콜로이드 프로브 Nanoscopy을 사용하여 입자 간 상호 작용의 양적 및 질적 시험

요약

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

초록

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.^1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

서문

원자 힘 현미경 (AFM)을 정량적 이미징을 가능하게하고 재료 표면의 프로빙 기술이다. ^{4-6 전통적,} AFM은 표면 지형, 형태학 및 멀티 phasic 재료의 구조의 평가에 사용된다. AFM은 정량적으로 공기와 액체 매체 모두에서 특정 프로브와 기판 사이의 책임, 매력, 반발과 접착 힘으로 나노 크기의 상호 작용을 평가하는 기능을 가지고 있습니다. ^7,8 원래 비닝, Quate에와 거버 ⁹ 용도로 개발 된 AFM 알려진 결정 / 감도와 샘플에 접근 및 / 또는 스캔 스프링 상수의 프로브. 인해 탐침과 시료 사이의 물리적 상호 작용, 캔틸레버가 접촉 또는 근접하는 동안 편향되며, 동작 모드에 따라, 이러한 편향은 탐침과 샘플 사이에 샘플 또는 계수의 힘의 지형을 취득 번역 될 수있다. AFM의 TECHNI에 대한 수정생각도, 콜로이드 프로브 nanoscopy로, ^(10)는 직접 그 콜로이드 시스템에있는 두 물질 사이의 나노 힘의 상호 작용을 평가하기 위해 과학자를 허용했다.

콜로이드 프로브 nanoscopy에서 선택의 구형 입자는 전통적인 원뿔과 피라미드 팁을 교체, 캔틸레버의 정점에 연결되어 있습니다. 구형 입자는 존슨, 켄달, 로버츠 (JKR) ¹¹ Derjaguin, 랜도, Vervwey, Overbeek (DLVO) ^12-14 이론과 측정에 대한 표면 거칠기의 영향을 최소화하기위한 이론적 모델과 비교를하는 것이 이상적입니다. ^15이 이론은 콜로이드 시스템 내에서 예상되는 접촉 역학과 입자 간 힘을 정의하는 데 사용됩니다. DLVO 이론 동안 J, 정량적으로 수성 콜로이드 시스템의 집계 동작을 설명하는 매력적인 반 데르 발스의 힘과 (때문에 전기 더블 레이어) 반발 정전기력을 결합KR 이론은 두 개의 구성 요소 사이의 탄성 접촉을 모델링하는 접촉 압력과의 접착 효과를 통합한다. 적절한 프로브가 생성되면, 그것은 두 개의 구성 요소 사이의 힘을 평가하기 위해 다른 물질 / 입자를 접근하는데 사용된다. 표준 제조 된 팁을 사용하는 팁과 선택의 재료 사이에서 쌍방향의 힘을 측정 할 수 있지만, 주문품 콜로이드 프로브를 사용하는 이점은 조사 시스템 내에 존재하는 물질 사이에 힘의 측정을 허용한다. 측정의 상호 작용은 다음과 같습니다.. 접착제, 매력, 반발, 충전 및 입자 사이에 존재도 정전기력을 ¹⁶ 또한, 콜로이드 프로브 기술은 입자와 재료 탄성 사이에 접선 방향의 힘을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다 ^{(17, 18)}

다양한 미디어에서 측정을 수행 할 수있는 능력은 콜로이드 프로브 nanoscopy의 주요 장점 중 하나입니다. 주변 조건, 액체 Media 또는 습도 제어 된 조건 모두 공부 시스템의 환경 조건을 모방하기 위해 사용될 수있다. 액체 환경에서 측정을 수행 할 수있는 능력은 자연적으로 발생하는 환경에서 콜로이드 시스템의 연구를 가능하게; 따라서, 양적으로 자연 상태에서 시스템으로 직접 변환 가능한 데이터를 취득 할 수있는. 예를 들어, 정량 흡입기 (MDI) 내에 존재하는 입자의 상호 작용은 MDI를 사용 추진제와 유사한 특성을 가진 모델 액체 추진제를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 공기 중에서 측정 된 동일한 상호 작용은 흡입기의 시스템의 대표적인 존재하지 않을 것이다. 또한, 액상 매질이 수분 유입, 보조 계면 활성제, 또는 MDI에서 입자의 상호 작용에 대한 온도의 영향을 평가하기 위해 수정 될 수있다. 온도를 제어하는​​ 능력은 어떻게 온도에서 제조하거나 또는 평가하는 콜로이드 시스템의 제조에서 특정 단계를 모방하는 데 사용될 수있다콜로이드 성 시스템의 저장소는 입자의 상호 작용에 영향을 미칠 수있다.

콜로이드 프로브를 사용하여 얻을 수있다 측정은 다음과 같습니다; 지형 스캐닝 개별 힘 - 거리 곡선, 힘 - 거리 점착 맵, 힘 - 거리 측정치 드웰. 이 논문에서 제시 한 콜로이드 프로브 nanoscopy 방법을 사용하여 측정하는 중요한 매개 변수는 스냅인, 최대 부하와 분리 에너지 값이 (가) 있습니다. 스냅인 흡인력의 측정이며, 최대는 최대 접착력의 값을로드하고, 박리 에너지가 접촉으로부터 입자를 인출하는 데 필요한 에너지를 전달한다. 이 값은 순간이나 체류 힘 측정을 통해 측정 할 수있다. 드웰 측정의 두 가지 유형의 편향 및 들여 쓰기를 포함한다. 드웰 측정의 길이와 종류는 특히 관심의 시스템 내에서 존재하는 특정 상호 작용을 모방하기 위해 선택 될 수있다. 예 편향 드웰를 사용 -하는 보유분산 형성 집계에서 개발 접착제 채권을 평가하기 - 원하는 편향 값에 접촉하는 샘플. 형성된 접착제 결합은 시간의 함수로서 측정 될 수 있고, 장기 보관 후의 응집물을 재 분산하는 데 필요한 힘에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 이 방법을 사용하여 얻을 수있는 데이터의 과다 방법의 다양성에 대한 선언 과도 같은 것입니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. 콜로이드 프로브 및 AFM 기판을 준비

1. 콜로이드 프로브를 준비하기 위해, 저자가 이전에 개발 된 방법을 사용합니다. ¹⁹
   1. 간단히, 45 ° (그림 1A)의 특정 각도로 tipless 캔틸레버를 부착하는 45 ° 각도 홀더를 사용합니다.
   2. 현미경 슬라이드 상에 에폭시를 얇게함으로써 번짐 에폭시 슬라이드를 준비한다. 현미경 슬라이드에 추가 에폭시의 층이 최소한의 높이가 있는지 확인하기 위해 깨끗한 주걱 또는 질소의 느린 스트림을 사용합니다.
   3. 맞춤 설계된 홀더 (그림 1B)를 사용하여 40 배 광학 줌 현미경 렌즈에 에폭시 슬라이드를 붙입니다. 이어서 에폭시 슬라이드 접근하고 캔틸레버에 에폭시의 소량을 취득하는 캔틸레버를 사용한다.
   4. 또한 캔틸레버 (그림 1C)의 정점이자의 단일 입자를 연결하는이 단계를 반복합니다.
2. 콜로이드 파를 부착하여 AFM 기판을 준비열가소성 부착 접착제를 이용하여 커버 슬립의 AFM 상로 다칠.
   1. 120 ° C에 35mm 라운드 커버 슬립을 가열하고, 커버 슬립에 접착제의 작은 금액을 적용합니다. 높은 온도는 응용 프로그램의 열가소성 접착제를 용해 할 필요가있다.
   2. 그런 멋진, 접착제에 콜로이드 입자를 채취하기 전에 40 ° C까지 커버 슬립. 주 : 40 ° C에서 접착제가 충분히 입자가 접착제에 포함되지 것입니다 설정하지만, 접착제 입자가 기판에 부착 할 수 있도록 충분히 스티커입니다.
   3. 또한 RT에 커버 슬립을 냉각하고 초과 연결되지 않은 입자를 날려 질소의 부드러운 스트림을 사용합니다.
   4. 모든 비 부착 된 입자가 기판으로부터 제거되도록 콜로이드 프로브 측정을 위해 사용될 것이다 액체 매질과 기판을 여러 번 씻는다. NOTE : 이것은, 측정 중에 자유 유동성 입자의 영향을 감소하는 것이 중요 할 수있는 인터캔틸레버 행동과 결과의 오류를 소개합니다.

2. 콜로이드 프로브 정렬, 레이저 및 평형화 시스템 장착

1. O-링이 어떤 누출을 방지하기 위해 올바르게 장착되었는지 확인하고, 액체 셀의 하단에 콜로이드 입자의 coverslip를 탑재합니다.
2. 특히 만 측정을위한 액체 셀의 아래쪽 절반을 사용하는 경우, 실험 기간 동안 누출 될 수있는 액체를 방지하고, 현미경의 무대에 액체 셀을 배치 현미경 무대에 소수성 투명 시트를 놓습니다. 참고 : 간단하게하기 위해 하나의 시스템이 적절하게 평형을 할 수있는 점을 감안, 액체 세포 만 아래쪽 절반을 사용할 수 있습니다; 팁 - 증발 측정 및 영향의 결과 / 독서의 상태를 변경합니다.
3. AFM 스캔 헤드에 콜로이드 프로브를 장착하고 AFM에 조립합니다. 의 AFM 기기 소프트웨어를 사용에 노브를 사용하여초점 캔틸레버 팁을 가지고 머리를 스캔. 참고 : 모든 절차 단계와 측정이 정신 병원 연구 소프트웨어 MFP-3D-바이오 AFM을 사용하여 완성되었다.
4. , 강도를 최대화 스캐닝 헤드에 적절한 조정 노브를 이용하여 캔틸레버의 선단에 레이저를 정렬한다.
5. 시스템이 5 ~ 10 분 동안이나 편향 값이 안정 될 때까지 평형을 허용합니다. 제로 또는 약간 마이너스 편향을 가지고 편향 조절 노브를 사용합니다.
6. 시스템이 공중에 평형화 후에 InvOLS (감도)와 콜로이드 프로브의 스프링 정수를 산출 열적으로 AFM 소프트웨어 (마스터 패널 윈도우 열적 패널)을 사용한다. 주 : 실제 감도 측정이 완료 될 때까지 측정이 감도는 일시적으로 (4 단계 참조)이 사용됩니다.
   1. "열 데이터를 캡처"를 클릭 한 후 "칼 스프링 상수"또는 "칼 InvOLS"을 하나 선택합니다.
   2. 한 번눈에 띄는 피크가 분명하다, 데이터 캡처를 중지하고, 메인 피크 위에 확대합니다.
   3. 자동으로 계산 스프링 상수 또는 InvOLS 값을 얻기 위해 "열 데이터에 맞게"다음에 "초기화 맞추기"를 클릭하십시오.
7. 천천히 주사기를 사용하여 액체 셀에 액체 배지 2 ㎖를 추가하고 기포가 캔틸레버의 주위에 존재하지 않는 것을 확인합니다. 매질의 굴절률이 이제 변경된 이후, 레이저를 다시하는 것은 - 정렬하고 다시 편향 값은 다시 0으로 편향을 조절하기 전에 안정화 할 수 있도록 시스템을 평형. 참고 : 큰 온도 차이가 환경과 액체 사이에 존재하는 경우, 평형 시간이 더 걸릴 것입니다.

3. 이미징 및 데이터 수집

1. 1 Hz에서 90 °로 스캔 각도, 0.2 V로 설정 지점에 스캔 속도, 20 μm의 초기 스캔 크기를 설정하고 샘플의 검사를 얻을 수 있습니다. 오버랩 추적을 구하는 것이 필요 게인을 조정곡선을 되돌아.
2. 또한 입자가 발견되면, 직전 포스 볼륨 측정을 얻는데 기판과 확장 된 탐침의 상호 작용을 제한하기 위하여 그 입자에 확대.
3. 한 번에 확대, 단일 입자의 단일 입자 또는 부분의 충분한 이미지를 취득. 그런 다음 소프트웨어의 강제 패널로 전환합니다. , 가장 높은 위치에 빨간색 위치 표시 줄을 가지고 5 μm의, 스캔 속도 0.1 Hz에서, 아무도에 트리거 채널에 힘 거리를 설정하고 하나의 힘 측정을 실시하고 있습니다. 프로브가 기판과 접촉하지 않도록하십시오.
4. 얻어진 단일 측정 그래프에서 그래프 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 가상 편향 라인을 계산하고, "가상 데프 라인을 계산"옵션을 선택. 이것은 자동으로 가상 편향 계산 소프트웨어 내에 필요한 값을 갱신한다.
5. 20 nm의 트리거 포인트를 편향하고 설정하는 트리거 채널을 변경합니다. 힘 DIST를 설정1 μm의 ANCE 관심의 측정 된 힘에 따라 원하는대로 스캔 속도를 조정합니다.
6. 수동으로 2 ~ 3 년 연속 예비 하나의 힘의 측정을 수행 한 후 검토 포스 패널의 변형 역 광학 레버 감도 (InvOLS)의 값을 조정합니다.
   1. 하나의 힘 측정을 실시하고 마스터 포스 패널을 여는 힘 패널의 "검토"버튼을 클릭합니다.
   2. 가장 최근에 완성 된 힘 측정을 강조 표시합니다. "축"는 제목 아래 만 "DeflV"가 선택되어 있는지 확인합니다. "9 월"드롭 다운 메뉴를 사용하려면 "X 축"입력 필드를 변경하고 클릭 "그래프를 확인합니다."
   3. 마스터 포스 패널의 "PARM"탭을 클릭하고 그래프의 접촉 영역이 완전히 수직이 될 때까지 "InvOLS"의 값을 조정합니다. 그런 다음 칼 아래에있는 "Defl InvOLS"필드에이 값을 채 웁니다(60) 주 마스터 패널 창에있는 강제 탭의 하위 탭을 클릭합니다.
   4. InvOLS 값이 크게 변경되지 않도록하기 위해이 2 ~ 3 번 반복합니다.
7. 이제 모든 매개 변수가 설정되어 있는지, 액체 중간 수준은 여전히​​ 충분하며, 편향은 여전히​​ 안정적인지 확인하십시오. 참고 :이 때, 하나의 힘 곡선 또는 힘지도를 얻을 수있다. 드웰 힘을 측정하고 싶은 경우는, 드웰 옵션은 강제 패널에 액세스 할 수 있습니다.

분석 감도 4. 후 조정

1. 측정 수집의 완료 후, 콜로이드 프로브의 실제 감도를 측정한다. 이를 위해, 예컨대 운모 "무한"경질의 표면에 대해 동일한 액체 매질에서 콜로이드 프로브 비교적 큰 편향 / 힘을 사용하여 힘 측정을 실시. 참고 : 큰 편향 / 힘이 Collo까지 손상 될 수 있기 때문에 감도는 실험 종료 후 얻은다공성 또는 깨지기 쉬운 콜로이드 준비 IDAL 프로브.
2. 접촉 영역의 기울기가 자동 감도 (도 2)를 계산하는 소프트웨어에 의해 사용된다. 특정 콜로이드 프로브를 사용하여 얻은 모든 곡선의 데이터 분석에서 감도의이 진정한 가치를 사용합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

액체 콜로이드 시스템은 여러 가지 제약 약물 전달 시스템에 사용됩니다. 흡입 약물 전달, 일반적인 콜로이드 시스템은 정지 가압 정량 흡입기 (PMDI)입니다. PMDI 내에 존재하는 입자의 상호 작용 제제 ​​물리적 안정성, 저장 및 약물 전달의 균일 성에서 중요한 역할을한다. 이 논문에서는, 모델 추진체 (2H, 3H-퍼플 루오로 펜탄)에서 다공질 지질 계 입자 간의 입자 간 힘 (~ 2 ㎛의 광학 평균 입자 직...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

액 콜로이드 프로브 nanoscopy 동안 본 시스템 불안정의 여러 소스를 쉽게 적절한 평형 절차를 통해 완화 될 수 있습니다. 논의 된 바와 같이 불안정 이전 객관적으로 분석하기 더 어렵다 잘못된 결과 강제 곡선 초래한다. 불안정성의 모든 소스가 한 경향 및도 4에 도시 된 것과 유사한 그래프가 여전히 존재하는 경우, 다른 측정 파라미터는 이유가 될 수있다. 콜로이드 프로브 nanoscopy시 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double-Bubble Epoxy	Hardman	4004
Veeco Tipless Probes	Veeco	NP-O10
Porous Particles	Pearl Therapeutics
Atomic Force Microscope (MFP)	Asylum	MFP-3D
SPIP Scanning Probe Image Processor Software	NanoScience  Instruments
35 mm Coverslips	Asylum	504.003
Tempfix	Ted Pella. Inc.	16030