Derivación de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De células madre embrionarias de ratón

Resumen

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Resumen

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Introducción

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

Protocolo

1 Preparación de medios de cultivo, citoquinas y Placas gelatinizada

1. Preparar los medios de comunicación de células ES mediante el uso de Modificación de Medio de Eagle (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa y piruvato de sodio. Añadir 20% ESC Calificación suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% Tampón HEPES, ácidos 1% para no esencial amino, 0,1% de gentamicina (50 mg / ml) y 0,1% ( 55 M) β-mercaptoetanol. Esterilizar medio de células ES por filtración.
2. Preparar medios OP9 al hacer 1 L de medio esencial mínimo alfa (α-MEM) a partir de polvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir 20% de suero fetal bovino (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina. Invertir para mezclar. Esterilizar por filtración en dos alícuotas de 500 ml.
   NOTA: Se recomienda el uso de medios elaborados a partir de polvo y es probable que para producir un mejor mantenimiento de células OP9 y en los resultados de diferenciación in vitro. Este enfoque se ha convertido en nuestro procedimiento estándar. Sin embargo, también observamos That hemos utilizado a veces líquidos pre-hechos α-MEM con éxito adecuada.
3. Preparar medio de congelación mediante la adición de 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 90% de FBS. Agitar suavemente y esterilizar por filtración. Almacenar a 4 ° C.
4. Preparar 2,000x Flt-3 ligando (10 g / ml) por disolución de Flt-3 humana recombinante ligando (Flt-3L) en medios OP9 completa a 10 g / ml. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor respecto a la estabilidad y el almacenamiento.
   NOTA: La estabilidad de Flt-3L es corto (1 mes a 4 ° C o 3 meses a -80 ° C).
5. Preparar 1,000x IL-7 (1 g / ml) mediante el uso de medios de comunicación OP9 completa. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor sobre la estabilidad y almacenamiento (IL-7 es estable por hasta 12 meses a -80 ° C).
6. Preparar 1,000x Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) (10 g / ml) por una dilución 1:10 de 10 ⁷ unidades de LIF in medio de células ES. Alícuota Almacenar a 4 ° C. Asegúrese de anotar la fecha de caducidad indicada por el fabricante en los viales alícuotas.
   NOTA: El producto es estable en forma concentrada o diluida al menos 18 meses a partir de la fecha de fabricación.
7. Preparar placas de 6 pocillos gelatinizados por añadir 1,5 ml de 0,1% de solución de gelatina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Deja los platos en la campana estéril a temperatura ambiente con las tapas en, dejando al menos 30 minutos para el recubrimiento. Los platos también se pueden dejar en una incubadora humidificada durante la noche. Retire cualquier solución de gelatina sobrante justo antes de la siembra de células. No deje que la solución de gelatina se seque por completo en el pozo.

2 Preparación y mantenimiento de células alimentadoras y las células madre embrionarias de ratón (mESC)

NOTA: Incubar todas las células en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO _2.

1. Descongelación fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)
   1. Quick-descongele un vial congelado (~ 5 x 10 ⁶ células / vial) de mitomicina C-tratado (o de otra manera detenidas mitóticamente MEFs) y los transfieren a un tubo de 15 ml.
   2. Añadir 8 ml de medio de células ES a las células descongeladas, de una manera gota a gota para diluir gradualmente el DMSO a partir del medio de congelación.
   3. Centrifugar las células a 400 x g a 4 ° C durante 5 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml de medio de células ES.
   4. Preparar un tubo de centrífuga de 50 ml con 33 ml de medio de células pre-calentado ES. Añadir los 3 ml de MEFs resuspendidos a llevar el volumen final a 36 ml.
   5. Distribuir 3 ml de los MEFs resuspendidos en cada pocillo de dos placas de 6 pocillos gelatinizado. Colocar las placas en la incubadora durante al menos seis horas para permitir que las células se unan y se extienden antes de la siembra de las mESCs en ellos. Estas capas alimentadoras mitóticamente detenidas pueden ser utilizables durante varios días después de la siembra inicial, si sus medios se cambian cada 2-3 días.
      NOTA: MEFs recién detenidos también se pueden utilizar.
   6. MESCs Siembra
      1. Quick-descongele un vial con un congelado clon mESC en el baño a 37 ° C y preparar las células como se describe en 2.1.1-2.1.3.
         NOTA: Nos congelamos 2 viales de mESC de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos.
      2. Retire el medio de un pozo (por clon mESC) de la placa de 6 pocillos con monocapas MEF detenidos (preparado en el paso 2.1.5) y sembrar el 3 ml de mESCs en la parte superior de la monocapa MEF. Añadir 3 l de 1,000x LIF (10 ng / ml). Volver platos en la incubadora.
   7. El mantenimiento de células ES y la tripsina mediada pasaje
      NOTA: Cambiar medios diarios o Split basado en la confluencia de mESC. En condiciones óptimas, la cosecha y de división / re-placa de las células cada dos días.
      1. Retire el medio de células ES y lavar mESCs con 2 ml de PBS. Retire PBS. Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 3-5 min.
      2. Recoger las células tratadas con tripsina y transferirlos en un tubo de centrífuga de 15 ml. Pipetear vigorosamente la suspensión celular a romper los grumos de mCES. Añadir 2 ml de medio de células ES completa a la suspensión celular para neutralizar la tripsina.
      3. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de células ES medios de comunicación.
      4. Retire el medio de placas de 6 pocillos que contienen monocapas MEF detenidos preparados. Añadir la cantidad apropiada de la suspensión celular (basado en la relación de separación deseada) en 3 ml de medio de células ES a cada pocillo para sembrar. Añadir 3 l de LIF 1,000x. Una confluencia mESC bien dividida 1: 6 estará listo para el paso en 2 días.
   8. OP9 / mantenimiento de células OP9-DL1
      1. Descongelar un vial de células OP9 (siga los pasos 2.1.1-2.1.3 utilizando medios OP9)
      2. Añadir 7 ml de medio OP9 a 10 cm placa de cultivo tisular. Añadir los 3 ml de células resuspendidas en una forma gota a gota, la distribución de las células de todo el plato. Colocar las células durante la noche en la incubadora.
      3. Compruebe la confluencia de las células OP9 al día siguiente. Si el plato contiene muchas células flotando muertos, remove los medios de comunicación y añadir 10 ml de medio OP9 fresco. Devuelva el plato a la incubadora si no se observa casi llena confluencia. Split (utilizando tripsina) 1: 4 cerca de la monocapa confluente OP9.
         NOTA: Las placas deben llegar a mismo nivel confluencia de nuevo en unos 2 días. Tenga cuidado de no dejar que las células OP9 vuelto sobre-confluente.
      4. Congelar los primeros pasajes de células OP9 como acciones de expansión.
         NOTA: Nos congelamos 2 viales de células OP9 de una cerca de la confluencia placa de 10 cm. Cada vial de expansión de valores puede ser propagado a crear reservas de trabajo que se utilizan posteriormente en mESC experimentos de co-cultivo. Mantenga todas las existencias OP9 congelados en nitrógeno líquido y no en el congelador -80 ° C, ya que las temperaturas fluctuantes pueden influir negativamente en la calidad de las heladas.

   3. OP9-DL1 Procedimiento Co-cultura

   1. Preparaciones de Co-cultura
      1. Aproximadamente una semana antes de la iniciación de un co-cultivo, descongelar MEFs, mESCs y sto celular OP9 trabajocks. Dado que las células OP9-DL1 no son necesarios hasta el día 8 de co-cultivo, descongelar las células OP9-DL1 durante los primeros tres días después del inicio de co-cultivo. Mantener o congelar todas las células según sea necesario.
      2. Determinar el número inicial de placas de 10 cm con monocapas de células OP9 preparados para alcanzar el 80% de confluencia en co-cultura día 0 en base a la escala del experimento (por ejemplo, número de clones mESC para diferenciarse y el número de puntos de tiempo de co-cultivo de ser analizada). Para prepararse para una co-cultura, dividido cerca plato confluente de células OP9 entre 1: 4 y 1: 6 dos días antes de que se necesitarán las monocapas.
         NOTA: Uno necesitará al menos una placa por clon ESC. Típicamente, un solo clon ESC sembró en una sola placa (como se describe a continuación) en el día 0 deben producir suficientes células para sembrar placas de seis días en el paso 5. Cada placa 5 días permitirá una posterior punto de tiempo de análisis.
      3. Desde monocapas OP9 serán continuamente necesarios para el paso de co-cultivo, tenga cuidado de siempre maintaen un número adecuado de placas de cultivo de OP9 adicionales en paralelo con el co-cultivo.
   2. Día 0: Inicio de la co-cultura
      1. Recoger mESC como en 2.3.1-2.3.4. Contar las células.
      2. Para cada clon mESC preparar 5 x 10 ⁴ mESC en 10 ml de medio por placa OP9.
         NOTA: Aunque no hemos utilizado, observamos que un medio alternativo que consiste en α-MEM, el 10% de SFB, y 5 x 10 ^-5 M β-mercaptoetanol También se ha informado para el uso en la diferenciación de co-cultivos ^10.
      3. Eliminar los viejos medios de OP9 platos y añadir los 10 ml de suspensión mESC a los platos teniendo cuidado para distribuir las células uniformemente a través de la placa. Colocar las cápsulas en la 37 ° C incubadora.
   3. Día 3: Cambio de medio
      1. Sacar los recipientes de la incubadora y observar bajo el microscopio. Las colonias deben comenzar a perder brillo y un aspecto apisonado.
      2. Retire el medio de platos y añadir con cuidado 10 ml de fresco OP9medios de comunicación.
      3. Devolver los platos de co-cultivo a la incubadora. Monitorear visualmente la formación de colonias de mesodermo, como todos los días para informar al momento de OP9 preparación monocapa alimentador para el siguiente paso (día 5), ​​que no debe llevarse a cabo hasta ~ 80-90% de las colonias mostrar visualmente mesodermo como morfología. Aplazamiento máximo de la etapa de transferencia de células 5 días es de 2 días.
   4. Día 5: La tripsina pasaje mediada con pre-chapado.
      NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes. Proceda con los siguientes pasos sólo si los co-cultivos muestran visualmente las características que se describen en el paso 3.3.3 (ver resultados también representativos).
      1. Retire el medio de los platos de co-cultivo. Añadir 4 ml de PBS para lavar. Agitar el PBS y quitar. Añadir 4 ml de tripsina al 0,25% y colocar los platos en la incubadora de ~ 5 min.
      2. Interrumpir la capa de las células tratadas con tripsina por pipeteo vigoroso, con cuidado de no introducir burbujas de aire excesivas, hasta que unhomogénea se logra, sobre todo sola suspensión celular.
      3. Añadir 4 ml de medio OP9 completos y mezclar con la pipeta. Transferencia de células en un nuevo, vacío placa de 10 cm y el lugar en la incubadora durante 30 min para permitir que las células se adhieran OP9 al plato. Este paso de "pre-chapado" reduce el número de OP9 células transferidas a la siguiente etapa de co-cultivo.
      4. Preparar 50 ml tubos de centrífuga con células coladeras 40 micras.
      5. Recoger las células no adherentes de la placa de pre-chapado y pasar a través del filtro de células en el tubo. Lave el plato suavemente con 6 ml de PBS y pasarla a través del mismo filtro, dejando las células OP9 unidos detrás.
      6. Centrifugar las células a 400 x g 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 3 ml de medio OP9 completa. Contar las células.
      7. Retire el papel de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes.
      8. Para cada punto de tiempo de análisis, sembrar 5 x 10 ⁵ células en el mono OP9capa en volumen final de 10 ml.
      9. Añadir 5 ng / ml humana recombinante Flt-3L y colocar los platos en la incubadora.
   5. Día 8: hematopoyético de células progenitoras (HPC) de recogida
      NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con monocapas OP9 o-DL1 OP9 celulares para que puedan ser ~ 80% de confluencia en el tiempo para este paso.
      1. Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores.
      2. Quitar los platos de la incubadora y observar bajo el microscopio. Grupos brillante de HPC deben ser débilmente unidos a la monocapa OP9. Recoger la mayor cantidad de estas células como sea posible mediante el lavado (pero no demasiado interrumpir) la monocapa OP9 con una pipeta y los medios de comunicación existentes en el plato. Para evitar la formación de espuma, siempre dejar al menos 1 ml de los medios de comunicación en la punta de la pipeta durante esta colección HPC / paso de lavado.
      3. Pasar las células a través del filtro de 40 micras en un tubo. Añadir 8 ml de PBS a la misma placa y comprobar bajo el microscopio si todos nos HPCsre recogido. Repita el paso de lavado / colección con PBS y (si es necesario) con el lavado más enérgico. Colar las células en el tubo ya que contiene las células de la misma placa.
      4. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
      5. Preparar una mezcla maestra de 3 ml (por placa sembró en el día 5) de los medios de OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7.
      6. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en medios OP9 con Flt-3L + IL-7 mezcla maestra (3 ml por cada placa de 10 cm procesado). Transferencia de las células recogidas de cada placa en un pocillo de una placa de 6 pocillos con células OP9.
         1. Con el fin de conducir hacia las células monocíticas, células B o linajes eritroides, sembrar las células recogidas en las células OP9. Para derivar células T, sembrar las células en monocapas de células OP9-DL1.
      7. Coloque las placas de 6 pocillos en incubadora.
   6. Día 10: Cambio de medio
      1. Preparar un tubo de centrífuga de 15 ml para cada distinto mESC clon-alimentador tipo de células combición en co-cultivo.
      2. Preparar una mezcla maestra de los medios OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. Preparar 3 ml para cada pocillo.
      3. Recoger suavemente los medios de comunicación de cada pocillo de la placa de 6 pocillos que combina los medios de comunicación de múltiples pocillos que contienen el mismo clon de alimentador de tipo de célula combinación ESC.
      4. Añadir 2 ml de mezcla maestra medios OP9 (véase 3.6.2) en cada pocillo.
      5. Centrifugar los medios de recogida a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet (muy pequeña si es visible) en 1 ml de OP9 maestro de la mezcla de medios (ver 3.6.2) por pocillo recogido inicialmente en el paso 3.6.3.
      6. Distribuir 1 ml de células de nuevo en cada pocillo de la que los medios de comunicación se recogió originalmente llevando el volumen en cada pocillo a 3 ml. Vuelva a poner las placas en la estufa.
   7. Día 12: Ningún pasaje tripsina
      NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con células OP9 o OP9-DL1 para que puedan ser confluentes de manera óptima en el tiempo para este step. Día 12 es ideal para el análisis de citometría de flujo de eritroide en desarrollo, monocitos y células T en fase inicial.
      1. Preparar una mezcla maestra (3 ml para cada pocillo que continuará en co-cultivo) de los medios de comunicación OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7.
      2. Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores (uno para cada clon-alimentador tipo de célula combinación ESC en co-cultura).
      3. Vigorosamente pipetear los medios de comunicación existentes en cada pocillo para desagregar todas las células (incluyendo la monocapa) en el pozo. Continuar con pipeteo enérgico hasta que se alcanza un estado parecido a una suspensión de células individuales.
      4. Pasar las células recogidas a través del filtro en el tubo. Añadir 3 ml de PBS en cada pocillo para lavar y recoger todas las células restantes. Pasar las células a través del mismo filtro. Combinar celdas de múltiples pozos que contienen el mismo clon-alimentador tipo de célula combinación ESC.
      5. Desechar el filtro de células utilizado y eliminar una parte alícuota equivalente a un pocillo (~ 6 ml) para cualquier deseadacitometría de flujo (u otro) análisis a realizar en ese día. Guarde estas alícuotas en hielo antes de su uso.
      6. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento de los tubos de centrífuga de 50 ml en 3 ml de mezcla maestra por pozo a ser re-sembrado. Añadir 3 ml por pocillo de cada suspensión de células en el tipo de células de alimentación apropiada y colocar los platos en la incubadora.
   8. Día 14: Cambio de medio
      1. Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6.
   9. Día 16: Ningún pasaje tripsina
      NOTA: Preparar con antelación placas de 6 pocillos de células OP9 o OP9-DL1 óptimamente confluentes para este paso.
      NOTA: El día 16 es ideal para el flujo de análisis de citometría de los linfocitos B y las células T de la etapa intermedia.
      1. Siga los pasos descritos en la sección 3.7.
   10. Día 18: Cambio de medio
       1. Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6.
   11. Día 20: Ningún pasaje tripsina
       NOTA: Día 20 is ideal para citometría de flujo análisis de mediados o finales de etapa de desarrollo las células T.
       1. Siga los pasos descritos en la sección 3.7. Si lo desea, realizar la diferenciación de células día 20 cambio de medio alterna pasado y no tripsina pasajes cada dos días con un seguimiento diario de la tasa de expansión de los linfocitos.

Resultados

Cuando se cultiva en MEFs en presencia de LIF, mESCs se pueden mantener en un estado indiferenciado. Bajo condiciones ideales, aparecen como colonias compactas de células rodeadas por un halo brillante en la microscopía de contraste de fases (Figura 1). Estos cultivos deben ser monitoreados diariamente. Dependiendo de la confluencia de las células, los medios de comunicación pueden ser cambiados o células se pueden dividir. Vecinas colonias mESC no deben llegar al punto de contacto entre sí. Un cu...

Discusión

El sistema OP9-DL1 de co-cultivo se ha utilizado para estudiar el papel de los diversos productos de genes durante el desarrollo de tipos de células sanguíneas a partir de células madre. ^8,12,13 También ha demostrado ser un modelo eficaz para estudiar la función del ADN reguladora del gen durante la diferenciación celular. ^9,14 Con este enfoque como una alternativa a los modelos enteros de ratón puede producir un considerable ahorro en tiempo y coste de los experimentos que abordan muchas cu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab