Misurare funzione respiratoria nei topi mediante sfrenato Pletismografia corpo intero

Riepilogo

La valutazione della fisiologia respiratoria ha tradizionalmente invocato tecniche, che richiedono immobilizzazione o sedazione dell'animale. Sfrenato pletismografia tutto il corpo, tuttavia, fornisce preciso, non invasivo, l'analisi quantitativa della fisiologia respiratoria in modelli animali. Inoltre, la tecnica permette ripetuta valutazione respiratorie di topi consentano studi longitudinali.

Abstract

La disfunzione respiratoria è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo e tassi di mortalità continuano a salire. Valutazione quantitativa della funzione polmonare in modelli di roditori è uno strumento importante per lo sviluppo di future terapie. Comunemente usato tecniche di valutazione della funzione respiratoria compresa pletismografia invasiva e oscillazione forzata. Mentre queste tecniche forniscono informazioni preziose, la raccolta dei dati può essere pieno di artefatti e la variabilità sperimentale a causa della necessità di anestesia e / o strumentazione invasiva dell'animale. Al contrario, sfrenato pletismografia tutto il corpo (UWBP) offre una precisa non invasivo, modo quantitativo, per cui per analizzare i parametri respiratori. Questa tecnica evita l'uso di anestesia e restrizioni, che è comune alle tecniche tradizionali pletismografia. Questo video dimostrerà la procedura UWBP compresa l'attrezzatura installata, calibrazione e registrazione funzione polmonare. Essospiegherà come analizzare i dati raccolti, nonché di identificare valori anomali sperimentali e manufatti derivanti dai movimenti degli animali. I parametri respiratori ottenuti con questa tecnica includono volume corrente, il volume minuto, inspiratorio duty cycle, velocità di flusso inspiratorio e il rapporto tra tempo di ispirazione per tempo di scadenza. UWBP non si basa su competenze specialistiche ed è poco costoso da eseguire. Una caratteristica fondamentale di UWBP, e più attraente per i potenziali utenti, è la capacità di eseguire misure ripetute della funzione polmonare sullo stesso animale.

Introduzione

La disfunzione polmonare è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo. La condizione è caratterizzata da scambio di ossigeno insufficiente, sinonimo di tosse, dolori al petto e dispnea. Conti malattie delle vie respiratorie per ~ 10% di mortalità in tutto il mondo ^1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, i tassi di mortalità sono destinate ad aumentare a causa del fumo persistente, inquinamento e sostanze irritanti professionali. UWBP è un'aggiunta utile per studiare la fisiologia del polmone, che complimenta fortemente biochimica e istologica tradizionale analisi ^2. Altre procedure utilizzate per la valutazione del polmone non forniscono gli stessi vantaggi UWBP. Pletismografia invasiva è una tecnica comunemente usata che richiede l'animale deve essere anestetizzati ^3,4 e, quindi, le misurazioni respiratorie risultanti non sono necessariamente riflettente di uno stato naturale. Inoltre, l'obbligo per le sfide di ventilazione e chimiche meccaniche preclude misurazioni future ^3,4.Un altro metodo di raccolta dati respiratorio è di oscillazione forzata, che è più sensibile alle variazioni dei parametri più fine respiratorie rispetto al UWBP ^5. Oscillazione forzata è, tuttavia, una tecnica invasiva e richiede terminazione animale per la raccolta di dati ^5-7.

UWBP prevede il posizionamento di un animale all'interno di una camera specializzata. Durante l'inspirazione, l'aria di marea è riscaldata e umidificata all'interno dei polmoni crescente pressione del vapore acqueo e provoca dilatazione termica dei gas ^8. Questo effetto provoca un cambiamento netto del volume d'aria crea un aumento della pressione all'interno della camera pletismografo ^8. L'opposto si verifica durante l'espirazione la creazione di una forma d'onda respiratoria dall'animale. Analisi della forma d'onda viene poi utilizzato per misurare dalla traccia respiratoria: frequenza respiratoria (respiri / min), tempo totale ciclo di respirazione (sec), inspirazione / espirazione tempo (Ti / Te, sec) e le variazioni di pressione dovute a ciascun volume corrente (P _T). Figura 1 illustra ogni origine misurazioni da una traccia respiratorio. Queste misure sono semplici da calcolare e più parametri respiratori possono essere derivate da queste misure. Questi parametri includono: Volume corrente (il volume di aria spostata tra inspirazione ed espirazione normale), il volume minuto (volume di gas inalato dai polmoni al minuto), inspiratorio ciclo di lavoro (la percentuale di tempo ispirazione per la durata totale del ciclo di respirazione) e flusso inspiratorio (la quantità di aria inspirata in un dato tempo).

