend geladen werden 500 ul der mitochondrialen Lysat gelöscht. Schleudern bei 178.000 × g für 6 Stunden bei 4 º C unter Verwendung einer Ultrazentrifuge.
  3. Sequentielles Sammeln 500 ul-Fraktionen von der Oberseite zum Boden des Gradienten bei 4 ° C. Dann schnappen Einfrieren der Fraktionen mit flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Nutzung.

4. RNA-Herstellung

  1. Annealing der jeweiligen DNA-Matrize, die komplementäre Sequenz T7-Promotorsequenz (Tabelle 2) mit einem T7-Promotor-Oligonukleotid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') in einem Molverhältnis von 1:1 durch Erhitzen bei 90 ° C für 3 Minuten und Abkühlen auf RT für mindestens 10 min.
  2. Transkribieren RNA mit Hilfe eines in-vitro-Transkription-Kit, indem Sie die Gebrauchsanleitung.
  3. Stoppen Sie die Transkription Reaktion durch Zugabe von gleichen Volumen von 7 M Harnstoff-Farbstoff (7 M Harnstoff, 0,05% Xylol Cynol und 0,05% Bromphenolblau). Führen Sie auf einem Filter sterilisiert 9% denaturierenden Polyacrylamid-Gel (9% Acrylamid, 7 M Harnstoff, 1x TBE).
  4. Verwenden Sie die Ultraviolett (UV)-Shadowing mit einem kurzwelligen UV-Lampe zu finden und Verbrauch jeweiligen RNA. Platzieren der ausgeschnittenen Gelstück in ein Mikrozentrifugenröhrchen und füge 400 ul Gel Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA und 0,25% SDS). Eluiere über Nacht bei RT auf einem Schwenker.
  5. PreciPitate der eluierten RNA durch Zugabe von 1 ml kaltem 100% Ethanol und Inkubation entweder bei -80 ° C für 30 min und 20 ° C über Nacht.
  6. Zentrifuge bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C, um die RNA zu pelletieren unten.
  7. Mit 1 ml 75% Ethanol Waschen des Pellets. Zentrifugieren bei 16000 × g für 20 min bei 4 ° C
  8. Die RNA-Pellet in geeigneter Weise in RNase-freiem Wasser auf die gewünschten Konzentrationen zu erreichen, wie in Tabelle 2 gezeigt.

5. Fluoreszenz-basierte RNA-Editing-Assay

  1. Für einen Reaktions kombinieren 1 pmol (1 ul) preA6Rbz und 2,5 pmol (1 ul) gA6Rbz (Molverhältnis 1:2,5) in einem Mikrozentrifugenröhrchen, Inkubation bei 70 º C für 3 min und lassen Sie es bei RT sitzen an mindestens 10 min.
  2. Unterdessen bereiten einen Master-Mix unter Verwendung von Tabelle 3, ohne preA6Rbz und gA6Rbz, für die Bearbeitung aus 1x HHE Reaktionspuffer (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl und 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl 2, 16 ng / ul Torula-Hefe-RNA, 0,1% Triton X-100, und das gereinigte editosome.
  3. In geglüht preA6Rbz und gA6Rbz, um den Master-Mix zu vervollständigen.
  4. Verzichten 18 &mgr; l der Mastermischung (Tabelle 3) in die Vertiefungen, die entweder 2 &mgr; l RNase-freies Wasser (Vertiefungen ohne Verbindungen) oder 2 &mgr; l 200 &mgr; M chemischen Verbindungen und umfassen Kontrollproben in der Platte nach Fig. 5.
  5. Verschließen Sie die Platte mit einem Plattenabdeckung und drehen Sie die Platte nach unten, um die Luftblasen zu entfernen. Inkubieren bei 28 ° C für 4 Stunden.
  6. In 25 pmol (2 ul) gA6Rbz Wettbewerber in jede Vertiefung. Legen Sie eine frische Versiegelung, drehen Sie die Platte um und legen Sie es auf einer Echtzeit-PCR-Maschine. Programmieren Sie das folgende Experiment:
    Schritt 1: 85 ° C für 5 min; Schritt 2: 24 ° C für 10 min; Schritt 3: Stop.
  7. Werden 15 pmol (1 ul) des FRET-Substrat zu jeder Vertiefung bis zu einem Endvolumen von 23 ul. Verschließen Sie die Platte mit einem frischen Versiegelung.Schnell drehen die Platte und legen Sie sie wieder auf die Echtzeit-PCR-Maschine.
  8. Programmieren Sie einen neuen Versuch mit den folgenden Schritten:
    Schritt 1: 37 ° C für 1 min; Schritt 2: Lesen; Schritt 3: Gehen Sie auf 1, 40 mal Schritt; Schritt 4: Stop.
  9. Setup die Platte, indem Sie alle Brunnen, die Lektüre erfordern, und wählen Sie den FAM-Filter. Eingangsvolumen 23 ul und den Lauf starten.
  10. Berechnen Sie die Steigung der von jedem gut / Probe erhalten, um eine kinetische Messung durch Auftragen der Pisten auf einem Balkendiagramm für die Analyse zu erhalten Werte. HINWEIS: Eine kinetische Lese verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis zwischen der Probe und dem Hintergrund; als der Hintergrund Probe würde eine Steigung nahe Null haben. Ein Endpunkt Lesen hat eine höhere Hintergrundgeräusche.

Ergebnisse

Um die notwendigen Schritte für den Aufbau einer großen Leinwand zeigen, erforderlich, Fig. 2-5 sind repräsentative Kontrollexperimenten auf die Qualität des Tests zusammen. Dies sind wesentliche Kontrollversuche für eine konsistente Assay über mehrere Tage zum Screenen oder zum Vergleich von verschiedenen Bildschirmen.

Die Bewertung der Fluoreszenz-Signal-zu-Rausch-Verhältnis

Um die Stabilität und die Qualität der Fluor...

Diskussion

Ein neuartiges Hochdurchsatz-Screening-Verfahren, um Inhibitoren gegen die RNA-Editing-Komplex von Trypanosomen identifizieren vorgestellt wurde, bietet ein neues Werkzeug für die Wirkstoffforschung an Krankheiten, die durch Trypanosomatiden verursacht zu begegnen. FRET-basierten Ribozym Assay wurde ausgiebig für verschiedene Zwecke verwendet, 20-22; Jedoch haben wir die Fähigkeit von FRET-Ribozym-Assay für die in vitro Überwachung der RNA-Editing Aktivität 19 verwendet. Dieser Test ...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
SDM-79 MediumGibco by Life Technologies
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%SigmaH5533-10G
Penicillin-Streptomycin SollutionFisher ScientificMT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free Roche4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production systemPromegaP1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders  Fisher ScientificK885300-0040  
Gradient Master, ver 5.25 Biocomp107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 mlBeckman Coulter344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge Beckman Coulter392052
SW 41 Ti ROTORBeckman Coulter331336
MicroSeal 'B' Seal, SealsBioradMSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)Bio BasicA0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kgLife TechnologiesAM9902

Referenzen

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