El examen cuantitativo y cualitativo de las interacciones entre partículas Uso coloidal Sonda Nanoscopia

Resumen

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Resumen

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.^1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Introducción

Microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica que permite obtener imágenes cualitativa y cuantitativa de sondeo y de una superficie de material. ^4-6 Tradicionalmente, AFM se utiliza para la evaluación de la topografía de la superficie, la morfología y la estructura de los materiales multifásicos. AFM tiene la capacidad de evaluar cuantitativamente las interacciones a escala nanométrica, como las fuerzas de carga, de atracción, de repulsión y de adhesión entre una sonda y el sustrato específico en el aire y el medio líquido. ^7,8 La AFM desarrollado originalmente por Binning, Quate y Gerber ⁹ usos una sonda de conocidos / determinada sensibilidad y constante del resorte de acercarse y / o escanear una muestra. Debido a las interacciones físicas entre la sonda y la muestra, el voladizo se desvía durante el contacto o la proximidad y en función del modo de funcionamiento, esta desviación puede ser traducido para adquirir la topografía de las fuerzas presentes entre la sonda y la muestra de muestra o medida. Las modificaciones de la técnica AFMQue, como nanoscopía sonda coloidal, ¹⁰ han permitido científico para evaluar directamente las interacciones nano-fuerza entre dos materiales presentes en un sistema coloidal de interés.

En nanoscopía sonda coloidal, una partícula esférica de elección está unido a la cúspide de un voladizo, la sustitución de las puntas tradicionales cónicos y piramidales. Una partícula esférica es ideal para permitir la comparación con los modelos teóricos como el de Johnson, Kendal, Roberts (JKR) ¹¹ y Derjaguin, Landau, Vervwey, Overbeek (DLVO) ^12-14 teorías y reducir al mínimo la influencia de la rugosidad de la superficie en la medición. ¹⁵ Estas teorías se utilizan para definir la mecánica de contacto y las fuerzas entre las partículas esperados dentro de un sistema coloidal. La teoría DLVO combina las fuerzas de van der Waals atractiva y fuerzas electrostáticas repulsivas (debido a las capas dobles eléctricas) para explicar cuantitativamente el comportamiento de agregación de los sistemas coloidales acuosas, mientras que la JTeoría KR incorpora el efecto de la presión de contacto y la adherencia para modelar el contacto elástico entre dos componentes. Una vez que se produce una sonda apropiada, que se utiliza para acercarse a cualquier otro material / partículas para evaluar las fuerzas entre los dos componentes. Usando una punta estándar fabricado uno será capaz de medir fuerzas interactivas entre esa punta y un material de elección, pero la ventaja de utilizar una sonda coloidal por encargo permite la medición de las fuerzas presentes entre los materiales presentes en el sistema estudiado. Interacciones medibles incluyen:.. Adhesiva, atractivo, repulsivo, cargo, y las fuerzas electrostáticas presentes incluso entre las partículas ¹⁶ Por otra parte, la técnica de la sonda coloidal se puede utilizar para explorar las fuerzas tangenciales presentes entre las partículas y la elasticidad material de ^17,18

La capacidad para llevar a cabo mediciones en diferentes medios de comunicación es una de las principales ventajas de nanoscopía sonda coloidal. Condiciones ambientales, líquido media, o condiciones de humedad controlada se pueden usar para imitar las condiciones ambientales del sistema estudiado. La capacidad para llevar a cabo mediciones en un medio líquido permite el estudio de sistemas coloidales en un entorno que se produce naturalmente; por lo tanto, ser capaz de adquirir cuantitativamente datos directamente traducible al sistema en su estado natural. Por ejemplo, las interacciones de partículas presentes en los inhaladores de dosis medidas (IDM) se pueden estudiar usando un propelente líquido modelo con propiedades similares a las del propulsor utilizado en los IDM. Las mismas interacciones medida en el aire no sería representativa de la existente en el sistema de inhalador. Además, el medio líquido puede ser modificado para evaluar el efecto de la entrada de humedad, un tensioactivo secundario, o la temperatura en las interacciones de las partículas en un MDI. La capacidad para controlar la temperatura se puede utilizar para imitar ciertos pasos en la fabricación de sistemas coloidales para evaluar cómo la temperatura ya sea en la fabricación de oalmacenamiento de los sistemas coloidales puede tener un impacto en las interacciones de partículas.

Las mediciones que se pueden obtener utilizando sondas coloidales incluyen; Escaneo Topografía, curvas fuerza-distancia individuales, los mapas de adhesión vigor distancia, y habitar las mediciones de fuerza-distancia. Los parámetros clave que son medidos por el método de nanoscopía sonda coloidal se presenta en este documento incluyen los valores de energía de separación snap-in, carga máxima, y. Snap-in es una medida de las fuerzas de atracción, max cargar el valor de la fuerza máxima adhesión, y la energía de separación transmite la energía necesaria para retirar la partícula de contacto. Estos valores pueden ser medidos a través de mediciones instantáneas o fuerza de permanencia. Dos diferentes tipos de medidas de permanencia incluyen deflexión y la sangría. La longitud y el tipo de medición de permanencia se pueden elegir específicamente para imitar las interacciones específicas que están presentes dentro de un sistema de interés. Un ejemplo es el uso de permanencia deformación - que poseelas muestras que están en contacto con un valor de deflexión deseada - para evaluar las uniones adhesivas que se desarrollan en los agregados formados en dispersiones. Las uniones adhesivas formadas se pueden medir como una función del tiempo y pueden dar una idea de las fuerzas requeridas para redispersar los agregados después de un almacenamiento prolongado. La gran cantidad de datos que se pueden obtener con este método es una prueba de la versatilidad del método.

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Protocolo

1. Preparación de la sonda coloidal y AFM Sustrato

1. Para preparar sondas coloidales, use un método previamente desarrollado por los autores. ¹⁹
   1. En breve, utilizar un soporte de ángulo de 45 ° para fijar un voladizo sin punta en el ángulo específico de 45 ° (Figura 1A).
   2. Preparar una diapositiva epoxi untando una capa delgada de epoxi en un portaobjetos de microscopio. Utilice una espátula limpia o una corriente lenta de nitrógeno para asegurar que la capa de epoxi añadido el portaobjetos de microscopio es de altura mínima.
   3. Coloque la diapositiva epoxi a una lente de microscopio 40X óptico zoom utilizando un soporte diseñado a medida (Figura 1B). A continuación, utilice el voladizo de acercarse a la corredera epoxi y adquirir una pequeña cantidad de epoxi en el voladizo.
   4. Repita estos pasos para adjuntar también una sola partícula de interés en el vértice de la viga (Figura 1C).
2. Prepare el substrato AFM estampando par coloidaltículos sobre un cubreobjetos de AFM utilizando un adhesivo de montaje termoplástico.
   1. Calentar una 35 mm de hoja de la cubierta redonda a 120 ° C, y aplicar una pequeña cantidad de adhesivo a la cubreobjetos. La temperatura alta es necesaria para fundir el adhesivo termoplástico para la aplicación.
   2. Entonces fresco, el cubreobjetos a 40 ° C antes de quitar el polvo de las partículas coloidales en la cola. NOTA: A 40 º C el pegamento se establece suficientemente que las partículas no se convertirá en incrustado en el pegamento, pero el pegamento es lo suficientemente pegajoso para asegurar que las partículas se adhieren al sustrato.
   3. Además enfriar el cubreobjetos a TA y se utilice una corriente suave de nitrógeno para soplar las partículas no unidas en exceso.
   4. Lavar las sustrato varias veces con el medio líquido que se utilizará para las mediciones de sonda coloidales para asegurar que todas las partículas no unidas se eliminan del sustrato. NOTA: Esto es importante para reducir los efectos de las partículas que fluyen libremente durante la medición, lo que puede interactuar con la palanca y introducir errores en los resultados.

2. Montaje de la sonda coloidal, Alineación láser, y el Sistema de equilibrar

1. Montar el cubreobjetos con las partículas coloidales en la mitad inferior de una celda de líquido, asegurándose de que la junta tórica quede bien asentada para evitar cualquier fuga.
2. Coloque una lámina transparente hidrofóbica en la platina del microscopio para protegerse de cualquier líquido que pueda fugarse durante el experimento, especialmente si sólo utiliza la mitad inferior de una celda de líquido para la medición, y colocar el celular líquido sobre la platina del microscopio. NOTA: Para simplificar se puede usar sólo la mitad inferior de una celda de líquido, ya que el sistema puede equilibrarse adecuadamente; punta - la evaporación cambia la condición de la medida y los efectos del resultado / lectura.
3. Conecte la sonda coloidal a la cabeza de exploración AFM y montar en el AFM. Con el software del instrumento AFM, tendrá que utilizar los mandos delel escaneo de la cabeza para llevar la punta en voladizo en el foco. NOTA: Todas las medidas de procedimiento y medidas se completaron mediante un AFM MFP-3D-Bio con el software de Asylum Research.
4. Para maximizar la intensidad, alinear el láser en la punta del cantilever usando los botones de ajuste adecuados en la cabeza de exploración.
5. Deje que el sistema se equilibre durante 5-10 minutos o hasta que el valor de deflexión se estabilice. Utilice la perilla de ajuste de desviación para que la desviación a cero o ligeramente negativo.
6. Después de que el sistema se equilibró en el aire, utilice el software de AFM (Panel térmico de la ventana Panel Master) térmicamente calcular los InvOLS (sensibilidad) y constante del resorte de la sonda coloidal. NOTA: Esta sensibilidad se utiliza temporalmente hasta que la verdadera sensibilidad se mide en la terminación de la medición (ver paso 4).
   1. Seleccione "Cal Constant Spring" o "Cal InvOLS" y luego haga clic en "Captura de Datos térmica".
   2. Una vezun pico prominente es aparente, detener la captura de datos, y haga clic para ampliar sobre el pico principal.
   3. Haga clic en "Initialize Fit" seguido de "ajustar los datos térmicos", para obtener los valores InvOLS constante de elasticidad calculado automáticamente o.
7. Poco a poco agregue 2 ml del medio líquido a la célula líquida utilizando una jeringa y asegúrese de que no hay burbujas en todo el voladizo. Volver a alinear el láser, ya que el índice de refracción del medio ahora ha cambiado, y una vez más se equilibre el sistema que permite el valor de deflexión que se estabilice antes de ajustar la deflexión de nuevo a cero. NOTA: Si no existe una gran diferencia de temperatura entre el ambiente y líquido, el equilibrio se necesitará más tiempo.

3. Imaging y Adquisición de Datos

1. Ajuste el tamaño de escaneo inicial a 20 micras, velocidad de exploración a 1 Hz, ángulo de lectura de 90 °, ajuste el punto a 0,2 V y obtener un análisis de la muestra. Ajuste la ganancia según sea necesario para obtener la traza superpuestay volver sobre las curvas.
2. Una vez que se encuentre una partícula de interés, alejar inmediatamente sobre esa partícula para limitar las interacciones sonda extendida con el sustrato antes de obtener las mediciones de volumen vigor.
3. Una vez que el zoom, adquirir una imagen suficiente de una sola partícula o porción de una sola partícula. A continuación, cambie al panel de la Fuerza en el software. Traiga la barra de posición de color rojo a la posición más alta, ajuste la distancia vigor a 5 micras, velocidad de barrido a 0,1 Hz, canal de disparo a ninguno y llevar a cabo una sola medida de fuerza. Asegúrese de que la sonda no hace contacto con el sustrato.
4. En el gráfico de medición único obtenido, calcular la línea de deflexión virtuales haciendo clic derecho sobre la ventana de gráfico y seleccionando la opción "Calcular Virtual Line Def". Esto automáticamente calculará la deflexión virtual y actualizar el valor según sea necesario dentro del software.
5. Cambie el canal de disparo a la deflexión y establecer el punto de disparo a 20 nm. Ajuste la fuerza distción a 1 micras y ajustar la velocidad de exploración como desee dependiendo de las fuerzas medidas de interés.
6. Para ajustar manualmente el valor de la desviación óptica inversa Lever Sensibilidad (InvOLS) en el Panel de Revisión de la Fuerza después de la realización de 2-3 mediciones de fuerza única preliminares consecutivos.
   1. Llevar a cabo una medición de la fuerza única, haga clic en el botón "Review" en el panel de la Fuerza que se abre un panel maestro Fuerza.
   2. Resalte la medición de la fuerza que se realizó. En el marco del "Eje" partida asegurar que sólo "DeflV" está marcada. Cambie el campo de entrada "Eje X" a "septiembre" utilizando el menú desplegable y haga clic en "hacer gráfico."
   3. Haga clic en la pestaña "Parm" en el panel principal de la Fuerza y ​​ajustar el valor de "InvOLS" hasta que la zona de contacto de la gráfica es completamente vertical. Luego rellenar este valor en el campo "DEFL InvOLS", ubicado debajo de la Cal60; subpestaña en la pestaña de la Fuerza se encuentra en la ventana principal del Panel Maestro.
   4. Repita este 2-3 veces para asegurar que el valor InvOLS no cambia significativamente.
7. Ahora que todos los parámetros se han establecido, asegúrese de que el nivel medio líquido es aún suficiente y que la desviación sigue siendo estable. NOTA: En este momento, las curvas de fuerza única o mapas de fuerza se pueden obtener. Si se desean mediciones de fuerza de permanencia, las opciones de permanencia se puede acceder en el Panel de Tareas.

4. Post-sintonización de sensibilidad para el análisis

1. Después de la finalización de la adquisición de medición, medir la verdadera sensibilidad de la sonda coloidal. Para hacer esto, llevar a cabo una medición de la fuerza utilizando una cantidad relativamente grande de deflexión / fuerza con la sonda coloidal en el mismo medio líquido contra un "infinitamente" superficie dura, tal como la mica. NOTA: La sensibilidad se obtuvo después de la finalización de los experimentos debido a que la gran desviación / fuerza puede dañar Colloidal sondas preparadas con coloides porosos o frágiles.
2. La pendiente de la zona de contacto es utilizado por el software para calcular automáticamente la sensibilidad (Figura 2). Utilice este valor verdadero de la sensibilidad durante el análisis de los datos de todas las curvas obtenidas usando que la sonda coloidal en particular.

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Resultados

Sistemas coloidales líquidos se utilizan para varios sistemas de liberación de fármacos farmacéuticos. Para la administración de fármacos por inhalación, un sistema coloidal común es la suspensión inhalador de dosis medidas presurizado (pMDI). Interacciones de las partículas presentes en el pMDI desempeñan un papel vital en la formulación de la estabilidad física, el almacenamiento, y la uniformidad de administración de fármacos. En este manuscrito, se evaluaron las fuerzas entre partículas entre las par...

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Discusión

Varias fuentes de inestabilidad presentes en líquido nanoscopía sonda coloidal sistema pueden ser fácilmente mitigados a través de los procedimientos adecuados de equilibrio. Inestabilidades como se discutió anteriormente en el resultado resultados erróneos y las curvas de fuerza que son más difíciles de analizar objetivamente. Si todas las fuentes de inestabilidad se han tendido y gráficos similares a la mostrada en la Figura 4 están todavía presentes, otro parámetro de medición puede ser ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double-Bubble Epoxy	Hardman	4004
Veeco Tipless Probes	Veeco	NP-O10
Porous Particles	Pearl Therapeutics
Atomic Force Microscope (MFP)	Asylum	MFP-3D
SPIP Scanning Probe Image Processor Software	NanoScience  Instruments
35 mm Coverslips	Asylum	504.003
Tempfix	Ted Pella. Inc.	16030