UWBP fornisce preciso, non invasivo, l'analisi quantitativa della fisiologia respiratoria in modelli animali e può essere utilizzato per misurare la progressione della malattia respiratoria e la funzione polmonare ^6,9. Contrariamente ad altre tecniche pletismografia, UWBP evita l'uso di anestesia, restrizioni e manipolazioni invasive che producono manufatti e sperimentale variabilità ^6,9. L'anestesia può sopprimere la respirazione,alterare la frequenza cardiaca e può essere difficile per regolare ^10. Restrizioni inducono un aumento della respirazione a causa di ulteriore stress tramite corticosterone e adrenalina rilasciano ^11,13. La caratteristica fondamentale di UWBP si ripete la valutazione fisiologica che lo rende suscettibile di studi longitudinali. UWBP è fortemente raccomandato per la valutazione longitudinale della fisiologia del polmone e offre una competenza preziosa per il futuro la valutazione dei farmaci respiratori.

Bleomicina, ovoalbumina, e ipossia sono stati utilizzati per indurre problemi respiratori in diversi studi e UWBP è misurato con successo polmone accurata valutazione fisiologica ^7,9,13-16. Il protocollo descritto è stato progettato per topi di laboratorio adulti standard. Tuttavia, UWBP è stato adattato ad altri animali come i ratti, cavie e primati non umani ^17-20. UWBP non si limita solo a valutare la disfunzione polmonare, ma è stato utilizzato anche per la valutazione della maturazione polmonare ^3.La versatilità, la semplicità e la riproducibilità dei UWBP hanno stabilito una tecnica eccellente per la valutazione della funzione polmonare in animali. Software diversi (vedi tabella materiali e attrezzature) saranno tenuti a seguire questa procedura. Uno scienziato esperto sarebbe in grado di eseguire questo protocollo con il mouse all'interno di 1 ora.

Protocollo

NOTA: La seguente procedura sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico degli animali presso la Monash University e condotto in conformità con il Codice di condotta australiano per la cura e uso degli animali per fini scientifici (2006). Adulti di sesso femminile C57BL / 6 topi utilizzati per generare i risultati rappresentativi sono stati ottenuti dai Servizi Animal Monash. I topi sono stati alloggiati in uno specifico patogeno libero, temperatura e umidità ambiente controllata con un ciclo luce-buio 12 ore. Questi topi hanno avuto libero accesso a cibo e acqua.

1 Impostazione iniziale

1. Collegare il portatile / desktop per la macchina di acquisizione dati per la registrazione tramite un cavo USB.
2. Collegare l'amplificatore Bridge da 'uscita 1' a 'ingresso 1' della macchina acquisizione di dati tramite un cavo BNC.
3. Inserire il trasduttore di pressione in 'canale 1' della Octal Ponte Amp. Accendere la macchina di acquisizione dati e aprire il software di analisi. Il software dovrebbe autorilevare automaticamente la configurazione apparecchiature (vedi Materiali e attrezzature tabella).
4. Impostazioni canale aperto presenti nella barra degli strumenti di configurazione del software. Modificare il numero di canali in fase di registrazione a 1.
5. Impostare il barometro per misurare la pressione in camera e l'apparato colonna d'acqua per calibrare l'amplificatore Bridge. L'apparato colonna d'acqua comprende due pipette siringa da 5 ml sierologiche collegati da tubi in plastica.
6. Riempire le colonne con acqua e assicurano i livelli dell'acqua sono equilibrati con un righello. Collegare un pezzo di tubo di plastica alla parte superiore di ogni pipetta. Figura 2 mostra la colonna d'acqua impostata.

2 Ponte Amplificatore con calibrazione

Nota: Per calibrare l'amplificatore ponte un'iniezione di aria nella colonna d'acqua è necessaria per creare da 1 cm H ₂ O deflessione. Questo si verifica in un unico insieme di condizioni e dipende apparato dell'utente. Per chiarire questi passaggi demonstrate come questo laboratorio dovrebbe eseguire la calibrazione.

1. Prelevare una siringa da 1 ml a 300 ml; collegare la siringa al rubinetto alla fine del tubo sul lato destro della colonna d'acqua. NOTA: Assicurarsi che il rubinetto è aperto alla siringa e la colonna d'acqua, e chiuse l'aria ambiente. Se i livelli d'acqua non sono equilibrati, a questo punto, ruotare il rubinetto in modo che sia aperto all'aria ambiente e la colonna d'acqua, questo riequilibrare l'acqua. Il tubo sul lato sinistro della colonna d'acqua deve essere collegato al trasduttore di pressione per misurare la variazione di pressione indotta immergendo la siringa.
2. Collegare il tubo dalla colonna d'acqua sul lato sinistro al connettore sul trasduttore di pressione (anello superiore del trasduttore).
3. Selezionare il menu a scorrimento verso il basso trovato accanto al canale 1 nella schermata principale sul lato destro del software e selezionare "amp Bridge" (vedi tabella materiali e attrezzature).
4. Entrarele impostazioni a 5 mV, 20 Hz passa basso, barrare la casella 'invertito' e fare clic su 'zero'. Fare clic su 'zero' per impostare la traccia a ~ 0 mV. Ridurre le dimensioni della finestra di 4: 1 per facilitare la visualizzazione.
5. Con tutto impostato, premere la siringa da 1 ml e lasciarla riposare per 3 sec. Questo mostrerà un improvviso picco sul software, perché la pressione è cambiata. Quando i 300 ml vengono premuti la pressione si sposterà l'acqua nella colonna d'acqua di 1 cm. Questo valore noto aiuterà calibrare l'amplificatore Bridge.
   NOTA: L'aumento della pressione nella camera a causa della depressione 300 microlitri corrisponde al valore P _K utilizzato per i calcoli successivi.
6. Seleziona 'unità di ingresso' trovato nell'angolo inferiore sinistro della finestra di Bridge Amp.
7. Evidenziare la "traccia di sfondo" prima del picco altrimenti conosciuta come la 'Regione Zero'.
   1. Fare clic sulla freccia accanto al 'punto 1' e questo produrrà il bacsegnale kground all'interno della gamma di -0.002 mV-0,002 mV (il valore sarà mai esattamente a 0 mV).
   2. Tipo '0' nella finestra adiacente alla finestra segnale di fondo.
8. Evidenziare il "aumento della pressione della regione grafico" da quando la siringa è depresso. Fare clic sulla freccia accanto al punto 2 e il valore dovrebbe essere nella gamma di 0,9-1,2 mV.
   1. Tipo '1' nella finestra accanto alla finestra "aumento della pressione". Per un chiarimento visiva sui punti 2.7 e 2.8 fare riferimento alla Figura 3. Valori trovati di fuori dei limiti può indicare danni al ottale Ponte Amp.
9. Vai a 'definire unità' trovato in alto a destra della finestra e selezionare "cmH ₂ O". Se questa opzione non è disponibile, può essere inserito manualmente. Fare clic su OK.
10. Ritorna al menu 'Ponte Amp' (vedi 2.1). Selezionare 1 mV e impostare l'amplificatore a 'zero';. Questo completerà la calibrazione e la colonna d'acqua può essere tranquillamente rimosso.

3. Recording funzione polmonare

1. Pesare il mouse (g). NOTA: Una settimana prima valutazione fisiologica introdurre il mouse per l'ambiente della camera pletismografia. Ciò sarà di aiuto nel acclimatazione e ridurre lo stress nello svolgimento di questa procedura in un secondo momento. Per uno schema generale che dimostra la configurazione UWBP, si prega di fare riferimento alla Figura 4.
2. Misurare la temperatura corporea con un termometro rettale. Lubrificare il termometro con vaselina prima dell'inserimento. Registrare la lettura della temperatura e pulire il lubrificante fuori con l'80% (v / v) di etanolo. Se si utilizza molto piccoli animali come cuccioli neonatali del mouse, il valore di temperatura corporea media può essere determinata con un termometro a infrarossi, invece.
3. Posizionare la / sonda di umidità relativa temperatura sulla fine di un buco della camera pletismografia. Registrare la temperatura, l'umidità e barometric pressione all'interno della camera pletismografia prima di mettere il mouse all'interno.
4. Posizionare il mouse nella camera pletismografia, coprire l'estremità aperta leggermente. Questo permette al mouse per acclimatarsi. Chiudere la camera.
5. Con la sonda di temperatura / umidità inserito nel lato della camera pletismografia con un foro, ora inserire il trasduttore e la siringa nell'altro lato con i due fori.
6. Premere 'Start' sul programma software e registrare per circa 15-45 sec. Record 5-10 sec di dati in cui l'animale non si muove. Movimento cambierà basale fisiologia respiratoria dell'animale e forniscono scarsi risultati. La respirazione dovrebbe oscillare in un percorso lineare sul programma. Questi sono dati utilizzabili. Nota: minzione o defecazione può portare ad un aumento della temperatura e l'umidità all'interno della camera pletismografia. Questo oscurare i risultati durante l'analisi. In caso di minzione o la defecazione, interrompere la registrazione immediatamente e pulire la plcamera ethysmography con 80% (v / v) di etanolo. Fare riferimento alla Figura 6 per una rappresentazione visiva dei risultati non ottimali, in cui i dati devono essere respinte.
7. Dopo aver registrato per 45 secondi, premere il tasto 'Stop' del software (vedi Materiali e attrezzature tabella) programma. Rimuovere il mouse dalla camera pletismografia e registrare immediatamente la temperatura della camera e l'umidità. Non sempre registrare per più di 45 secondi in quanto ciò potrebbe sottolineare l'animale.
8. Ritorna il mouse per sua gabbia, spray e pulire la camera con il 80% (v / v) di etanolo.
9. Lasciare la camera asciugare e riprendere temperatura basale e umidità prima di procedere alla prossima mouse. Ripetere i passaggi 3,1-3,9 per gli animali successive. Nota: se sono allo studio diversi animali, in modo che la temperatura della camera e il ritorno di umidità a valori basali vicino prima di ogni nuovo animale viene messo nella camera.

4. Pletismografia Analisi

NoTE: Per calcolare i parametri respiratori come volume corrente (V _T) e il volume minuto le seguenti variabili devono essere misurati: frequenza respiratoria (respiri / min), tempo di ciclo respiratorio totale (sec), inspirazione / espirazione tempo (Ti / Te, secondi) e variazione della pressione dovuta a ciascun volume corrente (P _T). Figura 1 illustra le variabili che possono essere misurati da una traccia. Le seguenti operazioni utilizzano un software (vedi tabella materiali e attrezzature) per misurare queste variabili. Quando si analizzano, evitare le regioni della traccia contenente sniffing o movimento. Per ottenere risultati riproducibili, almeno 5 secondi di buona traccia respirazione è necessaria. Per un esempio di diverse tracce di respirazione riferimento alla Figura 5 e 6.

1. Aprire la schermata a schermo intero, vista impostato a 1: 1 e selezionare 5 sec di dati utilizzabili. Una fotografia rappresentante di questo è mostrato in Figura 5.
2. Aprire la finestra data pad mini trovate all'inizio della programmo nella scheda datapad. Selezionare il canale 1 e selezionare "cycle" nella colonna di sinistra e 'altezza media ciclico' nella colonna di destra.
   1. Seleziona 'Opzioni' e impostare la scala per il rilevamento di picco minimo di 1 (msec). Ciò consentirà il rilevamento di ogni valore di picco e diventa estremamente importante quando si utilizzano piccoli animali che producono piccole oscillazioni.
   2. Fare clic su 'OK'. Questo presenterà 'deflessione della pressione a causa di ciascun volume corrente' (P _T) misura.
3. Nel mini pad dati, selezionare 'cycle' seguito da 'conteggio degli eventi' e fare clic su 'OK'. Questo presenterà la 'frequenza' (f) di misura.
   1. Frequenza deve essere convertito in respiri / min. Questo viene fatto moltiplicando il valore da 60 sec e dividendo il risultato per il tempo complessivo di registrazione (min).
4. Nel mini pad dati, selezionare cy 'misurazioni CLE 'seguito da' periodo 'e fare clic su' Ok '. Questo presenterà il 'tempo di ciclo respiratorio totale' (T _tot, sec) misura.
5. I passi successivi sono utilizzati per creare un macroinstruction per generare valori di tempo di inspirazione e di scadenza di picco. Assicurarsi che il cursore si trova direttamente sopra il massimo del picco / minimo e aggiungere un commento su 9 picchi sequenziali e bassi. Iniziare con il picco di oscillazione come mostrato in figura 5.
6. Successivamente, selezionare la finestra: data pad e colonna 1 Nella finestra che appare fare clic su 'informazione di selezione' nella colonna di sinistra, 'durata' nella colonna di destra e fare clic su 'OK'.
7. Seleziona macro trovato nella parte superiore del programma e quindi avviare la registrazione. Ora selezionare i comandi: 'Trova', 'Go', 'Start di File' e cliccare su 'Cerca'.
8. Selezione di comandi: 'Trova' e 'i commenti'. Digitare la stessa frase digitato per la casella di commento nella casella 'contenente' fornito. Selezionare la scheda 'Seleziona per punto precedente' e 'Cerca'.
9. Selezione di comandi: 'Aggiungi al pad dati'. Quindi, selezionare macro: i comandi macro e cominciare ripetere. La finestra numero di ripetizioni che appare dovrebbe essere fissato a 9.
10. Comando SELECT: 'Trova successivo'. Selezionare il comando: 'Aggiungi al pad dati'. Infine selezionare i comandi macro e fine ripetizione.
    1. Ora selezionare la macro e interrompere la registrazione. Salvare e denominare la macro dopo il numero degli animali. NOTA: Impostare la macro per ogni animale consente la macro da utilizzare per studi longitudinali e fa risparmiare tempo.
11. La macro può ora essere eseguito per ottenere l'Inspiration (T _i) e scadenza (T _e) tempo tra ogni commento. I dati vengono visualizzati sotto il canale 1 della datapad. Scadenza e ispirazione avviene consecutivamente ei dati appariranno in questo ordine.
    1. Occorre dividere manualmente in valori di inspirazione e di espirazione i dati. Calcolare la media dei quattro valori di dati di ciascun parametro per ottenere la media T _i e T _e.
12. Una volta che i valori primari sono stati derivati ​​il volume corrente (V _T, ml) può essere calcolato. Per ottenere il volume corrente viene utilizzata l'equazione di Drorbaugh e Fenn ^8:
    V _T (ml) ₌ (P _T / P _K) x V _(K) x ((T _NUCLEO (P _B - P _C)) / (T _NUCLEO (P _B - P _C) - T _C (P _{B -} P _CORE)))
    
    Dove
    V _T: Volume corrente
    P _k: flessione a causa della pressione di ogni iniezione di 1 ml (fare riferimento al punto 2.5)
    T _{di base:} temperatura al cuore di ogni animale
    P _C: pressione di vapore dell'acqua a camera a temperatura X Umidità relativa in chamber
    T _C: temperatura nella camera di animali
    P _nucleo: Pressione alla temperatura corporea (pressione del vapore acqueo a temperatura corporea x 1.0)
    P _t: deflessione della pressione a causa di ciascun volume corrente
    V _k: Volume di iniezione per la calibrazione
    P _B: pressione barometrica
    
13. Una volta che il volume corrente è stato calcolato i seguenti parametri possono essere determinate anche:
    • Volume minuto (ml / min) = V _T xf
    • Volume minuto (ml / min / kg) = (V _T xf) / Peso corporeo (kg)
    • V _T (ml / kg) = V _T (ml) / Peso corporeo (kg)
    • Duty Cycle inspiratoria (%) = T _i / T _tot
    • Inspiratorio Portata (ml / sec) = V _T / T _i
    • Rapporto tra tempo di ispirazione per scadenza T = _i / T _e
    • Tempo di ciclo totale (sec) = tempo Inspiration (sec) + tempo di scadenza (sec)

Risultati

Quando questa procedura è stata seguita correttamente, una traccia oscillante coerente viene creato il software di analisi dei dati. La procedura prevede una traccia respiratoria entro pochi minuti dopo la configurazione con calcoli semplici di calcolo per determinare i parametri respiratori elencati. Figura 5 rappresenta una traccia di respirazione adeguato da un controllo (sano) del mouse. Appropriato dati oscillante è prodotto quando l'animale non si muove attivamente.

Discussione

La tecnica qui descritta è un metodo non invasivo per la valutazione dei parametri respiratori di topi sfrenato e non anestetizzati. I punti di forza di questo protocollo sono la sua semplicità e precisione per misurare la funzione polmonare longitudinalmente con artefatti minimi. Vi sono, tuttavia, alcuni limiti e punti critici da rilevare sulla procedura. In primo luogo e soprattutto, il mouse deve mantenere la calma all'interno della camera per un minimo di cinque secondi. Aggiunto lo stress interromperà il pa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabChart 7 software (for Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	used in protocol step 4
PowerLab 8/30 (model ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Black BNC to BNC cable (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 or later
Surgipack Digital Rectal Thermometer	Vega Technologies	MT-918
Grass volumeteric pressure transducer PT5A	Grass Instruments Co.	Model number PT5A; serial No. L302P4.
1 ml Syringe	Becton Dickinson (BD)	309628
5 ml Serological syringe pipettes	Greiner Bio One	606160	Connected via plastic tubing
Balance/Scales	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Any weighing balance with of 0.1 gram resolution
HM40 Humidity & temperature meter	Vaisala	HM40A1AB
Barometer	Barometer World	1586
Laboratory tubing	Dow Corning	508-101	Used to connect water column to the syringe and pressure transducer
Cylindrical Perspex Chamber	Dynalab Corp.		Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter.
80% Ethanol (4 L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP