Medición de la función respiratoria en ratones usando irrestricta pletismografía corporal total

Resumen

La evaluación de la fisiología respiratoria se ha basado tradicionalmente en las técnicas, que requieran inmovilización o sedación de los animales. Unrestrained pletismografía de cuerpo entero, sin embargo, proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales. Además, la técnica permite repitió evaluación respiratorio de los ratones que permiten estudios longitudinales.

Resumen

La disfunción respiratoria es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo y las tasas de mortalidad siguen aumentando. La evaluación cuantitativa de la función pulmonar en modelos de roedores es una herramienta importante en el desarrollo de futuras terapias. Comúnmente utilizado técnicas para la evaluación de la función respiratoria incluyendo pletismografía invasiva y oscilación forzada. Si bien estas técnicas proporcionan información valiosa, la recopilación de datos puede estar lleno de artefactos y la variabilidad experimental debido a la necesidad de anestesia y / o instrumentación invasiva del animal. En contraste, sin restricciones pletismografía de cuerpo entero (UWBP) ofrece una manera precisa, no invasiva, por el cual cuantitativa para analizar los parámetros respiratorios. Esta técnica evita el uso de anestesia y restricciones, que es común a las técnicas tradicionales de pletismografía. Este video demostrará el procedimiento UWBP incluido el equipo instalado, calibrado y pulmón grabación función. Esexplicará la forma de analizar los datos recogidos, así como identificar valores atípicos experimentales y artefactos que resulta de la circulación de animales. Los parámetros respiratorios obtenidos utilizando esta técnica incluyen el volumen corriente, el volumen minuto, ciclo de trabajo inspiratorio, velocidad de flujo inspiratorio y la proporción de tiempo de inspiración a tiempo de caducidad. UWBP no se basa en conocimientos especializados y es de bajo costo para llevar a cabo. Una característica clave de UWBP, y más atractivo para los usuarios potenciales, es la capacidad de realizar mediciones repetidas de la función pulmonar en el mismo animal.

Introducción

Disfunción de pulmón es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. La condición se caracteriza por el intercambio de oxígeno insuficiente, sinónimo de tos, dolores en el pecho y la disnea. La enfermedad respiratoria para ~ 10% de la mortalidad en todo el mundo ^1. Según la Organización Mundial de la Salud, las tasas de mortalidad se prevé un aumento a causa del tabaquismo persistente, la contaminación y los irritantes ocupacionales. UWBP es una adición útil para el estudio de la fisiología pulmonar, que complementa fuertemente bioquímica tradicional y análisis histológicos ^2. Otros procedimientos utilizados para la evaluación de pulmón no ofrecen las mismas ventajas que UWBP. Pletismografía invasiva es una técnica de uso común que requiere que el animal sea anestesiado ^3,4 y por lo tanto, las mediciones respiratorias resultantes no son necesariamente un reflejo de un estado natural. Además, el requisito de ventilación y químicas desafíos mecánicos excluye futuras mediciones ^3,4.Otro método de recogida de datos respiratoria es por oscilación forzada, que es más sensible a cambios en los parámetros más finas respiratorias en comparación con UWBP ^5. Oscilación forzada es, sin embargo, una técnica invasiva y requiere la terminación de animales para la recogida de datos ^5-7.

UWBP consiste en colocar un animal dentro de una cámara especializada. Durante la inspiración, el aire se calienta de marea y humidificado dentro de los pulmones aumento de presión de vapor de agua y provoca la expansión térmica de gas ^8. Este efecto provoca un cambio neto en el volumen de aire de la creación de un aumento de la presión dentro de la cámara ⁸ pletismógrafo. Lo contrario ocurre durante la espiración la creación de una forma de onda respiratoria del animal. Análisis de forma de onda se utiliza para medir desde la traza respiratoria: frecuencia respiratoria (respiraciones / min), el tiempo total del ciclo respiratorio (seg), la inspiración / tiempo de expiración (Ti / Te, seg) y cambios en la presión debido a cada volumen corriente (P _T). Figura 1 ilustra cada origen mediciones de una traza respiratorio. Estas mediciones son simples y múltiples para calcular los parámetros respiratorios se pueden derivar de estas mediciones. Estos parámetros incluyen: El volumen corriente (volumen de aire movido entre la inhalación y la exhalación normales), el volumen minuto (volumen de gas inhalado desde los pulmones por minuto), ciclo de trabajo de inspiración (el porcentaje de tiempo de inspiración a la duración total del ciclo de respiración) y velocidad de flujo inspiratorio (la cantidad de aire inspirado en un tiempo dado).

