Вывод Т-клеток<em&gt; In Vitro</em&gt; От эмбриональных стволовых клеток мыши

Резюме

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Аннотация

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Введение

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1 приготовления питательных сред, цитокинов и клейстеризованный Плиты

1. Подготовьте ES клеток носителя с помощью Модификация Дульбеко из Орла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и пирувата натрия. Добавить 20% ESC квалифицированных эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина, 1% HEPES буфера, 1% заменимых аминокислот, 0,1% гентамицин (50 мг / мл) и 0,1% ( 55 мкМ) β-меркаптоэтанола. Стерилизовать ES клеток СМИ фильтрацией.
2. Подготовьте OP9 СМИ, сделав 1 л Альфа минимальной основной среде (α-MEM) из порошка в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина. Обратить перемешать. Стерилизовать фильтрацией на две 500 мл аликвоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: использование средств массовой информации, изготовленных из порошка рекомендуется и, вероятно, обеспечить улучшенное обслуживание OP9 клеток и в пробирке результатов дифференциации. Этот подход стал нашим стандартная процедура. Тем не менее, мы также отмечаем, тхат мы порой используется предварительно сделанные жидкие α-MEM с адекватной успеха.
3. Подготовка замораживания носитель путем добавления 10% диметилсульфоксид (ДМСО) до 90% FBS. Вихревой нежно и стерилизовать фильтрацией. Хранить при 4 ° С.
4. Подготовка 2,000x Flt-3 лиганд (10 мкг / мл), раствор человеческого рекомбинантного Flt-3 лиганд (Flt-3 л) в полном OP9 сред до 10 мкг / мл. Алиготе в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° C. Следуйте рекомендациям поставщика относительно стабильности и хранения.
   Примечание: Стабильность FLT-3L короткий (1 месяц при 4 ° С или 3 месяца при температуре -80 ° С).
5. Подготовка 1,000x IL-7 (1 мкг / мл) с помощью полного OP9 носитель. Алиготе в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° C. Следуйте рекомендациям поставщика о стабильности и хранения (IL-7 является стабильным в течение 12 месяцев при -80 ° С).
6. Подготовьте 1,000x фактор ингибирования лейкоза (LIF) (10 мкг / мл) на разведении 10 ⁷ единиц LIF I 1:10н ES клеток СМИ. Магазин аликвоту при 4 ° С. Обязательно обратите внимание на дату окончания срока действия, предоставляемая производителем на аликвотные флаконах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт устойчив в концентрированных или разбавленном виде, по крайней мере 18 месяцев с даты изготовления.
7. Подготовка желатинизированный пластины 6-хорошо добавить 1,5 мл 0,1% раствора желатина в каждую лунку 6-луночного планшета. Оставьте посуду в стерильных капот при комнатной температуре с крышками на, что позволяет по меньшей мере 30 мин для покрытия. Блюда могут быть также оставили в увлажненном инкубаторе в течение ночи. Удалите остатки раствора желатина прямо перед посева клеток. Не позволяйте раствор желатина полностью высохнуть в скважине.

2 Подготовка и обслуживание фидерных клеток и эмбриональных стволовых клеток мыши (Mesc)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержите все клетки в увлажненной 37 ° C инкубаторе с 5% CO _2.

1. Размораживание эмбриональных фибробластов мыши (MEF)
   1. Быстрый таять замороженный флакон (~ 5 х 10 ⁶ клетки / флакон) из митомицином C обращению (или иным митотически арестован) MEFs и перенести их на 15 мл трубки.
   2. Добавить 8 мл ЭС клеток СМИ к талых клеток, в каплям моды постепенно разбавить ДМСО из морозильного среды.
   3. Центрифуга клетки при 400 х г при 4 ° С в течение 5 мин. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл ЭС клеток СМИ.
   4. Приготовьте 50 мл центрифужную пробирку с 33 мл подогретого клеток СМИ ES. Добавьте 3 мл ресуспендированных MEFs довести до конечного объема 36 мл.
   5. Распределить 3 мл ресуспендированных MEFs в каждую лунку двух желатинизированный 6-луночных планшетах. Место пластин в инкубаторе в течение не менее шести часов, чтобы позволить клеткам прикрепляться и распространено до посева mESCs на них. Эти митотически арестованные фидерные слои можно будет использовать в течение нескольких дней после первоначального посева, если их СМИ меняется каждые 2-3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только что арестованные MEFs также может быть использован.
   6. Посев mESCs
      1. Быстрый таять пузырек с замороженной Mesc клона в C водяной бане 37 ° и подготовить клетки, как описано в 2.1.1-2.1.3.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Мы заморозить 2 флаконов мЭСК от сливной лунку 6-луночного планшета.
      2. Удалить материал из одной скважины (за MESC клона) на 6-луночный планшет с задержанных MEF монослоев (полученного на стадии 2.1.5) и семян в 3 мл mESCs на верхней части MEF монослое. Добавить 3 мкл 1,000x LIF (10 нг / мл). Возвращение блюда в инкубатор.
   7. Обслуживание сотового ES и трипсин опосредованной проход
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение СМИ в день, или раскол на основе слияния мЭСК. Оптимально, урожай и сплит / повторно пластины клетки через день.
      1. Удалить среда клеток ES и мыть mESCs с 2 мл PBS. Удалить PBS. Добавить 1 мл 0,25% трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 3-5 мин.
      2. Соберите трипсинизируют клетки и перенести их в 15 мл центрифужную пробирку. Энергично пипетки клеточной суспензии, чтобы разбить комки мЭСК. Добавить 2 мл полной клеток СМИ ES к клеточной суспензии для нейтрализации трипсина.
      3. Побочные клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл ЭС клеток средах.
      4. Удалить носитель из 6-луночные планшеты, содержащие приготовленные монослои задержанных MEF. Добавить соответствующее количество клеточной суспензии (в расчете на желаемом соотношении Split) в 3 мл ЭС клеток средах в каждую лунку быть заполнена. Добавить 3 мкл 1,000x интегратором. Конфлюэнтную Mesc хорошо разделить 1: 6 будет готов для прохода в 2 дня.
   8. OP9 / обслуживание OP9-DL1 клетки
      1. Оттепель флакон OP9 клеток (следуйте инструкциям 2.1.1-2.1.3 помощью OP9 СМИ)
      2. Добавить 7 мл OP9 СМИ до 10 см блюдо культуры ткани. Добавьте 3 мл ресуспендировали клеток в каплям образом, распределение клеток по всей пластине. Поместите клеток в течение ночи в инкубаторе.
      3. Проверьте впадении OP9 клеток на следующий день. Если блюдо содержит много мертвых плавающих клеток, Ремове СМИ и добавляют 10 мл свежего OP9 СМИ. Вернуться блюдо в инкубатор, если почти полный слияние не наблюдается. Сплит (используя трипсин) 1: 4 рядом сливающийся OP9 монослоя.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны достичь такой же уровень слияния снова приблизительно 2 дней. Старайтесь не позволить OP9 клетки становятся более-сливной.
      4. Замораживание ранние отрывки из OP9 клеток как акции расширения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Мы заморозить 2 флаконов OP9 клеток от одного возле сливной 10 см блюдо. Каждый флакон расширения складе может быть дополнительно распространяется создавать рабочие запасы, которые позднее используются в Mesc сокультуры экспериментов. Храните все OP9 запасы замороженных в жидком азоте, а не в -80 ° C морозильник, так как колебания температуры могут негативно повлиять на качество замерзает.

   3 OP9-DL1 Порядок Co-культура

   1. Сотрудничество культуры препараты
      1. Примерно за неделю до начала со-культуры, оттепель MEFs, mESCs и OP9 клеток рабочую STOCKS. С OP9-DL1 клетки не нужны, пока сокультуры день 8, оттепель клетки OP9-dL1 в течение первых трех дней после сокультуры инициации. Поддерживать или заморозить все клетки по мере необходимости.
      2. Определите начальное количество 10 см пластинах с OP9 монослоев клеток, подготовленных для достижения 80% слияния на сокультуре день 0 исходя из шкалы эксперимента (например, количество миллисекунд клонов должны быть дифференцированы и количество со-культуры временных точках, чтобы быть проанализированы). Для подготовки к совместной культуры, разделить возле сливной блюдо OP9 клеток между 1: 4 и 1: 6 на два дня раньше, когда монослои будут необходимы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Один понадобится как минимум одну пластинку за ESC клона. Как правило, один клон, ESC, высевали на одной пластине (как описано ниже) на день 0 должно дать достаточное количество клеток, чтобы отобрать шесть пластин в день 5 прохода. Каждый день 5 пластина позволит один последующий момент времени анализ.
      3. С OP9 монослоя будет постоянно необходимы для сокультуры прохождения, заботиться, чтобы всегда maintaв достаточном количестве дополнительных OP9 пластин культуры параллельно с совместной культуре.
   2. День 0: Инициирование совместного культивирования
      1. Соберите Mesc как в 2.3.1-2.3.4. Граф клеток.
      2. Для каждого Mesc клона подготовить 5 х 10 ⁴ миллисекунд в 10 мл OP9 СМИ за тарелку.
         Примечание: Несмотря на то, что мы не использовали его, следует отметить, что альтернатива среду, состоящую из α-MEM, 10% FBS, и 5 х 10 ^-5 М β-меркаптоэтанола Сообщалось также, для использования в дифференциации совместных культурах ^10.
      3. Удалить старые СМИ от OP9 блюд и добавьте 10 мл мЭСК подвески к блюдам, заботящихся распространять клетки равномерно по всей пластине. Поместите посуду в 37 ° С инкубатор.
   3. День 3: изменение Медиа
      1. Удалить блюда из инкубатора и наблюдать под микроскопом. Колонии должны начать терять блеск и выглядят плоские.
      2. Удалить носитель из блюд и осторожно добавляют 10 мл свежего OP9СМИ.
      3. Возврат к со-чашки для культивирования в инкубатор. Визуально контролировать образование колоний мезодермы, как ежедневно, чтобы сообщить об этом сроки OP9 подготовки подачи монослоя для следующего прохода (день 5), который не должен быть проведен до ~ 80-90% колоний визуального отображения мезодермы-подобную морфологию. Максимальная отсрочка стадии переноса клеток день 5 2 дня.
   4. День 5: Трипсин опосредованной проход с предварительной металлизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 10 см чашки с оптимально сливающихся OP9 клеток. Продолжайте следующих шагах, только если со-культуры визуального отображения функций, описанных в шаге 3.3.3 (см также Представитель Результаты).
      1. Удалить носители из со-чашки для культивирования. Добавить 4 мл PBS мыть. Вихревой PBS и удалить. Добавить 4 мл 0,25% трипсина и поместите посуду в инкубаторе в течение ~ 5 мин.
      2. Лишить слой трипсинизируют клеток энергичным пипетки, заботясь не вводить чрезмерные пузырьки воздуха, покаоднородным, в основном суспензию отдельных клеток достигается.
      3. Добавить 4 мл полных OP9 СМИ и перемешать с помощью пипетки. Передача клеток в новый пустой 10 см блюдо и поставьте в инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить OP9 клетки придерживаться блюдо. Это "предварительно покрытие" шаг уменьшает количество клеток OP9 переданных к следующему шагу со-культуры.
      4. Подготовьте пробирками 50 мл с фильтров 40 мкм клеток.
      5. Сбор неприкрепленных клеток из предварительно покрытием блюдо и передавать их через ячейки сетчатого фильтра в трубке. Вымойте блюдо аккуратно с 6 мл PBS и передать его через тот же сито, оставив прилагаемые OP9 клетки сзади.
      6. Центрифуга клеток при 400 х г 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки осаждали в 3 мл полной OP9 массовой информации. Граф клеток.
      7. Выньте материал из 10 см пластинах с оптимально сливающихся OP9 клеток.
      8. Для каждого анализа временной точке, семян 5 х 10 ⁵ клеток на OP9 моноСлой в 10 мл конечного объема.
      9. Добавить 5 нг / мл человеческого рекомбинантного FLT-3L и поместите посуду в инкубаторе.
   5. День 8: гемопоэтических клеток-предшественников (HPC) коллекция
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 6-луночные планшеты с OP9 или OP9-DL1 монослоев клеток так, что они будут ~ 80% сливной времени для этого шага.
      1. Подготовьте пробирками 50 мл с 40 мкм фильтров.
      2. Снимите посуду из инкубатора и наблюдать под микроскопом. Блестящие кластеры HPCS следует косвенное отношение к OP9 монослоя. Собрать как многие из этих клеток, как это возможно путем промывки (но не чрезмерно нарушая) монослой OP9 с пипеткой и существующий СМИ на блюдо. Для предотвращения вспенивания, всегда оставляйте по крайней мере, 1 мл СМИ в кончике пипетки в течение этого сбора HPC / стадии промывки.
      3. Pass клеток через 40 мкм сито в трубку. Добавить 8 мл PBS в одной тарелке и проверить под микроскопом, если все HPCS мыповторно собраны. Повторите шаг стиральная / сбора с PBS и (при необходимости) с более принудительный мытья. Процедить клетки в трубу уже содержащей клетки из одной тарелки.
      4. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
      5. Подготовка основной смеси из 3 мл (на пластину высевали на 5-й день) в OP9 средах с 5 нг / мл Flt-3L и 1 нг / мл IL-7.
      6. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в OP9 сред с Flt-3L + IL-7 мастер-микс (3 мл для каждого 10 см блюдо обработанного). Передача собранных клеток от каждой пластины в одну лунку 6-луночного планшета с клетками OP9.
         1. В целях продвижения клеток к моноцитарно, В-клетки или эритроидных линий, семена собранные клеток на OP9 клеток. Для вывода Т-клеток, семян клетки на клеточных монослоев OP9-DL1.
      7. Поместите 6-луночных с в инкубаторе.
   6. День 10: изменение Медиа
      1. Приготовьте 15 мл центрифужную пробирку для каждого отдельного Mesc клон-фидерного типа клеток COMBINAния в совместной культуре.
      2. Подготовка мастер смесь OP9 средах с 5 нг / мл FLT-3 л и 1 нг / мл IL-7. Подготовьте 3 мл на каждую лунку.
      3. Аккуратно собрать средства массовой информации из каждой лунки 6-луночного планшета объединения средств массовой информации из нескольких скважин, содержащих одинаковое ESC клон-питатель типа клеток комбинацию.
      4. Добавить 2 мл OP9 СМИ мастер-микс (см 3.6.2) в каждую лунку.
      5. Центрифуга собранные средства массовой информации при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют каждый шарик (очень маленький, если видна) в 1 мл OP9 мастер СМИ смеси (см 3.6.2) на лунку первоначально собранной на этапе 3.6.3.
      6. Распределить 1 мл клеток обратно в каждую лунку, из которых носитель первоначально была собрана в результате чего объем в каждой лунке до 3 мл. Вернуться посуду в инкубатор.
   7. День 12: Нет трипсина проход
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 6-а блюда с OP9 или OP9-DL1 клетки так, что они будут оптимально конфлюэнтны времени для этого SТЭП. День 12 идеально подходит для проточной цитометрии анализа развивающихся эритроидных, моноцитов, и на ранних стадиях развития Т-клеток.
      1. Подготовка основной смеси (3 мл на каждую лунку, которая будет продолжать во взаимодействии культуры) OP9 средах с 5 нг / мл FLT-3 л и 1 нг / мл IL-7.
      2. Подготовьте пробирками 50 мл с 40 мкм фильтров (один для каждого ESC клон-фидерного типа клеток комбинации в совместной культуре).
      3. Энергично пипетки существующие средства массовой информации в каждую лунку разбить все клетки (в том числе монослоя) в скважине. Продолжить с силового пипетки до состояния, напоминающие суспензии отдельных клеток не достигается.
      4. Pass Собранные клетки через сито в трубу. Добавить 3 мл PBS в каждую лунку мыть и собрать все оставшиеся клетки. Pass клетки через то же сито. Объединить ячейки из нескольких скважин, содержащих одинаковое ESC клон-питатель типа клеток комбинацию.
      5. Утилизируйте использованный клеточный фильтр и удалить кратный, эквивалентную одной скважины (~ 6 мл) для любой желаемойпроточной цитометрии (или другой) анализирует будет осуществляться в тот день. Храните эти аликвоты на льду перед использованием.
      6. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант. Ресуспендируют гранул из центрифуги труб 50 мл в 3 мл мастер-микс на лунку для повторного посева. Добавить 3 мл на лунку каждой клеточной суспензии на соответствующем типе клеток-фидеров и поместить посуду в инкубаторе.
   8. День 14: изменение Медиа
      1. Выполните действия, указанные в разделе 3.6.
   9. День 16: Нет трипсина проход
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее 6-а блюда оптимально сливающихся OP9 или OP9-DL1 клетки для этого шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 16 идеально подходит для проточной цитометрии анализ В-лимфоцитов и средней стадии Т-клеток.
      1. Выполните действия, указанные в разделе 3.7.
   10. День 18: изменение Медиа
       1. Выполните действия, указанные в разделе 3.6.
   11. День 20: Нет трипсина проход
       ПРИМЕЧАНИЕ: День 20 яс идеально подходит для проточной цитометрии анализ середины до поздней стадии развивающегося Т-клеток.
       1. Выполните действия, указанные в разделе 3.7. При желании нести дифференциации клеткам прошедшие сутки 20 изменения переменного СМИ и не трипсина не каналы каждые два дня, с ежедневного мониторинга скорости расширения лимфоцитов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

При выращивании на MEFs в присутствии LIF, mESCs может поддерживаться в недифференцированном состоянии. В идеальных условиях, они появляются в виде компактных колоний клеток, окруженных блестящей гало в фазу контрастной микроскопии (рисунок 1). Эти культуры должны контролироваться ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Система OP9-DL1 совместно культуры была использована для изучения роли различных генных продуктов при разработке типов клеток крови из стволовых клеток. ^8,12,13 Он также доказали свою эффективность модель для изучения функции генов регуляторной ДНК во время клеточной дифференцировк?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab