Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

Riepilogo

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Abstract

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Introduzione

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

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Protocollo

1 Preparazione della Cultura Media, Citochine e piatti gelatinizzato

1. Preparare supporti cellule ES utilizzando Modifica Dulbecco di Eagle Medium (DMEM) con alte concentrazioni di glucosio e piruvato di sodio. Aggiungere 20% ESC Qualificato Fetal Bovine Serum (FBS), 1% di penicillina / streptomicina, 1% L-glutammina, 1% HEPES Buffer, 1% non-aminoacidi essenziali, gentamicina 0,1% (50 mg / ml) e 0,1% ( 55 mM) β-mercaptoetanolo. Sterilizzare supporti cellule ES per filtrazione.
2. Preparare supporti OP9 facendo 1 L di Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) da polvere secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Miscelarlo. Sterilizzare per filtrazione in due aliquote da 500 ml.
   NOTA: è consigliato e rischia di produrre una migliore manutenzione delle cellule OP9 e nei risultati di differenziazione in vitro L'uso di supporti a base di polvere. Questo approccio è diventato la nostra procedura standard. Tuttavia, notiamo anche that abbiamo a volte usato liquido pre-fatte α-MEM con un adeguato successo.
3. Preparare il congelamento dei media con l'aggiunta del 10% dimetilsolfossido (DMSO) al 90% FBS. Agitare delicatamente e sterilizzare per filtrazione. Conservare a 4 ° C.
4. Preparare 2,000x Flt-3 ligando (10 mg / ml) sciogliendo ricombinante umano Flt-3 ligando (Flt-3L) in mezzi OP9 completo a 10 mcg / ml. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. Seguire le raccomandazioni del fornitore per quanto riguarda la stabilità e lo stoccaggio.
   NOTA: La stabilità di Flt-3L è breve (1 mese a 4 ° C o 3 mesi a -80 ° C).
5. Preparare 1,000x IL-7 (1 mg / ml) utilizzando mezzi OP9 completo. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. Seguire le raccomandazioni del fornitore sulla stabilità e la conservazione (IL-7 è stabile fino a 12 mesi a -80 ° C).
6. Preparare 1,000x leucemia inibitorio Factor (LIF) (10 mg / ml) da una diluizione 1:10 del 10 ⁷ unità di LIF in supporti cellule ES. Conservare aliquota a 4 ° C. Assicurarsi di annotare la data di scadenza prevista dal fabbricante sulle fiale aliquote.
   NOTA: Il prodotto è stabile in forma concentrata o diluita almeno 18 mesi dalla data di produzione.
7. Preparare 6 pozzetti gelatinizzati da aggiungere 1,5 ml di 0,1% soluzione di gelatina in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Lasciare piatti nella cappa sterile a temperatura ambiente con coperchi su, permettendo almeno 30 minuti per il rivestimento. I piatti possono anche essere lasciati in un incubatore umidificato durante la notte. Rimuovere eventuali residui di soluzione di gelatina a destra prima semina delle cellule. Non lasciate che la soluzione di gelatina completamente asciugare nel pozzo.

2 Preparazione e manutenzione di cellule di alimentazione e di cellule staminali embrionali di topo (Mesc)

NOTA: Incubare tutte le celle in un umidificata 37 ° C incubatore con il 5% di CO _2.

1. Scongelamento fibroblasti embrionali di topo (MEF)
   1. Quick-scongelare una fiala congelata (~ 5 x 10 ⁶ cellule / fiala) di mitomicina C-trattati (o in altro modo mitoticamente arrestato MEF) e trasferirli in una provetta da 15 ml.
   2. Aggiungere 8 ml di mezzi di cellule staminali alle cellule scongelati, in modo goccia a goccia per diluire gradualmente il DMSO dal mezzo congelamento.
   3. Centrifugare le cellule a 400 x g a 4 ° C per 5 min. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di media cellulare ES.
   4. Preparare una provetta da centrifuga da 50 ml con 33 ml di supporti pre-riscaldato cellule ES. Aggiungere 3 ml di MEF risospeso a portare il volume finale di 36 ml.
   5. Distribuire 3 ml del MEF risospeso in ciascun pozzetto di due piastre gelatinizzato 6 pozzetti. Posizionare le piastre in incubatore per almeno sei ore per consentire alle cellule di fissare e sparsi prima della semina i mESCs su di loro. Questi strati alimentatore mitoticamente arrestati potrebbero essere utilizzabili per diversi giorni dopo la semina iniziale, se i loro media viene cambiato ogni 2-3 giorni.
      NOTA: MEF di recente arrestati possono anche essere utilizzati.
   6. MESCs Semina
      1. Quick-scongelare un flaconcino con un clone Mesc congelato nel bagno di 37 ° C l'acqua e preparare le celle come descritto in 2.1.1-2.1.3.
         NOTA: congelare 2 fiale di Mesc da un pozzo confluente di un 6-pozzetti.
      2. Rimuovere i supporti da un pozzetto (per Mesc clone) del 6 pozzetti con monostrati MEF arrestati (preparati nel passaggio 2.1.5) e seminare il 3 ml di mESCs sulla parte superiore del monostrato MEF. Aggiungere 3 ml di 1,000x LIF (10 ng / ml). Piatti Rientro in incubatrice.
   7. ES manutenzione delle cellule e il passaggio tripsina mediata
      NOTA: Modificare supporti quotidiani, o Spalato sulla base di confluenza di Mesc. In modo ottimale, la raccolta e split / re-piastra le cellule a giorni alterni.
      1. Rimuovere i supporti di cellule ES e lavare mESCs con 2 ml di PBS. Rimuovere PBS. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina e incubare a 37 ° C per 3-5 min.
      2. Raccogliere le cellule trypsinized e trasferirli in una provetta da centrifuga 15 ml. Pipettare vigorosamente la sospensione cellulare per rompere ciuffi di mCES. Aggiungere 2 ml di completo supporto cellula ES alla sospensione cellulare per neutralizzare la tripsina.
      3. Cellule Spin a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml ES supporto cellulare.
      4. Rimuovere i supporti da 6 pozzetti contenenti preparati monostrati MEF arrestati. Aggiungere la quantità appropriata di sospensione cellulare (in base al rapporto di divisione desiderato) in 3 ml di supporti cellule ES in ciascun pozzetto per essere seminati. Aggiungere 3 ml di 1,000x LIF. Un confluenti Mesc ben diviso 1: 6 sarà pronto per il passaggio in 2 giorni.
   8. OP9 / mantenimento delle cellule OP9-DL1
      1. Scongelare una fiala di cellule OP9 (seguire la procedura 2.1.1-2.1.3 utilizzando supporti OP9)
      2. Aggiungere 7 ml OP9 media per 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Aggiungere 3 ml di cellule risospese in maniera goccia a goccia, la distribuzione di cellule in tutta la piastra. Posizionare le cellule durante la notte in incubatrice.
      3. Controllare la confluenza delle cellule OP9 il giorno successivo. Se il piatto contiene molte cellule galleggianti morte, remove media e aggiungere 10 ml di media OP9 fresco. Riportare il piatto per l'incubatore se quasi piena confluenza non si osserva. Split (utilizzando tripsina) 1: 4 prossimo monostrato confluente OP9.
         NOTA: Le piastre devono raggiungere di nuovo allo stesso livello confluenza in circa 2 giorni. Fare attenzione a non lasciare che le cellule OP9 diventare over-confluenti.
      4. Congelare i primi passaggi di cellule OP9 come scorte di espansione.
         NOTA: congelare 2 fiale di cellule OP9 da un vicino confluenti 10 centimetri piatto. Ogni flaconcino di espansione magazzino può essere ulteriormente propagato per creare scorte di lavoro che vengono poi utilizzati in Mesc esperimenti di co-coltura. Tenere tutti gli stock OP9 congelati in azoto liquido piuttosto che nel -80 ° C freezer, dal momento che le temperature fluttuanti possono influenzare negativamente la qualità delle blocca.

   3. OP9-DL1 Co-cultura Procedura

   1. Preparazioni di co-coltura
      1. Circa una settimana prima dell'inizio di una co-coltura, scongelare MEF, mESCs e sto lavorando cellulare OP9CKS. Poiché le cellule OP9-DL1 non sono necessari fino a co-coltura giorno 8, scongelare le cellule OP9-DL1 durante i primi tre giorni dopo co-coltura iniziazione. Mantenere o congelare tutte le cellule, se necessario.
      2. Determinare il numero iniziale di 10 cm piastre con monostrati cellulari OP9 pronti a raggiungere l'80% di confluenza in co-coltura giorno 0 in base alla scala dell'esperimento (ad esempio, il numero di cloni Mesc per differenziare e il numero di co-coltura punti di tempo a da analizzare). Per preparare una co-coltura, diviso nei pressi di piatto confluenti di cellule OP9 tra 1: 4 e 1: 6 due giorni prima di quando saranno necessari i monostrati.
         NOTA: Uno sarà bisogno di almeno una piastra per ogni ESC clone. Tipicamente, un singolo clone ESC seminato su un singolo piatto (come descritto sotto) al giorno 0 dovrebbe produrre abbastanza cellule per seminare sei piatti al giorno 5 di passaggio. Ogni piastra giorno 5 consentirà un certo punto volta successiva analisi.
      3. Dal monostrati OP9 saranno continuamente necessari per il passaggio co-coltura, aver cura di sempre maintain un numero adeguato di ulteriori piastre di coltura OP9 in parallelo con la co-coltura.
   2. Giorno 0: Avvio di co-coltura
      1. Raccogliere Mesc come in 2.3.1-2.3.4. Contare le cellule.
      2. Per ogni clone Mesc preparare 5 x 10 ⁴ Mesc in 10 ml di OP9 supporti per piastra.
         NOTA: Anche se non abbiamo usato, notiamo che un mezzo alternativo composto da α-MEM, 10% FBS, e 5 x 10 ^-5 M β-mercaptoetanolo è stato segnalato anche per l'uso in differenziazione co-colture ^10.
      3. Rimuovere vecchi media da OP9 piatti e aggiungere 10 ml di sospensione Mesc ai piatti avendo cura di distribuire le cellule in modo uniforme in tutta la piastra. Porre le capsule nella C incubatore 37 °.
   3. 3 ° giorno: Cambio media
      1. Togliere i piatti dal termostato e osservare al microscopio. Colonie dovrebbero cominciare a perdere lucentezza e appaiono appiattite.
      2. Rimuovere i supporti dai piatti e aggiungere delicatamente 10 ml di fresca OP9media.
      3. Restituire i piatti co-coltura per l'incubatrice. Visivamente monitorare la formazione di colonie mesoderma-come ogni giorno per informare i tempi di preparazione OP9 alimentatore monostrato per il passaggio successivo (giorno 5), che non deve essere effettuata fino a ~ 80-90% delle colonie visualizzare visivamente mesoderma simile morfologia. Massima rinvio della fase di trasferimento di cellule giorno 5 è di 2 giorni.
   4. Giorno 5: tripsina passaggio mediato con pre-placcatura.
      NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di 10 cm piatti con le cellule OP9 ottimale confluenti. Procedere con le fasi successive solo se le co-colture mostrano visivamente le caratteristiche descritte al punto 3.3.3 (vedi risultati anche Rappresentante).
      1. Rimuovere i supporti dai piatti di co-coltura. Aggiungere 4 ml di PBS per lavare. Agitare il PBS e rimuovere. Aggiungere 4 ml di 0,25% tripsina e posizionare i piatti in incubatrice per ~ 5 min.
      2. Interrompere lo strato di cellule trypsinized di pipettaggio vigoroso, facendo attenzione a non introdurre eccessive bolle d'aria, fino a quando un, sospensione di cellule per lo più unico omogeneo si ottiene.
      3. Aggiungere 4 ml di media OP9 completi e mescolare pipettaggio. Trasferire le cellule in un nuovo, piatto 10 centimetri vuoto e posto in incubatrice per 30 minuti per permettere alle cellule OP9 di aderire al piatto. Questa fase "pre-plating" riduce il numero di cellule OP9 trasferiti alla fase successiva di co-coltura.
      4. Preparare 50 ml provette con filtri di cella di 40 micron.
      5. Raccogliere le cellule non aderenti dal piatto pre-plated e farli passare attraverso il filtro delle cellule nel tubo. Lavare il piatto delicatamente con 6 ml di PBS e farla passare attraverso lo stesso filtro, lasciando le cellule OP9 attaccate dietro.
      6. Centrifugare le cellule a 400 x g 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule pellet in 3 ml di media OP9 completo. Contare le cellule.
      7. Rimuovere i supporti da 10 cm piastre con cellule OP9 ottimale confluenti.
      8. Per ogni punto di tempo di analisi, seminare 5 x 10 ⁵ cellule in mono OP9strato in 10 ml di volume finale.
      9. Aggiungere 5 ng / ml umana ricombinante Flt-3L e posizionare i piatti in incubatrice.
   5. 8 ° giorno: emopoietiche progenitrici delle cellule (HPC) di raccolta
      NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di 6 pozzetti con monostrati OP9 o OP9-DL1 cellule in modo che essi saranno in ~ 80% confluenti in tempo per questa fase.
      1. Preparare 50 ml provette da centrifuga con 40 micron filtri.
      2. Togliere i piatti dal termostato e osservare al microscopio. Cluster Shiny di HPC devono essere liberamente fissati alla monostrato OP9. Raccogliere il maggior numero di queste cellule come possibile lavando (ma non eccessivamente interrompere) il monostrato OP9 con una pipetta e la media esistenti sul piatto. Per evitare la formazione di schiuma, lasciare sempre almeno 1 ml di media nella punta della pipetta durante questa collezione HPC / fase di lavaggio.
      3. Far passare le cellule attraverso il filtro 40 micron in un tubo. Aggiungere 8 ml di PBS alla stessa piastra e controllare al microscopio se tutti HPC noiri raccolti. Ripetere la fase di lavaggio / collezione con PBS e (se necessario) con il lavaggio più forte. Scolare le cellule in provetta già contenente le cellule dallo stesso piatto.
      4. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C.
      5. Preparare una master mix di 3 ml (per piastra seminata il giorno 5), dei mezzi di comunicazione OP9 con 5 ng / ml Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7.
      6. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in mezzi OP9 con Flt-3L + IL-7 Master Mix (3 ml per ogni piatto 10 centimetri trasformati). Trasferire le cellule raccolte da ogni piatto in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con cellule OP9.
         1. Al fine di guidare le cellule verso monociti, cellule B o lignaggi eritroidi, seminare le cellule raccolte sulle cellule OP9. Per ricavare cellule T, seminare le cellule su monostrati di cellule OP9-DL1.
      7. Posizionare le piastre da 6 pozzetti in incubatrice.
   6. Giorno 10: Cambio media
      1. Preparare una provetta da centrifuga da 15 ml per ogni distinto mesc clone-alimentatore tipo di cellula combinazionizione in co-coltura.
      2. Preparare una master mix di mezzi OP9 con 5 ng / ml di Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7. Preparare 3 ml per ogni bene.
      3. Raccogliere delicatamente i media da ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti che combina supporti da più pozzetti contenenti la stessa combinazione di tipo cellulare ESC clone-alimentatore.
      4. Aggiungere 2 ml di master mix multimediale OP9 (vedi 3.6.2) in ogni pozzetto.
      5. Centrifugare la media raccolti a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet (molto piccola se visibile) in 1 ml di OP9 master mix dei media (vedi 3.6.2) per pozzetto originariamente raccolti nella fase 3.6.3.
      6. Distribuire 1 ml di cellule di nuovo in ogni pozzetto da cui il supporto è stato originariamente raccolti portando il volume in ogni pozzetto a 3 ml. Riportare i piatti per l'incubatrice.
   7. Giorno 12: Nessun passaggio tripsina
      NOTA: Preparare in anticipo un numero adeguato di piatti 6 pozzetti con cellule OP9 o OP9-DL1 in modo che essi saranno in modo ottimale confluenti in tempo per questo step. Giorno 12 è ideale per la citometria di flusso analisi di sviluppo eritroide, monociti e cellule T early stage.
      1. Preparare una master mix (3 ml per ogni bene che continuerà in co-coltura) dei media OP9 con 5 ng / ml di Flt-3L e 1 ng / ml di IL-7.
      2. Preparare 50 ml provette da centrifuga con 40 micron filtri (uno per ogni ESC clone-alimentatore tipo di cellula combinazione in co-coltura).
      3. Pipettare vigorosamente i media esistenti in ciascun pozzetto di disaggregare tutte le cellule (tra cui il monostrato) nel pozzo. Continuare con pipettaggio forte fino a raggiungere uno stato simile ad una sospensione di cellule singole.
      4. Passare le cellule raccolte attraverso il filtro nel tubo. Aggiungere 3 ml di PBS in ogni pozzetto per lavare e raccogliere tutte le cellule rimanenti. Passare cellule attraverso lo stesso filtro. Combinare le cellule da più pozzetti contenenti la stessa combinazione di tipo cellulare ESC clone-alimentatore.
      5. Eliminare il filtro cella utilizzata e rimuovere un equivalente aliquota da un pozzetto (~ 6 ml) per ogni desideratocitometria a flusso (o altro) analisi da effettuare in quel giorno. Conservare queste aliquote sul ghiaccio prima dell'uso.
      6. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet dai tubi centrifuga da 50 ml a 3 ml di Master Mix per pozzetto di essere ri-seminato. Aggiungere 3 ml per pozzetto di ciascuna sospensione cellulare al tipo di cellula alimentatore appropriato e mettere i piatti in incubatrice.
   8. Giorno 14: Cambio media
      1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.6.
   9. Giorno 16: Nessun passaggio tripsina
      NOTA: Preparare in anticipo piatti da 6 pozzetti di cellule OP9 o OP9-DL1 confluenti in modo ottimale per questo passo.
      NOTA: Giorno 16 è ideale per citometria a flusso di analisi dei linfociti B e le cellule T fase centrale.
      1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.7.
   10. Giorno 18: Cambio media
       1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.6.
   11. Giorno 20: Nessun passaggio tripsina
       NOTA: Giorno 20 is ideale per citometria a flusso analisi di metà a fine fase di sviluppo le cellule T.
       1. Seguire la procedura descritta nella sezione 3.7. Se lo si desidera, effettuare differenziazione delle cellule passato giorno 20 cambiamento alternata media e non tripsina passaggi ogni due giorni, con monitoraggio giornaliero del tasso di espansione dei linfociti.

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Risultati

Quando coltivate su MEF, in presenza di LIF, mESCs possono essere mantenuti in uno stato indifferenziato. In condizioni ideali, appaiono come colonie compatti di cellule circondate da un alone lucido in microscopia a contrasto di fase (Figura 1). Tali colture devono essere monitorati quotidianamente. In base alla confluenza delle cellule, i media possono essere cambiati o cellule possono essere divise. Limitrofe colonie Mesc non dovrebbero venire al punto di contatto uno con l'altro. Un normale, san...

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Discussione

Il sistema OP9-DL1 co-coltura è stata utilizzata per studiare il ruolo dei vari prodotti genici durante lo sviluppo di tipi di cellule del sangue da cellule staminali. ^8,12,13 Ha anche dimostrato un modello efficace per studiare la funzione del gene DNA normativo durante il differenziamento cellulare. ^9,14 Usando questo approccio come alternativa ai modelli interi mouse possono produrre un notevole risparmio di tempo e costi di esperimenti che affrontano molte questioni fondamentali in ematopoiesi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab