בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

Summary

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Abstract

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.^1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Introduction

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא טכניקה המאפשרת הדמיה איכותית וכמותית והחיטוט של משטח חומר. ^4-6 באופן מסורתי, AFM משמש להערכה של טופוגרפיה משטח, מורפולוגיה ומבנה של חומרים רב phasic. יש AFM היכולת להעריך כמותית אינטראקציות בקנה מידה ננו, כגון כוחות תשלום, משיכה, דחייה וההדבקה בין בדיקה ספציפית ואת המצע באוויר וגם מדיומים נוזליים. ^7,8 AFM שפותח במקור על ידי Binning, Quate וגרבר ⁹ שימושים בדיקה של רגישות ידועה / נחושה וקבוע קפיץ להתקרב ו / או לסרוק את דגימה. בשל האינטראקציות פיזיות בין החללית לבין המדגם, שלוחה הוא הסיט במהלך מגע או קרבה ובהתאם למצבו של מבצע, סטיה זו יכולה להיות מתורגמת לרכישת הטופוגרפיה של המדגם או מידת הכוחות הנוכחיים בין החללית לבין המדגם. שינויים techni AFMque, כגון Nanoscopy הבדיקה colloidal, ¹⁰ אפשרו מדען להעריך ישירות את אינטראקציות ננו כוח בין שני חומרים הנמצאים במערכת colloidal של עניין.

בNanoscopy הבדיקה colloidal, חלקיקים כדוריים של בחירה מחובר לשיא של שלוחה, החלפת הטיפים חרוטי ופירמידה המסורתיים. חלקיקים כדוריים הוא אידיאליים כדי לאפשר השוואה עם מודלים תיאורטיים כגון ג'ונסון, קנדל, רוברטס (JKR) ¹¹ וDerjaguin, לנדאו, Vervwey, Overbeek (DLVO) ^12-14 תאוריות וכדי למזער את ההשפעה של חספוס פני השטח על המדידה. ¹⁵ תאוריות אלה נמצאים בשימוש כדי להגדיר את מכניקת הקשר וכוחות בין החלקיקים צפויים בתוך מערכת colloidal. תיאורית DLVO משלבת הכוחות ואאל ואן דר והאטרקטיבי וכוחות דחייה אלקטרוסטטית (בשל שכבות כפולות חשמליות) כדי להסביר את צבירת ההתנהגות של מערכות colloidal מימיות כמותית, בעוד Jתיאורית KR משלבת את האפקט של לחץ מגע והידבקות למודל קשר אלסטית בין שני מרכיבים. ברגע שבדיקה מתאימה היא מיוצרת, הוא משמש להתקרב כל חומר / חלקיקים אחרים כדי להעריך את הכוחות בין שני המרכיבים. באמצעות קצה סטנדרטי מיוצר אחד לא יוכל למדוד כוחות אינטראקטיביים בין שהקצה וחומר של בחירה, אך היתרון של שימוש בבדיקת colloidal מחוייט מאפשר המדידה של כוחות הנוכחיים בין חומרים בהווה במערכת הנחקרת. אינטראקציות הניתנות למדידה כוללות:.. דבק, מושך, דוחה, פריצה, וכוחות אפילו אלקטרוסטטי הנוכחיים בין החלקיקים ¹⁶ בנוסף, טכניקת הבדיקה colloidal יכול לשמש כדי לחקור את הכוחות משיקים הנוכחיים בין חלקיקים ואלסטיות חומרי ^17,18

היכולת לערוך מדידות באמצעי התקשורת שונות היא אחד היתרונות הגדולים של Nanoscopy הבדיקה colloidal. תנאי סביבה, מ 'נוזלעדיה, או ניתן להשתמש בכל תנאי לחות מבוקרת כדי לחקות את תנאי סביבה של המערכת הנחקרת. היכולת לערוך מדידות בסביבה נוזלית מאפשרת למחקר של מערכות colloidal בסביבה שזה באופן טבעי מתרחש; ובכך, להיות מסוגל לרכוש כמותית נתונים שהוא באופן ישיר לתרגום למערכת במצבו הטבעי. לדוגמא, ניתן ללמוד אינטראקציה בין חלקיקים קיים בתוך משאפים במינון מודד האויר (MDI) באמצעות דלק נוזלי דגם עם תכונות דומות לדלק המשמש בMDIs. אותו האינטראקציות נמדדו באוויר לא תהיינה נציג של קיים המערכת במשאף. יתר על כן, המדיום הנוזלי יכול להיות שונה כדי להעריך את ההשפעה של חדירת רטיבות, פעילי שטח המשני, או טמפרטורה על האינטראקציות של החלקיקים בMDI. היכולת לשלוט בטמפרטורה יכולה לשמש כדי לחקות את הפעולות מסוימות בייצור של מערכות colloidal כדי להעריך באיזו טמפרטורה או בייצור של אואחסון של מערכות colloidal עשוי להשפיע על אינטראקציות של חלקיקים.

מדידות שניתן להשיג באמצעות בדיקות colloidal כוללות; סריקת טופוגרפיה, עקומות כוח למרחקים בודדות, מפות הידבקות כוח למרחקים, ולהתעכב מדידות כוח למרחקים. פרמטרים מרכזיים הנמדדים תוך שימוש בשיטת Nanoscopy הבדיקה colloidal מוצגת במסמך זה כוללים את היישום snap-in, עומס מרבי, וערכי אנרגיית הפרדה. Snap-in היא מדידה של כוחות המשיכה, מקסימום לטעון את ערכו של כוח ההידבקות מקסימלית, ואת אנרגיית הפרדה משדרת האנרגיה הדרושה כדי למשוך את החלקיקים מכל מגע. ניתן למדוד ערכים אלה באמצעות מדידות מיידיים או כוח להתעכב. שני סוגים שונים של מדידות להתעכב כוללים סטיה וכניסה. האורך והסוג של מדידה להתעכב ניתן נבחרו במיוחד כדי לחקות את האינטראקציות ספציפיות שנמצאות בתוך מערכת של עניין. דוגמה לכך היא באמצעות להתעכב סטיה - המחזיקהדגימות במגע בשווי סטיה רצויה - כדי להעריך את אג"ח הדבק המתפתחים באגרגטים שנוצרו בתפוצות. אג"ח הדבק נוצר ניתן למדוד כפונקציה של זמן והוא יכול לספק תובנות לגבי הכוחות הדרושים לredisperse המצרפים לאחר אחסון ממושך. שפע של נתונים שניתן להשיג בשיטה זו הוא עדות לרבגוניות של השיטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת Probe קולואיד וAFM התשתית

1. כדי להכין את בדיקות colloidal, להשתמש בשיטה שפותחה בעבר על ידי המחברים. ¹⁹
   1. בקיצור, השתמש בעל זווית של ° 45 להדביק שלוחה tipless בזווית הספציפית של 45 (איור 1 א) מעלות.
   2. הכן את שקופית אפוקסי על ידי מריחת שכבה דקה של אפוקסי לשקופית מיקרוסקופ. השתמש במרית נקייה או זרם איטי של חנקן כדי להבטיח כי השכבה של אפוקסי הוסיפה לשקופית מיקרוסקופ היא בגובה מינימאלי.
   3. להדביק את שקופית אפוקסי לעדשת 40X זום אופטית מיקרוסקופ באמצעות בעל מעוצב אישית (איור 1). לאחר מכן השתמשתי בשלוחה להתקרב שקופית אפוקסי ולרכוש כמות קטנה של אפוקסי על שלוחה.
   4. חזור על שלבים אלה גם לצרף חלקיק יחיד של עניין בשיא של שלוחה (איור 1 ג).
2. הכן את מצע AFM ידי הדבקת נקוב colloidalticles על coverslip AFM באמצעות דבק הרכבה תרמופלסטיים.
   1. מחממים 35 מ"מ להחליק את מכסה עגול ל120 מעלות צלזיוס, ולהחיל כמות קטנה של הדבק לcoverslip. הטמפרטורה הגבוהה יש צורך להמס את דבק תרמופלסטי ליישום.
   2. אז מגניב, coverslip ל40 מעלות צלזיוס לפני לאבק את חלקיקי colloidal על הדבק. הערה: ב40 ° C הדבק מספיק לקבוע כי החלקיקים לא יהפכו מוטבעים לתוך הדבק, אבל הדבק דביק מספיק כדי להבטיח שהחלקיקים ידבק המצע.
   3. יתר על כן לקרר את coverslip לRT ולהשתמש בזרם עדין של חנקן לפוצץ את כל חלקיקים פנויים עודפים.
   4. לשטוף מספר פעמים עם מצע המדיום הנוזלי שישמש למדידות בדיקה colloidal כדי להבטיח שכל החלקיקים פנויים יוסרו מן המצע. הערה: זה חשוב כדי להפחית את ההשפעות של חלקיקים זורמים חופשיים בזמן המדידה, שיכול היתרלפעול עם שלוחה ולהציג שגיאות בתוצאות.

2. ההרכבה קולואיד Probe, יישור לייזר, ומערכת equilibrating

1. הר coverslip עם חלקיקי colloidal למחצית התחתונה של נוזל תא, ולוודא כי טבעת O-יושבת כראוי כדי למנוע כל דליפה.
2. הנח גיליון שקוף הידרופובי לבמה מיקרוסקופ כדי להישמר מפני כל נוזל שעלולה לדלוף במהלך הניסוי, במיוחד אם רק באמצעות את החצי התחתון של נוזל תא למדידה, ולמקם את נוזל התא לבמה מיקרוסקופ. הערה: לשם פשטות ניתן להשתמש במחצית התחתונה בלבד של נוזל תא, בהתחשב בכך שהמערכת יכולה להיות equilibrated כראוי; טיפ - האידוי משנה את מצבו של המדידה ומשפיע על התוצאות / קריאה.
3. צרף את חללית colloidal לראש סריקת AFM ולהרכיב על AFM. עם תוכנת מכשיר AFM על, השתמש בכפתורים עלסריקת ראש כדי להביא את קצה שלוחה אל מוקד. הערה: כל הצעדים והמדידות פרוצדורליים הושלמו באמצעות AFM MFP-3D-Bio עם תוכנת מקלט מחקר.
4. כדי למקסם את העצמה, ליישר את הלייזר על הקצה של שלוחה באמצעות כפתורי ההתאמה המתאימים בראש הסריקה.
5. לאפשר למערכת כדי לאזן במשך 5-10 דק 'או עד שמייצב את ערך הסטייה. השתמש בכפתור כוונון סטיה כדי להביא את הסטייה לאפס או שלילי במקצת.
6. לאחר שהמערכת equilibrated באוויר, להשתמש בתוכנת AFM (הלוח תרמי בחלון מאסטר הלוח) לתרמית לחשב InvOLS (רגישות) וקבוע קפיץ של חללית colloidal. הערה: רגישות זו תהיה באופן זמני שימשה עד לרגישות האמיתית נמדדת בסיום המדידה (ראה שלב 4).
   1. בחר באפשרות "קאל האביב קבוע" או "InvOLS קאל" ולאחר מכן לחץ על "לכידת נתונים תרמיים".
   2. פעםשיא בולט לכך הוא ברור, לעצור את לכידת נתונים, ולחץ כדי להגדיל מעל הפסגה הראשית.
   3. לחץ על "אתחול Fit" ואחריו "Fit נתונים תרמיים," כדי להשיג את קבוע הקפיץ מחושב באופן אוטומטי או ערכי InvOLS.
7. לאט לאט להוסיף 2 מיליליטר של המדיום הנוזלי לתא הנוזל באמצעות מזרק ולהבטיח כי אין בועות נמצאות סביב שלוחה. Re-ליישר את הלייזר, שכן את מקדם השבירה של המדיום השתנה עכשיו, ולאזן את המערכת ומאפשרת את ערך הסטייה לייצב לפני התאמת הסטייה חזרה לאפס שוב. הערה: אם הפרש טמפרטורה גדול קיים בין הסביבה והנוזלית, האיזון ייקח יותר זמן.

3. הדמיה ורכישת נתונים

1. הגדר את גודל הסריקה הראשוני ל20 מיקרומטר, סריקת שיעור לרץ 1, זווית סריקה ל90 °, נקודה מוגדרת 0.2 V ולקבל סריקה של המדגם. התאם את הרווח כנדרש כדי להשיג עקבות חופפותולשחזר את העיקולים.
2. ברגע שחלקיק של עניין נמצא, באופן מיידי להגדיל את התצוגה על גבי חלקיקים שכדי להגביל את אינטראקציות בדיקה מורחבות עם המצע לפני קבלת מדידות כוח עוצמת קול.
3. לאחר שהגדיל, לרכוש תמונה מספקת של חלקיקים או חלק אחד של חלקיק יחיד. ואז לעבור לפנל חיל בתוכנה. להביא את הבר העמדה האדום למיקום הגבוה ביותר, הגדר את מרחק הכוח עד 5 מיקרומטר, קצב סריקה ל0.1 הרץ, ערוץ הדק לאף אחד ולערוך מדידת כוח אחד. ודא הבדיקה לא ליצור קשר עם המצע.
4. מגרף המדידה היחיד שהושג, לחשב את קו הסטייה הווירטואלי על ידי לחיצה ימנית על חלון הגרף, ובחירה באפשרות "חישוב Def קו וירטואלי". זה יהיה באופן אוטומטי לחשב את הסטייה הווירטואלית ולעדכן את הערך לפי צורך בתוכנה.
5. לשנות את ערוץ ההדק לסטייה ולהגדיר את נקודת ההדק ל20 ננומטר. הגדר את dist הכוחאהה ל1 מיקרומטר ולהתאים את מהירות הסריקה לפי הצורך בהתאם לכוחות המדודים של ריבית.
6. באופן ידני להתאים את הערך לסטייה הפוכה אופטית מנוף הרגישות (InvOLS) בלוח סקירת חיל לאחר ביצוע 2-3 מדידות כוח יחיד ראשוניות ברציפות.
   1. לערוך מדידת כוח יחיד, ואז ללחוץ על הכפתור "סקירה" על לוח חיל אשר פותח לוח מאסטר חיל.
   2. הדגש את מדידת הכוח הושלמה לאחרונה. תחת "הציר" הכותרת להבטיח שרק "DeflV" מסומן. שנה את שדה הקלט "X-הציר" ל "ספטמבר" שימוש בתפריט הנפתח ולחץ על "להפוך את הגרף."
   3. לחץ על הלשונית "parm" על לוח מאסטר חיל ולהתאים את הערך של "InvOLS" עד קשר האזור של הגרף הוא אנכי לחלוטין. לאחר מכן לאכלס ערך זה בשדה "InvOLS Defl" הממוקם מתחת לקאל60; כרטיסיית משנה בכרטיסיית חיל ממוקמת בחלון לוח מאסטר העיקרי.
   4. חזור על פעולה זו פעמים 2-3 כדי להבטיח שערך InvOLS אינו משתנה באופן משמעותי.
7. עכשיו שכל הפרמטרים שהוגדרו, להבטיח את רמת המדיום הנוזלי עדיין מספיק וכי הסטייה היא עדיין יציבה. הערה: בשלב זה, ניתן להשיג עקומות כוח בודד או מפות בכוח. אם מדידות כוח להתעכב הן רצויים, ניתן לגשת אל האפשרויות להתעכב בלוח חיל.

4. לאחר כוונון של רגישות לניתוח

1. לאחר השלמת רכישת מדידה, למדוד את הרגישות האמיתית של חללית colloidal. כדי לעשות זאת, יש לבצע מדידת כוח באמצעות סטיה / כוח גדול יחסית עם חללית colloidal באותו המדיום נוזלי נגד "אינסוף" משטח קשה כגון נציץ. הערה: רגישות הושגה לאחר השלמת הניסויים כי הסטייה / הכוח הגדול עלול לגרום נזק Colloבדיקות idal מוכנות עם קולואידים נקבוביים או שבירים.
2. השיפוע של אזור המגע משמש את התוכנה כדי לחשב את הרגישות (איור 2) באופן אוטומטי. השתמש ערך אמיתי זה של רגישות בעת ניתוח הנתונים של כל העקומות שהושגו באמצעות בדיקה colloidal מסוימת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מערכות colloidal נוזליים המשמשות לכמה מערכות אספקת הסמים תרופות. עבור משלוח סמים שאיפה, מערכת colloidal נפוצה היא ההשעיה משאף לחץ מודד האויר במינון (PMDI). אינטראקציה בין חלקיקים קיים בתוך pMDI לשחק תפקיד חיוני ביציבות גיבוש פיזית, אחסון, ואחידות משלוח סמים. בכתב היד הזה, כוחות בין...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בקלות ניתן למתן כמה מקורות של אי יציבות של המערכת נוכחת במהלך הבדיקה Nanoscopy colloidal הנוזלי באמצעות הליכי איזון ראויים. אי יציבות כפי שנדון בעבר לגרום בתוצאות שגויות ועקומות כוח שקשים יותר לנתח באופן אובייקטיבי. אם כל המקורות של חוסר יציבות כבר נטו וגרפים דומים לזה שמוצג ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double-Bubble Epoxy	Hardman	4004
Veeco Tipless Probes	Veeco	NP-O10
Porous Particles	Pearl Therapeutics
Atomic Force Microscope (MFP)	Asylum	MFP-3D
SPIP Scanning Probe Image Processor Software	NanoScience  Instruments
35 mm Coverslips	Asylum	504.003
Tempfix	Ted Pella. Inc.	16030