무제한 전신 혈량 측정법을 사용하여 마우스의 호흡 기능을 측정

요약

호흡 생리학의 평가는 전통적으로 동물의 억제 또는 진정을 요구 기술에 의존하고있다. 무제한 전신 혈량 측정법은, 그러나, 동물 모델에서 호흡 생리의 정확하고 비 침습적 정량 분석​​을 제공합니다. 또한, 기술은 종 연구를 허용 마우스의 호흡 평가를 반복 할 수 있습니다.

초록

호흡기 장애는 최고의 세계에서 이환율과 사망률의 원인과 사망의 비율이 계속 증가 중 하나입니다. 설치류 모델에서 폐 기능의 정량 평가는 미래의 치료법의 개발에 중요한 수단이다. 일반적 침습적 혈량 측정법 및 강제 진동 포함 호흡 기능을 평가하는 기술을 사용했다. 이러한 기술은 가치있는 정보를 제공하지만, 데이터 수집 인해 마취 및 / 또는 동물의 침습 계측 필요성 인공물과 실험 가변성을 내포 할 수있다. 반면, 무제한 전신 혈량 측정법 (UWBP)은 호흡기 매개 변수를 분석하는 기준에 정확하고 비 침습적 정량 방법을 제공합니다. 이 기술은 기존의 기술 혈량 측정법에 공통 마취와 감금의 사용을 피한다. 이 동영상은 기기 설정, 교정 및 폐 기능의 기록을 포함하여 UWBP 절차를 시연 할 예정이다. 그것은수집 된 데이터를 분석하고,뿐만 아니라 동물의 이동으로 인한 실험적 인공물과 특이점을 식별하는 방법을 설명 할 것이다. 이 기술을 사용하여 수득 호흡 파라미터 호흡량, 체적 분, 흡기 듀티 사이클, 흡기 유량과 만료 시간에 흡기 시간의 비율을 포함한다. UWBP는 전문 기술에 의존 수행 저렴하지 않습니다. 잠재적 인 사용자에게 가장 매력적인 UWBP 키의 기능과 동일한 동물에 폐 기능의 반복 된 측정을 수행 할 수있는 능력이다.

서문

폐 기능 장애는 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 조건은 기침, 가슴 통증 및 호흡 곤란과 동의어 함 산소 교환이 특징입니다. 사망률 세계 ¹ ~ 10 %에 대한 호흡기 질환 차지한다. 세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 사망률은 지속적으로 흡연, 환경 오염 및 직업 자극에 의​​한 상승으로 설정됩니다. UWBP 강하게 전통적인 생화학 칭찬 조직 ^{학적는이 분석} 폐 생리학을 공부하는 데 유용한 추가이다. 폐 평가를 위해 사용 된 다른 절차 UWBP와 동일한 장점을 제공하지 않는다. 침략 혈량 측정법은 동물이 ^3,4 anesthetised 할 수있어, 그 결과 호흡 측정이 반드시 자연 상태를 반영하지 않습니다 필요로하는 일반적으로 사용되는 기술이다. 또한, 기계 환기 및 화학 문제에 대한 요구 사항은 향후 측정 ^3,4 배제.호흡 데이터를 수집하는 또 다른 방법은 UWBP ^5에 비해 호흡 파라미터의 변화를보다 세밀한 더 민감 강제 진동에 의해서이다. 강제 진동 그러나 침습적 인 기술이며, 데이터 수집을위한 동물 ^5-7 종료를 요구한다.

UWBP는 전문 챔버 내부에 동물을 배치하는 것을 포함한다. 영감 동안 조력 공기는 가온되고 물의 증기압을 증가 폐 내에 가습 가스 ^(8)의 열팽창을 발생. 이 효과는 plethysmograph 실 ⁽⁸⁾ 내의 압력의 증가를 생성 풍량의 순 변화시킨다. 반대는 동물에서 호흡 파형을 생성 만료시 발생합니다. 파형 분석은 다음 호흡 추적에서 측정하는 데 사용됩니다 : 호흡 속도 (호흡 / 분), 총 호흡 사이클 시간 (초), 영감 / 만료 시간 (티 / 테, 초) 인해 각 호흡량에 대한 압력의 변화 (P _T). 그림 1은 호흡 추적에서 각 측정 원점을 보여줍니다. 이러한 측정은 계산이 간단하고 다수의 호흡 파라미터는 이러한 측정치로부터 유도 될 수있다. 이러한 매개 변수는 다음과 같습니다 호흡량 (공기의 부피가 정상 흡입 및 호기 사이에서 이동), 분 체적 (분당 폐에서 흡입 가스의 체적), 흡기 듀티 사이클 (총 호흡주기 기간에 흡기 시간의 비율) 및 흡기 유량 (주어진 시간에 영감 공기의 양).

UWBP은 동물 모델에서의 정확한 생리 호흡기, 비 침습적, 정량 분석을 제공하고, 호흡기 질환 및 폐 기능 ^6,9의 진행을 측정하기 위해 사용될 수있다. 혈량 측정법 다른 기술과는 달리, UWBP 마취, 구속 및 인공물 및 실험 가변성 ^{6,9 생산} 침습적 조작의 사용을 피한다. 마취는 호흡을 억제 할 수심장 박동을 변경하고 ^열을 조절하기 어려울 수 있습니다. 코르티 코스 테론과 에피네프린 ^{11,13 해제를} 통해 감금으로 인해 추가적인 스트레스 호흡의 증가를 유도한다. UWBP의 주요 기능은 종의 연구에이 의무가 만드는 생리 학적 평가를 반복한다. UWBP 강하게 폐 생리학의 길이 평가 추천 및 미래의 호흡기 약물 평가를위한 가치있는 기술을 제공합니다.

블레오 마이신, 오브 알부민, 및 저산소증은 몇몇 연구에서 호흡 문제를 유도하기 위해 이용되었고 UWBP 성공적 정확한 폐 생리 ^{7,9,13-16 평가를} 측정 하였다. 설명하는 프로토콜은 표준 성인 실험실 쥐를 위해 설계되었습니다. 그러나 UWBP는 래트, 기니아 피그 및 영장류 ^17-20로 다른 동물에 적용되었다. UWBP은 폐 기능 장애를 평가에 한정되지 않고, 또한 폐 성숙 ^(3)의 평가를 위해 사용되었다.UWBP의 다양성, 단순하고 재현성 동물의 폐 기능을 평가하기위한 훌륭한 기술을 설립했다. 다양한 소프트웨어 (재료 및 장비 표 참조)이 절차를 수행해야합니다. 숙련 과학자 1 시간 내에 마우스이 프로토콜을 수행 할 수있을 것이다.

프로토콜

참고 : 다음 실험 절차는 모나 쉬 대학의 동물 윤리위원회의 승인을 과학적 목적을위한 동물의 관리 및 사용 (2006)에 대한 연습의 호주 코드에 따라 수행된다. 대표적인 결과를 생성하는 데 사용 성인 여성의 C57BL / 6 마​​우스는 모나 동물 서비스로부터 수득 하였다. 마우스는 12 시간 명암주기에 특정 병원균 무료, 온도 및 습도 조절 실에 보관 하였다. 이 마우스는 음식과 물을 무료로 이용할 수 있었다.

1 초기 설정

1. USB 케이블을 통해 기록하기위한 데이터 수집 시스템으로 노트북 / 데스크탑을 연결합니다.
2. BNC 케이블을 통해 데이터 수집 시스템의 '입력 한'에서 '출력 1'에서 브리지 앰프를 연결합니다.
3. 진수 브리지 앰프의 '채널 1'에 압력 변환기를 삽입합니다. 에 대한 데이터 수집 시스템의 전원을 켜고 분석 소프트웨어를 엽니 다. 소프트웨어 자동해야자동적 (재료 및 장비 표 참조) 장비 설치를 감지합니다.
4. 소프트웨어의 설치 도구 모음에있는 오픈 채널 설정. 변경 채널의 수는 (1)에 기록된다.
5. 실내 압력과 브리지 증폭기를 보정 물기둥 장치를 측정하는 기압계를 설정. 물 열 장치는 플라스틱 튜브로 연결이 5 ㎖의 혈청 학적 주사기 피펫을 포함한다.
6. 물에 열을 채우고 수위가 통치자와 균형을 보장합니다. . 각 피펫의 상단에 플라스틱 튜브의 한 조각을 연결합니다이 그림은 물 열 설정을 보여줍니다.

2 다리 앰프 교정

주 : 수층으로 브리지 앰프보기 공기의 분사를 보정하는 1cm H ₂ O 편향을 만들 필요가있다. 이 조건 중 하나의 세트에서 발생하고, 사용자의 장치에 의존 할 것이다. 명확한 설명을 위해 다음 단계 ㄹ이 연구소는 보정을 수행하는 방법을 emonstrate.

1. 300 μL에 1 ML의 주사기를 철회; 수층의 오른쪽에 호스의 끝에 콕에 주사기를 장착. 참고 : 꼭지는 주사기와 물 열에게 열려 있는지 확인하고 실내 공기에 마감했다. 수위가이 시점에서 균형을하지 않는 경우는 실내 공기와 물 컬럼 열려 있는지,이 물을 재조정 할 수 있도록, 꼭지를 틀어 라. 수층의 좌측 튜브 주사기 급락에 의한 압력 변화를 측정하는 압력 변환기에 연결한다.
2. 압력 변환기 (변환기의 톱링)의 커넥터 왼쪽에 물기둥에서 튜브를 부착.
3. 소프트웨어의 오른쪽에있는 메인 화면에서 1 채널 및 "브리지 A를"(재료 및 장비 표 참조)을 선택 옆에있는 스크롤 다운 메뉴를 선택합니다.
4. 입력5 MV, 20 Hz에서 로우 패스에 설정이 '반전'상자를 체크하고 '제로'를 클릭합니다. 0 ~ MV에 추적을 설정하는 '영'​​을 클릭합니다. 보기 쉽게 1 : 4로 창 크기를 줄입니다.
5. 설정 모든으로, 3 초 정도를 떠나, 1 ML의 주사기를 우울. 압력이 변경 되었기 때문에 이것은 소프트웨어에 급격한 스파이크를 보여준다. 300 ㎕의 우울하면 압력은 1cm에 의해 물 열에서 물을 이동합니다. 이 알려진 값은 브리지 앰프를 교정하는 데 도움이됩니다.
   NOTE : 300 μL 인해 우울증 챔버 내의 압력 증가가 나중에 계산에 사용 _K P _값에 대응한다.
6. 브리지 앰프 창의 왼쪽 아래에있는 '입력 장치'를 선택합니다.
7. 이전에, 그렇지 않으면 '제로 지역'으로 알려진 스파이크에 "배경 추적을"강조 표시합니다.
   1. 다음 '점 하나'에있는 화살표를 클릭하고이 혈중 알코올 농도를 생성합니다-0.002 MV-0.002 MV의 범위 내에서 kground 신호 (값이 정확히 0 MV에서 결코).
   2. 유형 "0"창에 백그라운드 신호 창에 인접.
8. 주사기 밟으면에서 "증가 된 압력의 그래프 영역을"강조. 이 지점 옆에있는 화살표를 클릭하고 값은 0.9-1.2 MV의 범위에 있어야합니다.
   1. 유형 '하나'옆에있는 "압력이 증가"창으로 창. 단계 2.7 및 2.8에 대한 시각적 설명이 들어 진수 브리지 앰프에 손상을 나타낼 수 있습니다 지정된 범위 외부에서 검출 3. 값을 그림을 참조하십시오.
9. 창의 오른쪽 상단 모서리에 발견 '단위 정의'를하고 _"CMH이 O"로 이동합니다. 이 옵션을 사용할 수없는 경우, 수동으로 입력 할 수 있습니다. 확인을 클릭합니다.
10. '브리지 앰프'메뉴로 돌아 가기 (2.1 참조). '제로'로 한 뮤직 비디오 및 설정 앰프를 선택;. 이 교정을 완료하고 물 열 안전하게 제거 할 수 있습니다.

3 녹화 폐 기능

1. 마우스 (g)를 달아. 참고 : 이전에 생리 학적 평가에 대한 하나의 주는 혈량 측정법 실 환경에 마우스를 소개합니다. 이 적응에 도움이와 나중에이 절차를 수행 할 때 스트레스를 줄일 수 있습니다. UWBP 설정을 보여 전체 회로도를 들어, 그림 4를 참조하십시오.
2. 직장 온도계 본체의 온도를 측정한다. 삽입하기 전에 석유 젤리 온도계를 윤활합니다. 온도 값을 기록하고 80 % (v / v) 에탄올로 윤활제를 닦아. 이러한 신생 마우스 새끼 매우 작은 동물을 사용하는 경우, 평균 체온 값 대신 적외선 온도계로 측정 할 수있다.
3. 혈량 측정법 실의 한 홀 끝의 온도 / 상대 습도 프로브를 놓습니다. 온도, 습도, barometr를 기록내 마우스를 배치하기 전에 혈량 측정법 챔버 내부의 IC 압력.
4. , 혈량 측정법 챔버에 마우스를 놓고 약간 오픈 엔드 커버. 이 마우스가 순응 할 수 있습니다. 챔버를 닫습니다.
5. 한 구멍이 혈량 측정법 챔버의 측면에 삽입 온도 / 습도 프로브, 지금이 구멍과 타측에서 변환기와 주사기를 삽입한다.
6. 약 15 ~ 45 초 동안 소프트웨어 프로그램 및 기록에 눌러 '시작'. 동물이 이동되지 않는 데이터의 기록 5 ~ 10 초. 운동은 동물의 기초 호흡 생리를 변경하고 가난한 결과를 얻을 수있을 것입니다. 호흡은 프로그램에 대한 선형 경로에 진동한다. 다음은 사용 가능한 데이터입니다. 참고 : 배뇨 또는 배변은 혈량 측정법 챔버 내부의 온도 증가와 습도로 이어질 수 있습니다. 이 분석에서 결과를 모호하게됩니다. 배뇨 또는 배변의 경우, PL 즉시 녹화를 중지 및 청소80 % (v / v)로 에탄올 ethysmography 실. 데이터가 거부되어야 차선의 결과를 시각적으로 표현한 그림 6을 참조하십시오.
7. 소프트웨어에 45 초를 눌러 '중지'에 대한 기록 후 프로그램 (자재 및 장비 표 참조). 혈량 측정법 실에서 마우스를 제거하고 즉시 챔버의 온도와 습도를 기록한다. 이 동물을 강조 수 있으므로 지속적으로 이상 45 초 동안 기록하지 마십시오.
8. 케이지, 스프레이에 마우스를 반환 80 % (v / v) 에탄올로 챔버를 닦습니다.
9. 챔버 건조하고 다음 마우스로 진행하기 전에 기준 온도와 습도로 돌아 허용합니다. 반복 3.1 이후 동물 용 3.9 단계를. 참고 : 여러 동물 연구되고있는 경우, 각각의 새로운 동물 전에 근처의베이스 라인 값으로 챔버 온도 및 습도 반환 챔버에 배치되어 있는지 확인합니다.

4 혈량 측정법 분석

없음테 : 같은 호흡량 (V의 _T) 다음과 같은 변수를 측정 할 필요가 분 볼륨과 호흡 매개 변수를 계산하기 : 호흡 속도 (호흡 / 분), 총 호흡 사이클 시간 (초), 영감 / 만료 시간 (티 / 테를, 인해 각 회 호흡량 (P _T). 초)와 압력의 변화가 1 트레이스에서 측정 될 수있는 변수를 도시 한 도표. 다음 단계는 이러한 변수를 측정하기 위해 소프트웨어 (참조 : 재료 및 기기 테이블)을 사용한다. 분석 할 때, 냄새 또는 이동 포함하는 추적의 지역을 피하십시오. 재현 가능한 결과를 들어, 좋은 호흡 추적의 5 초 이상이 필요합니다. 다른 호흡 흔적의 예를 들어 5와 그림 6을 참조하십시오.

1. 일을하고 사용할 수있는 데이터의 5 초를 선택 하나에 전체 화면으로 설정보기를 엽니 다. 이것의 대표적인 스냅 샷은 그림 5에 표시됩니다.
2. 프로의 상단에있는 미니 데이터 패드 창을 엽니 다DataPad 탭에서 g. 채널 1을 선택하고 오른쪽 열에서 왼쪽 열에서 '사이클 측정'및 '평균주기 높이'를 선택합니다.
   1. '옵션'을 선택하고 한 (밀리 초)에 최소 피크 검출을위한 스케일을 설정합니다. 이것은 모든 피크 값의 검출을 허용하고 작은 진동을 만들어 작은 동물을 사용하는 경우 매우 중요하게됩니다.
   2. '확인'을 클릭합니다. 이것은 (P의 _T) 측정 '으로 인해 각 호흡량에 압력 편향'을 발표 할 예정이다.
3. 미니 데이터 패드에서 '이벤트 카운트'와 다음 선택 '사이클 측정' '확인'을 클릭합니다. 이것은 '주파수'(F)의 측정을 제공한다.
   1. 주파수는 호흡 / 분으로 변환 할 필요가있다. 이 60 초만큼 값을 곱한 (분) 기록의 전체 시간에 답을 분할하여 수행됩니다.
4. 미니 데이터 패드에서 [ 'CY사이클 측정 기간 '다음' '후 "확인"을 클릭합니다. 이것은 "전체 호흡주기 시간 (T의 _TOT, 초) 측정을 제시한다.
5. 다음 단계는 피크 영감과 만료 시간 값을 생성하기 위해 macroinstruction을 만드는 데 사용됩니다. 커서가 피크 / 저점의 최대 바로 위에 확인하고 9 연속 최고점과 최저점에 댓글을 추가 할 수 있습니다. 도 5에 도시 된 바와 같이 진동의 피크 시작한다.
6. 그 후, 선택 창 : 데이터 패드와 오른쪽 열에서 왼쪽 열, '기간'에서 '선택 정보'를 클릭하고 '확인'을 클릭하여 나타나는 창에서 열 1.
7. 프로그램의 맨 위에 매크로 선택한 후 녹음을 시작합니다. 이제 선택 명령 : '파일의 시작', '이동', '찾기'와 '찾기'를 클릭합니다.
8. 선택 명령 '의견을 찾기' '찾기'와. 제공되는 '포함'상자에 설명 상자에 입력 한 동일한 구문을 입력합니다. '선택 이전 포인트'탭을 선택하고 '찾기'.
9. 선택 명령 : '데이터 패드에 추가'. 다음, 매크로 선택 매크로 명령을 반복을 시작합니다. 표시되는 반복 횟수 창이 구에서 설정해야합니다.
10. 명령을 선택합니다 : '다음 찾기'. 선택 명령의 데이터 패드에 추가 '. 마지막으로 매크로 명령과 종료를 반복을 선택합니다.
    1. 이제 매크로를 선택하고 녹음을 중지합니다. 저장하고 동물 번호 뒤에 매크로 이름을 지정합니다. 참고 : 각 동물에 대한 매크로를 설정 매크로는 길이 방향 연구에 사용 시간을 절약 할 수 있습니다.
11. 매크로는 현재 각 주석의 영감 (T의 _I) 및 만기 (T _전자) 시간을 얻기 위해 실행할 수 있습니다. 데이터는 datapad의 채널 1 아래에 나타납니다. 만료 및 영감 연속적으로 발생하고 데이터의 순서로 나타납니다.
    1. 데이터는 수동으로 영감과 만기 값으로 분할해야합니다. 평균 _I T 및 T _E를 얻기 위해 각 파라미터의 4 개의 데이터 값을 평균화.
12. 기본 값은 호흡량 (V _T, ㎖)를 도출 한 후 계산 될 수있다. Drorbaugh와 펜을 ^8의 식 사용되는 호흡량을 구하는 방법
    V _T (ML) ₌ (P _T / P _K) × (V _K) × ((T _CORE (P의 _B - P의 _C)) / (T _CORE (P의 _B - P _C) - T _C (P의 _{B -} P _CORE)))
    
    어디
    V의 _T : 호흡량
    P _K는 1 ㎖를 각각 주입에 의한 압력 편향 (2.5 단계를 참조하십시오)
    T _코어 : 각 동물의 코어 온도
    P _C : 차의 챔버 온도, 상대 습도 X 수증기압mber
    T _C : 동물 실의 온도
    P _코어 : 체온 기압 (체온에서 수증기압 × 1.0)
    P의 _t : 각 호흡량에 의한 압력 편향
    V _K는 보정을위한 대량 주입
    P의 _B : 기압
    
13. 호흡량이 계산되면 다음과 같은 매개 변수도 확인할 수 있습니다 :
    • 분 양 (㎖ / 분) = V _T의 XF
    • 분 양 (ml / 분 / kg) = (V _T의 XF) / 체중 (kg)
    • V의 _T (㎖ / kg) = V _T (ML) / 체중 (kg)
    • 흡기 듀티 사이클 (%)을 T _I / T _무비 =
    • 흡기 유량 (㎖ / 초) = V _T / T의 _전
    • 만료 시간에 영감 시간의 비율 = T _I / T _전자
    • 총 사이클 시간 (sEC) = 영감 시간 (초) + 만료 시간 (초)

결과

이 과정이 정확 하였다 되었으면 일관된 발진 트레이스 데이터 분석 소프트웨어에 생성된다. 절차는 간단 컴퓨팅 계산과 설치가. 나와 호흡 매개 변수를 결정 (5) 제어 (건강) 마우스에서 적절한 호흡 추적을 나타내는 그림 후 몇 분 이내에 호흡 추적을 제공합니다. 동물이 적극적으로 움직이지 않을 때 적절한 진동 데이터가 생성된다.

UWBP 제어 및 폐...

토론

여기에 설명 된 기술은 억제되지 않은 생쥐와 unanesthetized 호흡 파라미터의 평가를위한 비 침습적 방법이다. 이 프로토콜의 장점은 최소한의 인공물 길이 방향으로 폐 기능을 측정하는 단순하고 정밀도를 포함한다. 그러나, 몇 가지 제한 사항이 중요한 단계는 절차에 대해 주목해야한다이 있습니다. 먼저, 가장 중요하게, 마우스 다섯 초 동안 챔버 내에 침착한다. 마우스의 호흡 패턴을 방해하고, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabChart 7 software (for Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	used in protocol step 4
PowerLab 8/30 (model ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Black BNC to BNC cable (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 or later
Surgipack Digital Rectal Thermometer	Vega Technologies	MT-918
Grass volumeteric pressure transducer PT5A	Grass Instruments Co.	Model number PT5A; serial No. L302P4.
1 ml Syringe	Becton Dickinson (BD)	309628
5 ml Serological syringe pipettes	Greiner Bio One	606160	Connected via plastic tubing
Balance/Scales	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Any weighing balance with of 0.1 gram resolution
HM40 Humidity & temperature meter	Vaisala	HM40A1AB
Barometer	Barometer World	1586
Laboratory tubing	Dow Corning	508-101	Used to connect water column to the syringe and pressure transducer
Cylindrical Perspex Chamber	Dynalab Corp.		Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter.
80% Ethanol (4 L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP