Измерение функции внешнего дыхания у мышей, используя безудержного плетизмографии всего тела

Резюме

Оценка физиологией дыхания традиционно полагались на методы, которые требуют сдержанности или торможение животного. Безудержная плетизмография всего тела, однако, обеспечивает точное, неинвазивный, количественный анализ физиологией дыхания в животных моделях. Кроме того, этот метод позволяет повторяется дыхательных оценку мышей, позволяющих продольных исследований.

Аннотация

Дыхательная дисфункция является одним из ведущих причин заболеваемости и смертности в мире и темпы смертности продолжают расти. Количественная оценка функции легких в моделях грызунов является важным инструментом в развитии будущих методов лечения. Обычно используется методики для оценки функции внешнего дыхания, включая инвазивные плетизмографии и вынужденных колебаний. Хотя эти методы дают ценную информацию, сбор данных может быть чревато артефактов и экспериментальной изменчивости в связи с необходимостью для анестезии и / или инвазивных приборов животного. В отличие от этого, безудержное плетизмография всего тела (UWBP) предлагает точную, неинвазивный, количественный путь, по которому будет анализировать респираторных параметров. Эта техника позволяет избежать использования анестезии и ограничений, что является общим для традиционных методов плетизмографии. Это видео продемонстрирует процедуру UWBP включая оборудования создан, записи функция калибровки и легких. Этообъяснит, как анализировать собранные данные, а также определить экспериментальные выбросов и артефакты, которые приводят от движения животных. Дыхательные параметры, полученные с помощью этой техники включают дыхательный объем, минутный объем, вдоха рабочий цикл, вдоха расхода и соотношение времени вдоха к времени выдоха. UWBP не полагаться на специализированных навыков и недорого выполнить. Ключевой особенностью UWBP, и наиболее привлекательным для потенциальных пользователей, является возможность выполнять повторные меры функции легких на того же животного.

Введение

Легких дисфункция является одним из ведущих причин заболеваемости и смертности в мире. Состояние характеризуется недостаточным кислородного обмена, синонимом кашель, боли в груди и одышка. Респираторные долю этой болезни приходится ~ 10% смертности во всем мире ^1. По данным Всемирной организации здравоохранения, смертность будут расти в связи с постоянного курения, загрязнения и профессиональных раздражителей. UWBP является полезным дополнением для изучения физиологии легких, который сильно хвалит традиционный биохимических и гистологических анализов ^2. Другие процедуры, используемые для оценки легких не обеспечивают те же преимущества, UWBP. Инвазивные плетизмографии является широко используемым методом, который требует, чтобы животное быть обезболивание ^3,4 и, таким образом, в результате респираторных измерений не обязательно отражает естественном состоянии. Кроме того, требование к механической вентиляции и химических проблем исключает будущие измерения ^3,4.Другой метод сбора данных дыхательных является вынужденных колебаний, которая является более чувствительным к более тонким изменения в дыхательных параметров по сравнению с UWBP ^5. Вынужденные колебания, однако, инвазивной техники и требует животного прекращение сбора ^5-7 данных.

UWBP включает в себя размещение животное внутри специализированного камеры. Во время вдоха, дыхательный воздух подогревается и увлажняется в легких увеличения давления паров воды и вызывает тепловое расширение газа ^8. Этот эффект вызывает чистое изменение объема воздуха, создавая увеличение давления внутри плетизмографа камере ^8. Происходит обратное во время выдоха, создавая дыхательных сигнала от животного. Анализ осциллограмм затем используется для измерения из дыхательных следа: частота дыхания (вдох / мин), общее время дыхательного цикла (сек), вдохновение / срок действия (Ti / Te, сек) и изменения давления в связи с каждой дыхательного объема (P _T). Рисунок 1 иллюстрирует каждый измерений происхождение от респираторного следа. Эти измерения можно легко рассчитать и несколько дыхательных параметры могут быть получены из этих измерений. Эти параметры включают в себя: дыхательный объем (объем воздуха перемещаются между нормальной вдоха и выдоха), минутный объем (объем газа, вдыхаемого из легких в минуту), на вдохе цикл (процент времени вдоха к общей длительности цикла дыхания) и Расход при вдохе (количество воздуха, внушен в данный момент времени).

UWBP обеспечивает точное, неинвазивный, количественный анализ физиологией дыхания на животных моделях и может быть использован для измерения прогрессирование респираторных заболеваний и легочной функции ^6,9. В отличие от других методов плетизмографии, UWBP избегает использования анестезии, ограничений и инвазивных манипуляций, которые производят артефакты и экспериментальной изменчивости ^6,9. Анестезия может подавлять дыхание,изменить частоту сердечных сокращений и может быть сложным, чтобы регулировать ^10. Ограничения вызывают увеличение дыхания в связи с дополнительным стрессом с помощью кортикостерона и адреналин выпустить ^11,13. Ключевой особенностью UWBP повторяется физиологическую оценку делая его доступным продольных исследований. UWBP настоятельно рекомендуется для продольной оценки физиологии легких и предлагает ценный навык для будущей оценки дыхательной наркотиков.

Блеомицин, яичный альбумин, и гипоксия были использованы, чтобы вызвать респираторные проблемы в нескольких исследованиях и UWBP успешно измеряется точным легких физиологическую оценку ^7,9,13-16. Протокол, описанный предназначен для взрослых стандартных лабораторных мышей. Тем не менее, UWBP была адаптирована для других животных, таких как крысы, морские свинки, и приматов ^17-20. UWBP не ограничивается только, чтобы оценки легочной дисфункцией, но также используется для оценки легких созревания ^3.Универсальность, простота и воспроизводимость UWBP создали отличную технику для оценки функции легких у животных. Различные программное обеспечение (см материалы и таблицы оборудования) будут обязаны следовать этой процедуре. Опытный ученый сможет выполнять этот протокол с мышью в течение 1 часа.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем Экспериментальная процедура была утверждена Комитетом по этике Животных в университете Монаш по и проводится в соответствии с австралийским Кодекса практики по уходу и использованию животных в научных целях (2006). Взрослые самки мышей C57BL / 6, используемые для получения репрезентативных результатов были получены из Monash животных Услуги. Мыши содержались в определенном патогенов, контролируемой температурой и влажностью комнате с 12 час цикле свет-темнота. Эти мыши имели свободный доступ к пище и воде.

1 Первоначальная настройка

1. Подключите ноутбук / рабочий стол в приобретении данных машины для записи с помощью кабеля USB.
2. Подключите усилитель Bridge от «выхода 1» до «входа 1 'из сбора данных машины с помощью кабеля BNC.
3. Вставьте датчик давления в 'канала 1' восьмеричного Bridge Amp. Поверните сбора данных машины на и откройте программное обеспечение для анализа. Программное обеспечение должно авточески обнаруживать установку оборудования (см материалы и таблицы оборудования).
4. Открытые Настройки канала, найденные в панели инструментов установки программного обеспечения. Измените число каналов при передаче 1.
5. Настройте барометр для измерения давления номера и толще воды аппарат для калибровки мостовой усилитель. Устройство водяного столба включает два 5 мл серологические шприцев пипетки, соединенных пластиковыми трубами.
6. Заполните столбцы с водой и обеспечить уровень воды сбалансированы с помощью линейки. Подключите один кусок пластиковой трубки к верхней части каждой пипетки. Рисунок 2 показывает столб воды настроить.

2 Мост Усилитель Калибровка

Примечание: Для калибровки усилителя моста инъекцию воздуха в толще воды требуется, чтобы создать 1 см _Н2О прогиб. Это будет происходить в рамках одного набора условий и зависит от аппарата пользователя. Для разъяснения этих шагов Demonstrate как эта лаборатория будет выполнять калибровку.

1. Вывод на 1 мл шприц к 300 мкл; присоединить шприц к запорным краном на конце трубы на правой стороне толще воды. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кран открыт для шприца и в толще воды, и закрыт для воздуха в помещении. Если уровень воды не сбалансированы в этой точке, повернуть запорный кран таким образом, что она открыта для воздуха в помещении и в толще воды, это будет сбалансировать воду. Трубка на левой стороне толще воды должны быть соединены с датчиком давления для измерения изменения давления, вызванное погружением шприца.
2. Прикрепите трубку от толщи воды на левой стороне к разъему на датчике давления (верхнего кольца преобразователя).
3. Выберите прокрутки меню находится рядом с каналом 1 на главном экране на правой стороне программного обеспечения и выберите «Мост усилитель" (см материалы и таблицы оборудования).
4. Введитепараметры в 5 мВ, 20 Гц низких частот, установите флажок «Инверсия» и нажмите «ноль». Нажмите 'ноль', чтобы установить след в ~ 0 мВ. Уменьшите размер окна до 4: 1 для более удобного просмотра.
5. Со всем создана, нажмите шприц 1 мл, оставляя его на 3 сек. Это покажет внезапный всплеск на программном обеспечении, так как давление не изменилось. Когда 300 мкл нажата давление будет перемещать воду в толще воды на 1 см. Это известное значение поможет откалибровать мостовой усилитель.
   Примечание: повышение давления в камере за счет 300 мкл депрессии соответствует значению P _K, используемого для дальнейших расчетах.
6. Выбрать 'входных единиц », указанную в нижнем левом углу окна Bridge Amp.
7. Выделите "фона след" До всплеска иначе известный как "нулевой области».
   1. Нажмите стрелку рядом с «точки 1 ', и это произведет баккараkground сигнал в диапазоне -0,002 мВ-0,002 мВ (значение никогда не будет точно при 0 мВ).
   2. Тип «0» в окне рядом с окном фонового сигнала.
8. Выделите "повышенную регион давления графа" с момента, когда шприц депрессии. Нажмите стрелку рядом с точкой 2 и значение должно быть в диапазоне 0,9-1,2 мВ.
   1. Тип «1» в окне рядом с окном "возрастающее давление". Для визуального разъяснения о мерах 2,7 и 2,8 см Рисунок найденные за пределами диапазона, определенного может указывать повреждения Octal Bridge Amp 3. Значения.
9. К 'определить единицы' найдено в верхнем правом углу окна и выберите "КМЗ ₂ O". Если эта опция не доступна, она может быть введена вручную. Нажмите ОК.
10. Вернуться к меню 'Bridge Amp' (обратитесь к 2,1). Выберите 1 мВ и установить усилитель к «ноль»;. Это позволит завершить калибровку и толща воды может быть безопасно удалены.

Функция 3 Запись легких

1. Взвесьте мыши (г). ПРИМЕЧАНИЕ: За неделю до физиологической оценки ввести мышь для окружающей среды плетизмография камеры. Это поможет в акклиматизации и уменьшить стресс при проведении этой процедуры на более поздний срок. Для общей схеме, демонстрирующей настройку UWBP, пожалуйста, обратитесь к рисунку 4.
2. Измерьте температуру тела с ректального термометра. Смажьте термометр вазелином перед введением. Запишите показания температуры и очистите смазку от 80% (об / об) этанола. При использовании очень маленьких животных, таких как новорожденных щенков мыши, среднее значение температуры тела может быть определена с инфракрасным термометром вместо.
3. Поместите температуры / относительной влажности зонда на конце одним отверстием в плетизмографии камеры. Запишите температуру, влажность и БАРОМЕТРколебаний атмосферного давления внутри плетизмографии камере до размещения мыши в.
4. Наведите в плетизмографии камеры, покрыть открытый конец немного. Это позволяет мыши, чтобы акклиматизироваться. Закройте камеру.
5. С зондом температуры / влажности, вставленной в сторону плетизмографии камеру с одним отверстием, в настоящее время вставки датчика и шприца в другую сторону с двумя отверстиями.
6. Нажмите "Старт" на программе и записи в течение примерно 15-45 сек. Запись 5-10 секунд данных, где животное не двигается. Движение изменит базальной физиологией дыхания животного и обеспечить плохие результаты. Дыхание должно колебаться в линейном пути по программе. Это годные к употреблению данных. Примечание: мочеиспускания или дефекации может привести к увеличению температуры и влажности внутри камеры плетизмографии. Это скроет результаты при анализе. В случае мочеиспускания или дефекации, остановить запись немедленно и очистить плethysmography камера с 80% (об / об) этанола. На рисунке 6 для визуального представления неоптимальных результатов, где данные должны быть отклонены.
7. После записи в течение 45 сек, нажмите 'Stop' от программного обеспечения (см Материалы и оборудование таблицу) программу. Отключив мышь от плетизмографии камеры и сразу же записывать температуру в камере и влажности. Не постоянно запись в течение более 45 секунд, так как это может подчеркнуть животное.
8. Вернуться мышь в клетку, брызг и протрите камеру с 80% (об / об) этанола.
9. Разрешить камеру для сушки и возврата к исходной температуры и влажности, прежде чем перейти к следующему мыши. Повторите шаги 3,1 до 3,9 для последующих животных. Примечание: Если несколько животных изучается, убедитесь, что температура в камере и возврат влажность в районе исходных значений перед каждым новым животного помещается в камеру.

4 Плетизмография Анализ

НетТе: Для расчета дыхательных параметров, таких как дыхательный объем (V _T) и минутного объема следующие переменные должны быть измерены: частота дыхания (вдоха / мин), время общего дыхательного цикла (сек), вдохновения / времени истечения (Ti / Te, секунд) и изменение давления за счет каждого дыхательного объема (P _T). Рисунок 1 иллюстрирует переменные, которые можно измерить с следа. Следующие шаги использовать программное обеспечение (см материалы и таблицы оборудование) для измерения этих переменных. При анализе, избежать регионы сдерживания следа нюхают или движения. Для воспроизводимых результатов, по крайней мере, 5 секунд хорошего дыхания следа требуется. Для примера различных следов дыхания, на рисунке 5 и 6.

1. Откройте экран на весь экран, установить вид до 1: 1 и выберите 5 сек пригодных к использованию данных. Представитель снимок это показано на рисунке 5.
2. Откройте мини окно площадку данные найден в верхней части программ на вкладке датапад. Выберите канал 1 и выберите "измерения цикла" в левой колонке и 'среднюю циклическую высоту' в правой колонке.
   1. Выберите 'Вариант' и установить масштаб для определения минимального уровня пикового до 1 (мс). Это позволит обнаружить любой пикового значения и становится чрезвычайно важным при использовании мелких животных, которые производят малые колебания.
   2. Нажмите «OK». Это представит 'отклонение давления в связи с каждой дыхательного объема "(P _T) измерения.
3. В мини площадку данных, выберите "измерения цикла 'следуют' количество событий» и нажмите «OK». Это представит 'частоту' (е) измерения.
   1. Частота должна быть преобразована в вдохов / мин. Это делается путем умножения значения на 60 сек, и деления ответ на общее время записи (мин).
4. В мини площадку данных, выберите 'CYИзмерения цикл о 'следуют' период 'и нажмите' OK '. Это представит 'общее время дыхательного цикла' (T _малыш, сек) измерения.
5. Следующие шаги используются для создания макроинструкцию генерировать пиковые значения времени вдоха и выдоха. Убедитесь, курсор находится непосредственно над максимумом пика / корыта и добавлять свои комментарии к 9 последовательных пиков и впадин. Начните с пика колебаний, как показано на рисунке 5.
6. Впоследствии, выберите окно: площадка данных и столбец 1 В появившемся окне нажмите кнопку "выбора информацию" в левой колонке, 'длительность' в правой колонке и нажмите «OK».
7. Выберите макрос найден в верхней части программы, а затем начать запись. Теперь выберите команды: «Найти», «К», «Начало File" и нажмите "Найти".
8. Выберите команды: «Найти» и «Найти комментарии '. Введите тот же словосочетание из строки для поле для комментариев в ", содержащий" поле. Выберите 'Выберите в предыдущем пункте' вкладку и 'Найти'.
9. Выберите команды: «Добавить в площадку данных '. Далее, выберите макрос: макрокоманд и начать повторение. Количество окно повторите, что появляется должен быть установлен на 9.
10. Выберите команду: 'Найти следующий ". Выберите команду: 'Добавить в площадку данных'. Затем в меню макрокоманд и конечную повторения.
    1. Теперь выберите макрос и остановить запись. Сохраните и назовите макрос после числа животных. ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка макроса для каждого животного позволяет макрос, которые будут использоваться для продольных исследований и экономит время.
11. Теперь макрос можно запустить, чтобы получить вдохновение (T _I) и истечение срока действия (T _е) время между каждым комментарием. Данные появятся в канале 1 в деку. Действительно и вдохновение происходит последовательно и данные появятся в следующем порядке.
    1. Данные должны быть вручную разделить на вдоха и выдоха значений. Нормальное четыре значения данных каждого параметра для получения среднего T _я и Т _е.
12. После того, как первичные значения были получены дыхательный объем (V _T, мл) может быть рассчитана. Чтобы получить дыхательный объем уравнение Drorbaugh и Фенн ⁸ используется:
    V _T (мл) ₌ (P _T / P _K) X (V _K) X ((Т _{сердечника (P B} - Р _С)) / (Т _{сердечника (P B} - Р _С) - T _C (P _{B -} Р _CORE)))
    
    Где
    V _T: дыхательный объем
    P _к: отклонение давления в связи с каждой инъекцией 1 мл (Обратитесь к шагу 2,5)
    _Ядро T: Температура ядра каждого животного
    P _C: давление паров воды в камере температура X Относительная влажность в чаMBER
    T _C: температура в животных камере
    P _ядро: Давление при температуре тела (давление паров воды при температуре тела х 1.0)
    P _т: отклонение давления в связи с каждой дыхательного объема
    V _к впрыска Объем для калибровки
    P _B: Атмосферное давление
    
13. После того, как дыхательный объем был рассчитан следующие параметры также могут быть определены:
    • Минутный объем (мл / мин) = V _T XF
    • Минутный объем (мл / мин / кг) = (V _T XF) / Вес тела (кг)
    • V _T (мл / кг) = V _T (мл) / Вес тела (кг)
    • Вдоха Рабочий цикл (%) = T _/ т _малыш
    • Вдоха Расход (мл / сек) = V _T / _{T я}
    • Соотношение времени вдоха к времени выдоха = T _/ т _е
    • Общее время цикла (сес) = Время вдоха (сек) + истечению времени (сек)

Результаты

Когда эта процедура применялась и правильно, в соответствии колебательный трассировки создается на программное обеспечение для анализа данных. Процедура обеспечивает дыхательную след в течение нескольких минут после установки с простых вычислительных расчетов для определения дыха...

Обсуждение

Техника, описанная здесь является неинвазивным методом для оценки дыхательных параметров безудержных и наркозу мышей. Сильными сторонами этого протокола включают его простоту и точность измерения функции легких продольно с минимальными артефактами. Есть, однако, некоторые ограниче?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabChart 7 software (for Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	used in protocol step 4
PowerLab 8/30 (model ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Black BNC to BNC cable (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 or later
Surgipack Digital Rectal Thermometer	Vega Technologies	MT-918
Grass volumeteric pressure transducer PT5A	Grass Instruments Co.	Model number PT5A; serial No. L302P4.
1 ml Syringe	Becton Dickinson (BD)	309628
5 ml Serological syringe pipettes	Greiner Bio One	606160	Connected via plastic tubing
Balance/Scales	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Any weighing balance with of 0.1 gram resolution
HM40 Humidity & temperature meter	Vaisala	HM40A1AB
Barometer	Barometer World	1586
Laboratory tubing	Dow Corning	508-101	Used to connect water column to the syringe and pressure transducer
Cylindrical Perspex Chamber	Dynalab Corp.		Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter.
80% Ethanol (4 L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP