גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

Summary

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Abstract

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Introduction

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

.1 הכנת תרבות מדיה, ציטוקינים וצלחות gelatinized

1. הכן תקשורת בתאי גזע עובריים באמצעות השינוי של Dulbecco של בינוני של הנשר (DMEM) עם גלוקוז גבוה ופירובט נתרן. להוסיף ESC 20% מוסמכים בסרום שור העוברי (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, 1% HEPES הצפת, 1% שאינם חיוניות חומצות אמינו, 0.1% גנטמיצין (50 מ"ג / מ"ל) ו0.1% ( 55 מיקרומטר) β-mercaptoethanol. לעקר תקשורת בתאי גזע עובריים על ידי סינון.
2. הכן תקשורת OP9 על ידי הפיכת 1 ליטר של אלפא בינוני מינימום הכרחי (α-MEM) מאבקה על פי הוראות היצרן. הוסף 20% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. הפוך לערבב. לעקר על ידי סינון לשני 500 aliquots מ"ל.
   הערה: השימוש במדיה עשויים מאבקה מומלצת וצפוי להניב תחזוקת תא OP9 משופרת ובתוצאות בידול מבחנה. גישה זו הפכה ההליך הרגיל שלנו. עם זאת, אנחנו גם לציין that יש לנו בזמנים המשמשים נוזל שהוכן מראש, α-ממ עם הצלחה מספקת.
3. הכן הקפאת תקשורת על ידי הוספת 10% דימתיל sulfoxide (DMSO) ל90% FBS. מערבולת בעדינות ולעקר על ידי סינון. חנות ב 4 ° C..
4. הכן 2,000x יגנד Flt-3 (10 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי המסת Flt-3 יגנד רקומביננטי האנושי (Flt-3L) בתקשורת OP9 מלאה ל10 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. עקוב אחר ההמלצות של הספק בנוגע ליציבות ואחסון.
   הערה: היציבות של Flt-3L היא קצרה (1 חודש על 4 מעלות צלזיוס או 3 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס).
5. הכן 1,000x IL-7 (1 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי שימוש בתקשורת OP9 מלאה. Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. עקבו אחר המלצותיו של הספק על יציבות ואחסון (IL-7 הוא יציב עד 12 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס).
6. הכן 1,000x לוקמיה מעכב פקטור (LIF) (10 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי דילול 1:10 10 ⁷ יחידות של i LIFn תקשורת בתאי גזע עובריים. aliquot החנות ב 4 ° C.. הקפד לשים לב לתאריך התפוגה הניתן על ידי היצרן בבקבוקוני aliquot.
   הערה: המוצר הוא יציב בצורה 18 חודשים לפחות מרוכזים או מדוללים ממועד הייצור.
7. הכן 6 גם צלחות gelatinized ידי להוסיף 1.5 פתרון ג'לטין מ"ל של 0.1% לבאר כל צלחת 6 היטב. משאיר את הכלים בשכונה סטרילי בטמפרטורת חדר עם מכסים על, המאפשר לפחות 30 דקות לציפוי. המנות גם ניתן להשאיר בלילה חממת humidified. הסר את כל פתרון ג'לטין שאריות ממש לפני זריעת תאים. אל תתנו פתרון ג'לטין להתייבש לחלוטין בבאר.

2 הכנה ותחזוקה של תאים מזין ותאי עכבר גזע עובריים (המסקלין)

הערה: דגירה כל התאים ב37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO _2.

1. הפשרת Fibroblasts העכבר עוברי (MEF)
   1. Quick-להפשיר בקבוקון קפוא (~ 5 x 10 ⁶ תאים / בקבוקון) של MEFs mitomycin (או בדרך אחרת נעצר mitotically שטופל C) ולהעביר אותם לצינור 15 מ"ל.
   2. הוסף 8 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים לתאים המופשרים, בצורה טיפה חכמה כדי לדלל בהדרגה את DMSO ממדיום ההקפאה.
   3. תאי צנטריפוגה ב400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים.
   4. הכן צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם 33 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים מראש חימם. מוסיף את 3 מ"ל של MEFs המושעה להביא את הנפח הסופי 36 מ"ל.
   5. הפץ 3 מ"ל של MEFs המושעה לכל טוב משני לוחות gelatinized 6 היטב. מקם את הצלחות לאינקובטור במשך לפחות שש שעות על מנת לאפשר לתאים לצרף ונפרשו לפני זריעת mESCs עליהם. שכבות מזין נעצרו mitotically אלה עשויות להיות שמישים במשך כמה ימים לאחר זריעה ראשונית, אם אמצעי התקשורת שלהם משתנה כל 2-3 ימים.
      הערה: יכול לשמש גם MEFs נעצר טרי.
   6. mESCs זריעה
      1. Quick-להפשיר בקבוקון עם שיבוט המסקלין קפוא באמבט המים 37 מעלות צלזיוס ולהכין תאים כפי שמתואר ב2.1.1-2.1.3.
         הערה: אנו להקפיא 2 בקבוקונים של המסקלין מבאר ומחוברות של צלחת 6 היטב.
      2. הסר את המדיה מהיטב אחד (מחיר לשיבוט המסקלין) של הצלחת 6 היטב עם monolayers MEF נעצר (מוכן בשלב 2.1.5) וזרעי 3 מ"ל של mESCs על גבי monolayer MEF. הוסף 3 μl של 1,000x LIF (מ"ל / 10 ng). חזור מנות לתוך החממה.
   7. תחזוקת תאי גזע עובריים והמעבר טריפסין תיווך
      הערה: המדיה שינוי יומי, או פיצול המבוסס על מפגש של המסקלין. בצורה אופטימלית, קציר ופיצול / מחדש צלחת תאים בכל יום אחר.
      1. הסר את המדיה בתאי גזע עובריים ולשטוף mESCs עם 2 מ"ל של PBS. הסר PBS. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.25% ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות.
      2. איסוף תאי trypsinized ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. במרץ pipet ההשעיה התא לפרק את הגושים של mESCs. הוסף 2 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים מלאה להשעית התא על מנת לנטרל את טריפסין.
      3. תאי ספין בx גרם 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ"ל תקשורת בתאי גזע עובריים.
      4. הסר את המדיה מ6 צלחות המכילות גם הכין monolayers MEF נעצר. להוסיף את הכמות המתאימה של ההשעיה התא (המבוססת על יחס הפיצול הרצוי) ב 3 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים לכל טוב שזרע. הוסף 3 μl של LIF 1,000x. מחוברות המסקלין לפצל גם 1: 6 תהיה מוכן למעבר ב2 ימים.
   8. OP9 / תחזוקת תא OP9-DL1
      1. להפשיר בקבוקון של תאי OP9 (בצע את השלבים 2.1.1-2.1.3 באמצעות מדיה OP9)
      2. הוסף מדיה OP9 7 מ"ל לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר. מוסיף את 3 מ"ל של תאי resuspended באופן טיפה חכמה, הפצת תאים בכל הצלחת. מניחים את תאי לילה בחממה.
      3. בדוק את נקודת המפגש של תאי OP9 למחרת. אם המנה מכילה הרבה תאים צפים מתים, רמוve התקשורת ולהוסיף 10 מ"ל של תקשורת OP9 הטרי. להחזיר את הצלחת לחממה אם מפגש כמעט מלא לא נצפה. פיצול (באמצעות טריפסין) 1: 4 monolayer OP9 המחוברות הקרוב.
         הערה: צלחות צריכה להגיע באותה רמת מפגש שוב בכ -2 ימים. יש להיזהר שלא לתת לתאי OP9 להיות מעל ומחוברות.
      4. להקפיא את הקטעים המוקדמים של תאי OP9 כמניות הרחבה.
         הערה: אנו להקפיא 2 בקבוקונים של תאי OP9 מאחד ליד מחוברות 10 צלחת סנטימטר. כל בקבוקון של מניית הרחבה יכול להיות מופץ נוסף כדי ליצור מניות עבודה שמאוחר יותר השתמשו בניסויי שיתוף תרבות המסקלין. שמור את כל מניות OP9 קפואות בחנקן נוזלי ולא ב-80 ° C המקפיא, מאז טמפרטורות משתנים באופן שלילי יכולות להשפיע על האיכות של קופא.

   .3 נוהל משותף תרבות OP9-DL1

   1. הכנות משותפת התרבות
      1. כשבוע לפני תחילת שיתוף תרבות, להפשיר MEFs, mESCs ואבני תא OP9 עובדיםcks. מאחר ותאי OP9-DL1 אין צורך עד שיום התרבות משותפת 8, להפשיר את תאי OP9-DL1 במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר תחילת שיתוף התרבות. לשמור או להקפיא את כל התאים בהתאם לצורך.
      2. לקבוע את המספר הראשוני של 10 צלחות סנטימטר עם monolayers תא OP9 מוכן להגיע 80 מפגש% על שיתוף תרבות יום 0 מבוססים על הסולם של הניסוי (למשל, מספר השיבוטים המסקלין להיות מובחן ומספר נקודות זמן שיתוף תרבות ל להיות מנותח). כדי להתכונן לשיתוף תרבות, לפצל ליד צלחת ומחוברות של OP9 תאים בין 1: 4 ו 1: 6 יומיים לפני כאשר יהיה צורך monolayers.
         הערה: אחת יצטרך צלחת אחת לפחות לשיבוט ESC. בדרך כלל, שיבוט ESC יחיד זורעים על צלחת אחת (כמפורט להלן) ביום 0 אמורים להניב מספיק תאי זרע שש צלחות במעבר יום 5. כל צלחת יום 5 תאפשר נקודת זמן ניתוח שלאחר מכן אחד.
      3. מאז monolayers OP9 יהיה צורך ללא הרף למעבר שיתוף התרבות, דואג לתמיד maintaבמספר מספק של צלחות תרבות OP9 נוספות במקביל לתרבות המשותפת.
   2. יום 0: ייזום של תרבות המשותפת
      1. לאסוף המסקלין כמו ב2.3.1-2.3.4. ספירת התאים.
      2. לכל שיבוט המסקלין להכין 5 x 10 ⁴ המסקלין ב10 מ"ל של תקשורת OP9 לכל צלחת.
         הערה: למרות שאנו לא השתמשנו בו, נציין, כי מדיום אלטרנטיבי בהיקף של α-MEM, 10% FBS, ו5 x 10 ^-5 M β-mercaptoethanol דווח גם לשימוש בשיתוף תרבויות בידול ^10.
      3. הסר את המדיה ישנה מOP9 מנות ולהוסיף 10 מ"ל של ההשעיה המסקלין את הכלים לטפל כדי להפיץ את התאים באופן שווה בכל הצלחת. מניחים את הכלים ב37 מעלות צלזיוס החממה.
   3. יום 3: שינוי מדיה
      1. הסר מנות מהחממה ולבחון תחת מיקרוסקופ. מושבות צריכה להתחיל לאבד זוהר ונראה שטוח.
      2. הסר את המדיה ממנות ובעדינות להוסיף 10 מ"ל של OP9 הטריתקשורת.
      3. להחזיר את מנות שיתוף התרבות לחממה. מבחינה ויזואלית לעקוב אחר הקמת מושבה כמו המזודרם ביום ליידע את העיתוי של הכנת monolayer מזין OP9 למעבר הבא (יום 5), שלא צריכה להתבצע עד ~ 80-90% מהמושבות חזותי להציג מורפולוגיה כמו המזודרם-. דחייה המרבית של צעד העברת תא יום 5 היא 2 ימים.
   4. יום 5: מעבר בתיווך טריפסין עם טרום ציפוי.
      הערה: הכן מראש מספר מספיק של 10 מנות סנטימטר עם תאי OP9 בצורה אופטימלית ומחוברות. המשך בביצוע השלבים הבאים רק אם שיתוף התרבויות חזותית להציג את התכונות מתוארות בשלב 3.3.3 (ראה תוצאות גם נציג).
      1. הסר את המדיה ממנות התרבות המשותפת. הוסף 4 מ"ל PBS לשטוף. לערבל את PBS ולהסיר. הוסף 4 מ"ל של 0.25 טריפסין% ומקום הכלים בחממה ל~ 5 דקות.
      2. לשבש את השכבה של תאי trypsinized ידי pipetting הנמרץ, נזהר שלא להכניס בועות אוויר חריגות, עד שהשעיה הומוגנית, בעיקר תא בודד מושגת.
      3. הוסף 4 מ"ל של תקשורת OP9 המלאה ומערבבים על ידי pipetting. העברת תאים לתוך צלחת חדשה, ריקה 10 סנטימטר ומקום בחממה במשך 30 דקות, כדי לאפשר לתאי OP9 לדבוק בצלחת. זה צעד "טרום ציפוי" מפחית את מספר התאים OP9 הועברו לצעד הבא של התרבות המשותפת.
      4. הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם מסננות תא 40 מיקרומטר.
      5. איסוף תאים שאינם חסיד מהצלחת מצופה מראש ולהעביר אותם דרך מסננת התא לתוך הצינור. שטוף את הצלחת בעדינות עם 6 מ"ל של PBS ולהעביר אותו דרך אותו המסננת, ומשאיר את תאי OP9 המצורפים מאחורי.
      6. תאי צנטריפוגה בדקות 5 גרם 400 x ב 4 ° C.. הסר supernatant ו resuspend תאי pelleted ב3 מ"ל של תקשורת OP9 המלאה. ספירת התאים.
      7. הסר את המדיה מ10 צלחות סנטימטר עם תאי OP9 בצורה אופטימלית ומחוברות.
      8. עבור כל נקודת זמן ניתוח, זרע 5 x 10 ⁵ תאים במונו OP9שכבה ב10 נפח סופי מ"ל.
      9. הוסף 5 ng / Flt-3L רקומביננטי האנושי מ"ל ולמקם את הכלים בחממה.
   5. אוסף נייד אבות היווצרות דם (HPC): יום 8
      הערה: הכן מראש מספר מספיק של 6 צלחות גם עם monolayers OP9 או OP9-DL1 תא, כך שהם יהיו ~ 80% ומחוברות בזמן לצעד זה.
      1. הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם 40 מיקרומטר מסננות.
      2. הסר את המנות מהחממה ולבחון תחת מיקרוסקופ. אשכולות מבריקים של HPCs צריכים להיות מחוברים באופן רופף לmonolayer OP9. לאסוף כמה שיותר תאים אלה ככל האפשר על ידי שטיפה (אך לא יתר על מידת שיבוש) monolayer OP9 עם טפטפת והמדיה הקיימת בצלחת. כדי למנוע הקצפה, תמיד להשאיר לפחות 1 מ"ל של התקשורת בקצה pipet במהלך איסוף HPC / צעד זה כביסה.
      3. להעביר את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור. הוסף 8 מ"ל PBS לאותה הצלחת ולבדוק תחת מיקרוסקופ אם כל HPCsמחדש שנאסף. חזור על שלב כביסה / אוסף עם PBS ו( במידת צורך) עם כביסה תקיפה יותר. מסננים את התאים לתוך הצינור כבר מכיל את התאים מאותה הצלחת.
      4. תאי צנטריפוגה ב g x 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
      5. הכן תערובת הורים של 3 מ"ל (לכל צלחת נזרעה ביום 5) של תקשורת OP9 עם 5 ng / ml Flt-3L ו1 ננוגרם / מ"ל ​​IL-7.
      6. הסר supernatant וגלול גלולים בתקשורת OP9 עם Flt-3L תמהיל הורים + IL-7 (3 מ"ל לכל מנה 10 סנטימטר מעובד). להעביר את התאים שנאספו מכל צלחת ולאחת מצלחת 6 היטב עם תאי OP9.
         1. על מנת לנהוג תאים כלפי monocytic, תא B או שושלות erythroid, זרע התאים שנאספו על תאי OP9. לגזור תאי T, זרע התאים על גבי monolayers תא OP9-DL1.
      7. מניחים את 6 גם הצלחות לאינקובטור.
   6. יום 10: שינוי מדיה
      1. הכן צינור צנטריפוגות 15 מ"ל לכל קומבינה המסקלין ברורה שיבוט-מזין סוג התאtion בשיתוף התרבות.
      2. הכן תערובת הורים של תקשורת OP9 עם 5 / מ"ל ​​ng של Flt-3L ו1 / מ"ל ​​ng של IL-7. הכן 3 מ"ל לכל טוב.
      3. בעדינות לאסוף מדיה מכל טוב של הצלחת 6 היטב שילוב מדיה מבארות מרובות המכילות את אותו שילוב סוג תא שיבוט-מזין ESC.
      4. הוסף 2 מ"ל של תערובת אב תקשורת OP9 (ראה 3.6.2) לתוך כל אחד.
      5. צנטריפוגה התקשורת שנאסף בx גרם 400 למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו resuspend כל גלולה (קטנה מאוד, אם גלוי) ב 1 מ"ל של תערובת אב תקשורת OP9 (ראה 3.6.2) לכל טוב שנאסף במקור בשלב 3.6.3.
      6. הפץ 1 מ"ל של תאים בחזרה לכל באר שממנה מדיה נאספה במקור מביאה את עוצמת הקול בכל טוב ל3 מ"ל. להחזיר את המנות לחממה.
   7. יום 12: אין מעבר טריפסין
      הערה: הכן מראש מספר מספק של מנות 6 גם עם תאי OP9 או OP9-DL1, כך שהם יהיו מחוברים בצורה אופטימלית בזמן לזה זהTEP. יום 12 הוא אידיאלי עבור cytometry זרימת ניתוחים של erythroid פיתוח, monocytic, ותאי T שלב מוקדם.
      1. להכין תערובת שני (3 מ"ל לכל טוב שימשיך בשיתוף התרבות) של תקשורת OP9 עם 5 / מ"ל ​​ng של Flt-3L ו1 / מ"ל ​​ng של IL-7.
      2. הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם 40 מיקרומטר מסננות (אחד לכל צירוף סוג תא שיבוט-מזין ESC בשיתוף התרבות).
      3. במרץ פיפטה המדיה הקיימת בכל אחד גם לdisaggregate כל התאים (כולל monolayer) בבאר. המשך עם pipetting הכוחני עד מדינה שמזכירה השעיה תא בודדת מושגת.
      4. להעביר את התאים שנאספו דרך המסננת לתוך הצינור. הוסף 3 מ"ל של PBS לתוך זה גם לשטוף ולאסוף את כל התאים הנותרים. עובר תאים דרך אותה המסננת. שלב את התאים מבארות מרובות המכילות את אותו שילוב סוג תא שיבוט-מזין ESC.
      5. מחק את מסננת התא משמשת ולהסיר שווה ערך aliquot לטוב אחד (~ 6 מ"ל) לכל רצויcytometry זרימה (או אחרים) מנתחת להתבצע באותו יום. אחסן aliquots אלה על קרח לפני השימוש.
      6. תאי צנטריפוגה ב g x 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant. Resuspend גלולה מ50 צינורות מ"ל צנטריפוגות ב3 מ"ל של תערובת אב לכל גם להיות מחדש זרע. הוסף 3 מ"ל לכל טוב של כל השעיה תא לסוג תא המזין המתאים ולמקם את הכלים בחממה.
   8. יום 14: שינוי מדיה
      1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.6.
   9. יום 16: אין מעבר טריפסין
      הערה: הכן מראש מנות 6 גם של תאי OP9 או OP9-DL1 בצורה אופטימלית ומחוברות לצעד זה.
      הערה: יום 16 הוא אידיאלי עבור cytometry זרימת הניתוחים של לימפוציטים מסוג B ותאי T שלב אמצע.
      1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.7.
   10. יום 18: שינוי מדיה
       1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.6.
   11. יום 20: אין מעבר טריפסין
       הערה: יום 20 iאידיאלי עבור cytometry זרימת ניתוחים של האמצע עד השלב מאוחר בפיתוח תאי T.
       1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.7. אם ארצה בכך, לשאת הבחנה תאי תקשורת לשנות לסירוגין עבר יום 20 ולא טריפסין מעברים בכל יומיים, עם ניטור יומיומי של קצב התפשטות הלימפוציטים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כאשר גדל על MEFs בנוכחות LIF, יכול להישמר mESCs במדינה שלא עברה התמיינות. בתנאים אידיאליים, הם מופיעים כמושבות קומפקטיות של תאים מוקפים בהילה נוצצת במיקרוסקופ לעומת שלב (איור 1). תרבויות אלה חייבים להיות במעקב יומי. בהתאם לנקודת המפגש של התאים, ניתן לשנות תקשורת או ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מערכת שיתוף תרבות OP9-DL1 נוצלה כדי ללמוד את התפקיד של מוצרי גנים שונים במהלך הפיתוח של סוגי תאי דם מתאי גזע. ^8,12,13 זה הוכח גם מודל יעיל כדי ללמוד את הפונקציה של DNA הרגולציה הגן במהלך התמיינות תאים. ^9,14 שימוש בגישה זו כחלופה למודלים של עכברים כל יכול להניב חיסכון ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab