Esame quantitativa e qualitativa delle interazioni particella-particella colloidale Uso Probe Nanoscopia

Riepilogo

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Abstract

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.^1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Introduzione

Microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica che permette l'imaging qualitativa e quantitativa e preciso di una superficie del materiale. ^4-6 Tradizionalmente, AFM è utilizzato per la valutazione della topografia della superficie, morfologia e struttura dei materiali multi-fasiche. AFM ha la capacità di valutare quantitativamente le interazioni nano-scala, come carica, attrazione, repulsione e di adesione forze tra una sonda specifica e del substrato in aria e mezzi liquidi. ^7,8 L'AFM originariamente sviluppato da Binning, Quate e Gerber ⁹ usi una sonda di nota sensibilità / determinato e costante elastica di avvicinarsi e / o la scansione di un campione. A causa delle interazioni fisiche tra la sonda e il campione, il cantilever viene deflesso durante il contatto o la vicinanza e seconda della modalità di funzionamento, tali deviazioni può essere tradotto per acquisire la topografia delle forze presenti tra la sonda e il campione o campione di misura. Modifiche al tecnico AFMque, come sonda colloidale nanoscopia, ¹⁰ hanno permesso scienziato per valutare direttamente le interazioni nano-forza tra due materiali presenti in un sistema colloidale di interesse.

In colloidale sonda nanoscopia, una particella sferica di scelta è fissato al vertice di un cantilever, in sostituzione delle punte coniche e piramidali tradizionali. Una particella sferica è l'ideale per permettere il confronto con i modelli teorici, come la Johnson, Kendal, Roberts (JKR) ¹¹ e Derjaguin, Landau, Vervwey, Overbeek (DLVO) ^12-14 teorie e ridurre al minimo l'influenza della rugosità superficiale sulla misura. ¹⁵ Queste teorie vengono utilizzati per definire i meccanismi di contatto e le forze fra le particelle previsti all'interno di un sistema colloidale. La teoria DLVO combina le attraente forze di van der Waal e forze elettrostatiche repulsive (a causa di doppi strati elettrici) per spiegare quantitativamente il comportamento di aggregazione dei sistemi colloidali acquose, mentre la JTeoria KR incorpora l'effetto della pressione di contatto e l'adesione al modello di contatto elastico tra due componenti. Una volta che una sonda appropriata viene prodotto, viene usato per rivolgersi a qualsiasi altro materiale / particella per valutare le forze tra le due componenti. Utilizzando uno standard fabbricato punta sarà in grado di misurare le forze di interazione tra punta e che un materiale di scelta, ma il vantaggio di utilizzare una sonda colloidale su misura permette la misurazione delle forze presenti tra materiali presenti all'interno del sistema studiato. Interazioni misurabili includono:.. Adesivo, attraente, repellenti, carica, e anche forze elettrostatiche presenti tra le particelle ¹⁶ Inoltre, la tecnica sonda colloidale può essere utilizzato per esplorare forze tangenziali presenti tra le particelle e l'elasticità del materiale ^17,18

La capacità di effettuare misurazioni in vari media è uno dei principali vantaggi di sonda colloidale nanoscopia. Condizioni ambientali, liquido media, o condizioni di umidità controllata possono essere utilizzati per simulare condizioni ambientali del sistema studiato. La capacità di effettuare misurazioni in un ambiente liquido consente lo studio di sistemi colloidali in un ambiente che si trova in natura; pertanto, essere in grado di acquisire dati quantitativamente che è direttamente traducibile al sistema nel suo stato naturale. Ad esempio, le interazioni delle particelle presenti all'interno inalatori (MDI) possono essere studiate usando un modello di propellente liquido con proprietà simili al propellente utilizzato in MDI. Le stesse interazioni misurati in aria, non siano rappresentativi del sistema esistente all'interno dell'inalatore. Inoltre, il mezzo liquido può essere modificato per valutare l'effetto di infiltrazioni di umidità, un tensioattivo secondario, o temperatura sulle interazioni delle particelle in un MDI. La capacità di controllare la temperatura può essere utilizzato per simulare alcuni passi nella produzione di sistemi colloidali di valutare come temperatura sia nella produzione di omemorizzazione dei sistemi colloidali può avere un impatto sulle interazioni delle particelle.

Misurazioni che possono essere ottenuti utilizzando sonde colloidali includono; Scansione Topografia, singole curve forza-distanza, le mappe di adesione forza-distanza, e dimorare misure di forza-distanza. I parametri fondamentali che vengono misurati con il metodo della sonda nanoscopia colloidale presentata in questo documento includono i valori di energia separazione snap-in, carico massimo, e. Snap-in è una misura delle forze di attrazione, max caricare il valore della forza massima adesione, e l'energia di separazione trasmette l'energia necessaria per ritirare la particella da contatto. Questi valori possono essere misurati mediante misure istantanee o forza di sosta. Due diversi tipi di misurazioni dwell includono deflessione e rientro. La lunghezza e il tipo di misura di permanenza può essere specificamente scelti per imitare interazioni specifiche che sono presenti all'interno di un sistema di interesse. Un esempio sta usando deflessione di sosta - che detienei campioni in contatto ad un valore desiderato deflessione - valutare i legami adesivi che si sviluppano in aggregati formati in dispersioni. I legami adesivo formato può essere misurata come una funzione del tempo e possono fornire una conoscenza delle forze necessarie amalgamare aggregati dopo stoccaggio prolungato. La pletora di dati che possono essere ottenuti con questo metodo è un testamento alla versatilità del metodo.

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Protocollo

1. Preparazione della sonda colloidale e AFM substrato

1. Per preparare sonde colloidali, utilizzare un metodo sviluppato precedentemente dagli autori. ¹⁹
   1. In breve, utilizzare un supporto angolo di 45 ° di apporre un cantilever tipless allo specifico angolo di 45 ° (Figura 1A).
   2. Preparare un vetrino epossidica da spalmare uno strato sottile di resina epossidica su un vetrino da microscopio. Utilizzare una spatola pulita o un lento flusso di azoto per assicurare che lo strato di resina epossidica aggiunto al vetrino è di altezza minima.
   3. Fissare il vetrino resina epossidica ad un ottico di lente del microscopio zoom 40X con un supporto progettato su misura (Figura 1B). Quindi utilizzare il cantilever avvicinarsi al vetrino epossidica e acquisire una piccola quantità di resina epossidica sulla cantilever.
   4. Ripetere questi passaggi per allegare anche una singola particella di interesse all'apice del cantilever (Figura 1C).
2. Preparare il substrato AFM apponendo par colloidaleticelle su un vetrino AFM utilizza un adesivo di montaggio termoplastico.
   1. Scaldare una copertura antiscivolo rotondo 35 mm a 120 ° C, e applicare una piccola quantità di adesivo per il coprioggetto. L'alta temperatura è necessaria per fondere l'adesivo termoplastico per applicazione.
   2. Poi raffreddare, il coprioggetto a 40 ° C prima di spolverare le particelle colloidali sulla colla. NOTA: A 40 ° C la colla è sufficientemente impostato che le particelle non si sono inseriti nella colla, ma la colla è abbastanza appiccicosa per assicurare che le particelle aderiscono al substrato.
   3. Ulteriori raffreddare il vetrino di RT e utilizzare una leggera corrente di azoto per soffiare via eventuali particelle libere in eccesso.
   4. Lavare le substrato più volte con il mezzo liquido che verrà utilizzato per misurazioni sonda colloidali per garantire che tutti particelle libere vengono rimossi dal substrato. NOTA: Questo è importante per ridurre gli effetti di particelle a flusso libero nel corso della misura, che può tra l'agire con la mensola e introdurre errori nei risultati.

2. Montaggio della sonda colloidale, Allineamento Laser, e riequilibranti del sistema

1. Montare il vetrino coprioggetto con le particelle colloidali nella metà inferiore di una cella di liquido, facendo in modo che l'O-ring sia posizionato correttamente per evitare perdite.
2. Posizionare un foglio trasparente idrofobo sul palco microscopio per premunirsi contro qualsiasi liquido che può fuoriuscire durante l'esperimento, soprattutto se solo con la metà inferiore di una cella liquido per la misura, e posizionare la cella liquido sul palco microscopio. NOTA: per semplicità si può utilizzare solo la metà inferiore di una cella liquido, dato che il sistema può essere equilibrato adeguatamente; punta - l'evaporazione cambia lo stato della misurazione e impatti / lettura dei risultati.
3. Fissare la sonda colloidale alla testa di scansione AFM e assemblare sul AFM. Con il software dello strumento AFM, utilizzare le manopole sulscansione testa per portare la punta a sbalzo a fuoco. NOTA: Tutte le fasi procedurali e le misure sono state completate utilizzando un MFP-3D-Bio AFM con il software Asylum Research.
4. Per massimizzare l'intensità, allineare il laser sulla punta del cantilever usando le manopole di regolazione appropriati sulla testa di scansione.
5. Lasciare che il sistema si riequilibri per 5-10 minuti o fino a quando il valore di deflessione stabilizza. Utilizzare la manopola di regolazione deflessione per portare la deformazione a zero o leggermente negativa.
6. Dopo che il sistema è equilibrata in aria, utilizzare il software AFM (Pannello termica nella finestra Master Panel) per calcolare le termicamente InvOLS (sensibilità) e la costante elastica della sonda colloidale. NOTA: Questa sensibilità sarà utilizzato temporaneamente fino alla vera sensibilità è misurata al termine della misura (vedi punto 4).
   1. Selezionare "Cal Costante molla" o "Cal InvOLS" e quindi fare clic su "Capture dati termici".
   2. Una voltaun picco significativo è evidente, interrompere l'acquisizione dei dati e fare clic per ingrandire il picco principale.
   3. Clicca su "Inizializza Fit" seguito da "Fit dati termici," per avere la costante elastica calcolati automaticamente o valori InvOLS.
7. Aggiungere lentamente 2 ml di terreno liquido alla cella liquido con una siringa e accertarsi che non siano presenti bolle intorno cantilever. Riallineare il laser, poiché l'indice di rifrazione del mezzo è cambiata, e ancora una volta equilibrare il sistema che consente il valore della freccia di stabilizzarsi prima di regolare la deformazione a zero. NOTA: Se una grande differenza di temperatura esistente tra l'ambiente e il liquido, in equilibrio richiederà più tempo.

3. Imaging and Data Acquisition

1. Impostare il formato di scansione iniziale a 20 micron, velocità di scansione a 1 Hz, angolo di scansione di 90 °, set point a 0,2 V e di ottenere una scansione del campione. Regolare il guadagno come necessario per ottenere la traccia sovrappostae ripercorrere le curve.
2. Una volta trovata una particella di interesse, zoom subito su quella particella di limitare le interazioni sonda estesi con il substrato prima di ottenere misurazioni del volume forza.
3. Una volta ingrandita, acquisire un'immagine sufficiente di una singola particella o porzione di una singola particella. Poi passare al Pannello di forza nel software. Portare la barra di posizione rossa nella posizione più alta, impostare la distanza di forza per 5 micron, velocità di scansione di 0,1 Hz, il canale di trigger a nessuno e condurre una singola misura della forza. Assicurarsi che la sonda non contatta il substrato.
4. Dal grafico singola misura ottenuta, calcolare la linea di deflessione virtuale facendo clic destro sulla finestra del grafico, e selezionando l'opzione "Calcola virtuale Def Line". Questo calcolerà automaticamente la deformazione virtuale e aggiornare il valore come necessario all'interno del software.
5. Cambiare il canale di trigger a flessioni e impostare il punto di trigger a 20 nm. Impostare il dist forzazione a 1 micron e regolare la velocità di scansione come desiderato in base alle forze misurate di interesse.
6. Regolare manualmente il valore per la deflessione Inverse Optical Leva Sensibilità (InvOLS) nel pannello di rassegna Forza dopo aver condotto 2-3 consecutivi preliminari misure di forza unico.
   1. Condurre una misura della forza sola, quindi fare clic sul pulsante "Review" sul pannello di Forza che apre un Master Panel Forza.
   2. Evidenziare la misurazione della forza più recentemente completato. Sotto l'intestazione "Asse" garantire che solo "DeflV" sia selezionata. Modificare il campo di immissione "X-Axis" a "Settembre" utilizzando il menu a tendina e cliccare su "make grafico."
   3. Fare clic sulla scheda "Parm" nel Pannello di Forza Maestri e regolare il valore di "InvOLS" fino alla regione di contatto del grafico è completamente verticale. Poi popolare questo valore nel campo "DEFL InvOLS" che si trova sotto il Cal60; sub-tab nella scheda Forza situato sulla finestra Pannello Maestro principale.
   4. Ripetere questo 2-3 volte per assicurare che il valore InvOLS non cambia significativamente.
7. Ora che tutti i parametri sono stati istituiti, assicurarsi che il livello del liquido è ancora sufficiente e che la flessione è ancora stabile. NOTA: In questo momento, forza unica curve o le mappe di forza possono essere ottenuti. Se si desiderano misure di forza di sosta, le opzioni di sosta è possibile accedere nel pannello di Forza.

4. Post-tuning di sensibilità per l'analisi

1. Dopo il completamento dell'acquisizione misurazione, misurare la vera sensibilità della sonda colloidale. A tale scopo, effettuare una misurazione della forza utilizzando una relativamente grande deflessione / forza con la sonda colloidale nello stesso mezzo liquido contro un "infinitamente" superficie dura come mica. NOTA: La sensibilità è stata ottenuta dopo il completamento degli esperimenti, perché il grande deflessione / force potrebbe danneggiare collosonde Idal preparati con colloidi porose o fragili.
2. La pendenza della regione di contatto è utilizzato dal software per calcolare automaticamente la sensibilità (Figura 2). Utilizzare questo vero valore di sensibilità durante l'analisi dei dati di tutte le curve ottenute utilizzando quel particolare sonda colloidale.

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Risultati

Sistemi colloidali liquidi sono utilizzati per diversi sistemi di drug delivery farmaceutiche. Per la somministrazione di farmaci per inalazione, un sistema colloidale comune è la sospensione pressurizzato (pMDI). Interazioni tra le particelle presenti nel pMDI svolgono un ruolo fondamentale nella formulazione stabilità fisica, lo stoccaggio e l'uniformità consegna della droga. In questo manoscritto, forze fra le particelle tra particelle a base di lipidi porosi (~ 2 micron ottica diametro particellare medio) in ...

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Discussione

Diverse fonti di instabilità presenti durante liquido sonda nanoscopia colloidale sistema può essere facilmente mitigati attraverso procedure di equilibrazione corrette. Instabilità come discusso in precedenza producono risultati errati e le curve di forza che sono più difficili da analizzare obiettivamente. Se tutte le fonti di instabilità sono stati teso e grafici simili a quello mostrato in Figura 4 sono ancora presenti, un altro parametro di misura può essere la ragione. Altri parametri di mis...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double-Bubble Epoxy	Hardman	4004
Veeco Tipless Probes	Veeco	NP-O10
Porous Particles	Pearl Therapeutics
Atomic Force Microscope (MFP)	Asylum	MFP-3D
SPIP Scanning Probe Image Processor Software	NanoScience  Instruments
35 mm Coverslips	Asylum	504.003
Tempfix	Ted Pella. Inc.	16030