UWBP proporciona un análisis cuantitativo preciso, no invasivo, de la fisiología respiratoria en modelos animales y se puede utilizar para medir la progresión de la enfermedad respiratoria y la función pulmonar ^6,9. Contrariamente a otras técnicas de pletismografía, UWBP evita el uso de la anestesia, las restricciones y las manipulaciones invasivas que producen artefactos y la variabilidad experimental ^6,9. La anestesia puede suprimir la respiración,alterar el ritmo cardíaco y puede ser un reto para regular ^10. Las restricciones inducen un aumento en la respiración debido a la tensión adicional a través de la corticosterona y la epinefrina liberan ^11,13. La característica clave de UWBP se repite evaluación fisiológica por lo que es susceptible de estudios longitudinales. UWBP es muy recomendable para la evaluación longitudinal de la fisiología pulmonar y ofrece una habilidad valiosa para la futura evaluación de drogas respiratoria.

Bleomicina, ovoalbúmina, y la hipoxia se han utilizado para inducir desafíos respiratorios en varios estudios y UWBP ha medido correctamente pulmón precisa evaluación fisiológica ^7,9,13-16. El protocolo descrito está diseñado para ratones de laboratorio estándar adulto. Sin embargo, UWBP ha sido adaptado a otros animales tales como ratas, cobayas, y primates no humanos ^17-20. UWBP no se limita únicamente a la evaluación de la disfunción pulmonar, pero también se ha utilizado para la evaluación de la maduración pulmonar ^3.La versatilidad, la sencillez y reproducibilidad de UWBP han establecido una técnica excelente para la evaluación de la función pulmonar en los animales. Varios software (ver materiales y equipos de la tabla) se requerirá seguir este procedimiento. Un científico experimentado sería capaz de realizar este protocolo con un ratón dentro de 1 hr.

Protocolo

NOTA: El siguiente procedimiento experimental es aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Monash y llevó a cabo de conformidad con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (2006). HEMBRA ADULTA C57BL / 6 ratones utilizados para generar los resultados representativos se obtuvieron de los Servicios de Animales de Monash. Los ratones fueron alojados en una habitación específica libre de patógenos, temperatura y humedad controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Estos ratones tenían acceso libre a comida y agua.

1. Configuración inicial

1. Conecte el ordenador portátil / escritorio de la máquina de adquisición de datos para el registro a través de un cable USB.
2. Conecte el amplificador de puente de 'salida de 1 "a la" entrada 1' de la máquina de adquisición de datos a través de un cable BNC.
3. Inserte el transductor de presión en "canal 1" del Octal Bridge Amp. Encienda la máquina de adquisición de datos y abra el software de análisis. El software debe autodetectar automáticamente la configuración del equipo (ver materiales y tabla de equipos).
4. Ajustes de canal abierto que se encuentran en la barra de herramientas de configuración del software. Cambiar el número de canales que se registró a 1.
5. Configure el barómetro para medir la presión de la sala y el aparato de la columna de agua para calibrar el amplificador de puente. El aparato de la columna de agua incluye dos pipetas de jeringa 5 ml serológicas conectados por un tubo de plástico.
6. Llenar las columnas con agua y asegúrese de que los niveles de agua están en equilibrio con una regla. Conecte un trozo de tubo de plástico a la parte superior de cada pipeta. Figura 2 muestra la columna de agua creada.

2. Puente Amplificador Calibración

Nota: Para calibrar el amplificador de puente de una inyección de aire en la columna de agua se requiere para crear un 1 cm H ₂ O de deflexión. Esto ocurrirá bajo un solo conjunto de condiciones y depende de aparato del usuario. Para aclarar estos pasos demonstrate cómo este laboratorio sería realizar la calibración.

1. Retirar una jeringa de 1 ml a 300 l; conectar la jeringa a la llave de paso en el extremo de la tubería en el lado derecho de la columna de agua. NOTA: Asegúrese de que la llave de paso está abierto a la jeringa y la columna de agua, y cerrado al aire de la habitación. Si los niveles de agua no están equilibrados en este punto, gire la llave de paso de modo que está abierto al aire ambiente y la columna de agua, esto reequilibrar el agua. El tubo en el lado izquierdo de la columna de agua debe ser conectado al transductor de presión para medir el cambio en la presión inducida por el desplome de la jeringa.
2. Una el tubo de la columna de agua en el lado de mano izquierda para el conector en el transductor de presión (anillo superior del transductor).
3. Seleccione el menú de desplazamiento hacia abajo se encuentra junto al canal 1 en la pantalla principal en el lado derecho del software y seleccione "amp Bridge" (ver materiales y tabla de equipos).
4. Ingreselos ajustes a 5 mV, 20 Hz de paso bajo, marque la casilla 'invertido' y haga clic en "cero". Haga clic en 'cero' para establecer la traza a ~ 0 mV. Reducir el tamaño de la ventana a 4: 1 para facilitar la visualización.
5. Con todo listo, presione la jeringa de 1 ml, dejándolo durante 3 segundos. Esto mostrará un aumento repentino en el software debido a que la presión ha cambiado. Cuando los 300 l se deprimieron la presión se moverá el agua en la columna de agua por 1 cm. Este valor conocido ayudará a calibrar el amplificador de puente.
   NOTA: El aumento de presión en la cámara debido a la depresión 300 l corresponde al valor P _K usado para los cálculos posteriores.
6. Selecciona "unidades de entrada" que se encuentran en la esquina inferior izquierda de la ventana de Bridge Amp.
7. Resalta el "rastro de fondo" antes del pico conocido como la 'Región Cero'.
   1. Haga clic en la flecha al lado de "punto 1" y esto producirá el background señal dentro del rango de -0,002 mV 0.002 mV (el valor nunca será exactamente a 0 mV).
   2. Tipo "0" en la ventana al lado de la ventana de la señal de fondo.
8. Resalta el "aumento de la zona de presión de la gráfica" desde que se presiona la jeringa. Haga clic en la flecha situada junto al punto 2 y el valor debe estar en el rango de 0,9 a 1,2 mV.
   1. Tipo "1" en la ventana al lado de la ventana "aumento de la presión". Para una aclaración visual sobre las medidas 2.7 y 2.8 se refieren a la figura 3. Valores que se encuentran fuera de los rangos especificados puede indicar daño al Octal Bridge Amp.
9. Ir a "definir las unidades 'que se encuentra en la esquina superior derecha de la ventana y seleccione" cmH ₂ O ". Si esta opción no está disponible, se puede introducir manualmente. Haga clic en Aceptar.
10. Volver al menú de la 'Bridge Amp' (véase el apartado 2.1). Seleccione 1 mV y establecer amplificador a 'cero';. Esto completará la calibración y la columna de agua de forma segura se puede eliminar.

Función 3. grabación de pulmón

1. Pesar el ratón (g). NOTA: Una semana antes de la evaluación fisiológica introducir el ratón para el ambiente de la cámara pletismografía. Esto ayudará en la aclimatación y reducir el estrés cuando se lleva a cabo este procedimiento en una fecha posterior. Para un esquema general que demuestra la configuración UWBP, por favor refiérase a la Figura 4.
2. Medir la temperatura corporal con un termómetro rectal. Lubricar el termómetro con vaselina antes de la inserción. Registre la lectura de la temperatura y limpiar el lubricante con 80% (v / v) de etanol. Si el uso de animales muy pequeños, tales como crías de ratón neonatales, el valor medio de la temperatura corporal se puede determinar con un termómetro de infrarrojos en su lugar.
3. Coloque la sonda de humedad / temperatura relativa en el extremo de un agujero de la cámara de pletismografía. Registre la temperatura, la humedad y barometric presión dentro de la cámara pletismografía antes de colocar el ratón dentro.
4. Coloque el ratón en la cámara de pletismografía, tapar el extremo abierto ligeramente. Esto permite que el ratón para aclimatarse. Cerrar la cámara.
5. Con la sonda de temperatura / humedad insertado en el lado de la cámara de pletismografía con un agujero, ahora insertar el transductor y la jeringa en el otro lado con los dos agujeros.
6. Pulse 'Start' en el programa de software y récord de aproximadamente 15 a 45 seg. Record 5.10 seg de datos donde el animal no se mueve. Movimiento alterará la fisiología respiratoria basal del animal y proporcionar resultados pobres. La respiración debe oscilar en un trayecto lineal en el programa. Estos son datos utilizables. Nota: la micción o la defecación puede conducir a un aumento en la temperatura y la humedad dentro de la cámara de pletismografía. Esto oscurecer los resultados durante el análisis. En el caso de la micción o la defecación, detenga la grabación inmediatamente y limpiar la plethysmography cámara con 80% (v / v) de etanol. Consulte la Figura 6 para una representación visual de los resultados subóptimos, donde deben ser rechazadas de datos.
7. Después de grabar durante 45 segundos, pulse "Stop" en el software (ver tabla de materiales y equipos) del programa. Retire el ratón desde la cámara de pletismografía y registrar inmediatamente la temperatura de la cámara y de la humedad. No grabe continuamente durante más de 45 segundos, ya que esto puede estresar al animal.
8. Devuelva el ratón a su jaula, spray y limpie la cámara con un 80% (v / v) de etanol.
9. Permitir que la cámara se seque y vuelva a la temperatura de referencia y la humedad antes de proceder a la siguiente ratón. Repita los pasos 3.1 a 3.9 para los animales posteriores. Nota: Si se están estudiando varios animales, asegúrese de que la temperatura de la cámara y el retorno a los valores basales de humedad cerca antes de cada nuevo animal se pone en la cámara.

4. Análisis pletismografía

Note: Para calcular los parámetros respiratorios tales como el volumen corriente (V _T) y el volumen de minutos las siguientes variables deben ser medidos: la frecuencia respiratoria (respiraciones / min), el tiempo total de ciclo de respiración (seg), la inspiración / tiempo de expiración (Ti / Te, segundos) y el cambio de presión debido a cada volumen corriente (P _T). Figura 1 ilustra las variables que se pueden medir de una traza. Los siguientes pasos utilizan un software (ver materiales y equipos de la tabla) para medir estas variables. Al analizar, evitar las regiones de la traza que contiene la inhalación o el movimiento. Para obtener resultados reproducibles, se requiere por lo menos de 5 segundos de buena traza respiración. Para un ejemplo de diferentes huellas de respiración consulte la Figura 5 y 6.

1. Abra la pantalla a pantalla completa, vista establecido en 1: 1 y seleccione 5 seg de datos utilizables. Una instantánea representativa de esto se muestra en la Figura 5.
2. Abra la ventana de mini pad de datos que se encuentra en la parte superior de la programo en la pestaña cuaderno de datos. Seleccione el canal 1 y seleccione 'mediciones de ciclo "en la columna de la izquierda y" altura cíclica media' en la columna de la derecha.
   1. Seleccione "Opción" y establecer la escala para la detección de pico mínimo de 1 (ms). Esto permitirá la detección de todos los valores de pico y se vuelve muy importante cuando se utilizan pequeños animales que producen pequeñas oscilaciones.
   2. Haga clic en 'Aceptar'. Esto presentará «deformación de presión debida a cada volumen corriente '(P _T) de medición.
3. En el mini cojín de datos, seleccione «mediciones del ciclo 'seguido de' recuento de eventos 'y haga clic en' Aceptar '. Esto presentará la "frecuencia" (f) la medición.
   1. Frecuencia necesita ser convertida a respiraciones / min. Esto se hace multiplicando el valor por 60 seg y dividiendo el resultado por el tiempo total de la grabación (min).
4. En el mini cojín de datos, seleccione cy 'mediciones cle 'seguido de' periodo 'y haga clic en "Aceptar". Esto presentará el 'tiempo total de ciclo de la respiración' (T _tot, sec) de medición.
5. Los siguientes pasos se utilizan para crear una macroinstrucción para generar valores de tiempo de inspiración y espiración pico. Asegúrese de que el cursor se encuentra directamente sobre el máximo del pico / valle y añadir un comentario en 9 picos secuenciales y valles. Comience con el pico de la oscilación, como se muestra en la Figura 5.
6. Posteriormente, seleccione la ventana: pista y la columna 1 En la ventana que aparece, haga clic en 'información de selección "en la columna de la izquierda,' duración 'en la columna de la derecha y haga clic en' OK 'de datos.
7. Seleccione la macro que se encuentra en la parte superior del programa y luego inicie la grabación. Ahora seleccione comandos: 'Encontrar', 'Go', 'inicio del archivo "y haga clic en' Buscar '.
8. Seleccionar comandos: 'Buscar' y 'Encuentra comentarios'. Escriba la misma frase escrita en el cuadro de comentario en el cuadro 'contiene' proporcionado. Seleccione la pestaña 'Seleccionar al punto anterior' y 'Buscar'.
9. Seleccionar comandos: 'Añadir a la tableta de datos'. A continuación, seleccione macro: comandos de macro y comenzar a repetir. La ventana cuenta de repetición que aparece debe fijarse en 9.
10. Comando Seleccionar: 'Buscar siguiente'. Seleccione el comando: 'Añadir a la tableta de datos'. Finalmente seleccionar comandos de macro y repetir final.
    1. Ahora seleccione la macro y detener la grabación. Guardar y nombrar la macro después de que el número de animales. NOTA: La creación de la macro para cada animal permite que la macro se utiliza para los estudios longitudinales y ahorra tiempo.
11. La macro se puede ejecutar para obtener la inspiración _(Ti) y vencimiento (T _e) tiempo entre cada comentario. Los datos aparecerán en el canal 1 del cuaderno de datos. Expiración y la inspiración se produce consecutivamente y aparecerán los datos en este orden.
    1. Los datos deben ser dividir manualmente en valores de inspiración y espiración. La media de los cuatro valores de datos de cada parámetro para obtener la media T _i y T _e.
12. Una vez que los valores primarios se han derivado el volumen tidal (V _T, ml) se puede calcular. Para obtener el volumen tidal se utiliza la ecuación de Drorbaugh y Fenn ^8:
    V _T (ml) ₌ (P _T / P _K) x (V _K) x ((T _SUBYACENTE (P _B - P _C)) / (T _SUBYACENTE (P _B - P _C) - T _C (P _{B -} P _CORE)))
    
    Dónde
    V _T: Volumen corriente
    P _k: la desviación de presión debida a cada inyección de 1 ml (Consulte el paso 2.5)
    Camiseta _básica: La temperatura central de cada animal
    P _C: presión de vapor de agua en la cámara de temperatura X Humedad relativa en chambre
    T _C: la temperatura en la cámara de animales
    P _núcleo: Presión a temperatura corporal (presión de vapor del agua a la temperatura corporal x 1,0)
    P _t: desviación de presión debida a cada volumen corriente
    V _k: la inyección de volumen para la calibración
    P _B: presión barométrica
    
13. Una vez que el volumen tidal se ha calculado los siguientes parámetros también se pueden determinar:
    • Volumen por minuto (ml / min) = V _T xf
    • Volumen por minuto (ml / min / kg) = (V _T xf) / peso corporal (kg)
    • V _T (ml / kg) = V _T (ml) / peso corporal (kg)
    • Ciclo de trabajo inspiratorio (%) = T _i / T _tot
    • Inspiratoria Caudal (ml / seg) = V _T / T _i
    • Proporción de tiempo de inspiración a tiempo de expiración = T _i / T _e
    • Tiempo total de ciclo (sec) = Tiempo de inspiración (s) + tiempo de expiración (seg)

Resultados

Cuando este procedimiento se ha seguido correctamente, un rastro de oscilación constante se crea en el software de análisis de datos. El procedimiento proporciona una traza respiratoria dentro de unos pocos minutos después de la configuración con los cálculos informáticos sencillos para determinar los parámetros respiratorios enumerados. Figura 5 representa una traza de respiración adecuado a partir de un ratón de control (sanos). Datos oscilante adecuado se produce cuando el animal no se mueve...

Discusión

La técnica descrita aquí es un método no invasivo para la evaluación de los parámetros respiratorios de ratones sin restricciones y sin anestesiar. Los puntos fuertes de este protocolo son su simplicidad y precisión para medir la función pulmonar longitudinalmente con artefactos mínimos. Hay, sin embargo, algunas limitaciones y pasos críticos que se observaron sobre el procedimiento. En primer lugar y lo más importante, el ratón debe mantener la calma dentro de la cámara durante un mínimo de cinco segundos....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabChart 7 software (for Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	used in protocol step 4
PowerLab 8/30 (model ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Black BNC to BNC cable (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 or later
Surgipack Digital Rectal Thermometer	Vega Technologies	MT-918
Grass volumeteric pressure transducer PT5A	Grass Instruments Co.	Model number PT5A; serial No. L302P4.
1 ml Syringe	Becton Dickinson (BD)	309628
5 ml Serological syringe pipettes	Greiner Bio One	606160	Connected via plastic tubing
Balance/Scales	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Any weighing balance with of 0.1 gram resolution
HM40 Humidity & temperature meter	Vaisala	HM40A1AB
Barometer	Barometer World	1586
Laboratory tubing	Dow Corning	508-101	Used to connect water column to the syringe and pressure transducer
Cylindrical Perspex Chamber	Dynalab Corp.		Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter.
80% Ethanol (4 L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP