Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

Zusammenfassung

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Zusammenfassung

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Einleitung

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

Protokoll

1. Herstellung von Kulturmedien, Zytokine und Gelatinierte Platten

1. Bereiten ES-Zell-Medien mit Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit hoher Glukose und Natrium Pyruvat. Fügen Sie 20% ESC qualifiziert Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin, 1% HEPES-Puffer, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1% Gentamicin (50 mg / ml) und 0,1% ( 55 uM) β-Mercaptoethanol. Sterilisieren ES-Zellmedium durch Filtration.
2. Vorbereitung OP9 Medien, indem 1 l Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) aus Pulver nach den Anweisungen des Herstellers. Mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Kehren Sie zu mischen. Sterilisieren durch Filtration in zwei 500 ml-Aliquots.
   HINWEIS: Die Verwendung von Medien aus Pulver hergestellt wird empfohlen und wahrscheinlich verbessert OP9 Zelle Wartung und In-vitro-Differenzierung Ergebnisse. Dieser Ansatz hat sich zu unserem Standardverfahren. Beachten Sie jedoch, wir auch that wir manchmal verwendet vorgefertigten flüssigen α-MEM mit ausreichenden Erfolg.
3. Vorbereitung Gefriermedien durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 90% FBS. Vorsichtig schwenken und zu sterilisieren durch Filtration. Lagerung bei 4 ° C.
4. Vorbereitung 2,000x Flt-3-Ligand (10 ug / ml) durch Lösen humanen rekombinanten Flt-3-Ligand (Flt-3L) in komplettem Medium OP9 bis 10 ug / ml. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen des Lieferanten Empfehlungen bezüglich Stabilität und Lagerung.
   HINWEIS: Die Stabilität von Flt-3L ist kurz (1 Monat bei 4 ° C oder 3 Monate bei -80 ° C).
5. Vorbereitung 1,000x IL-7 (1 ug / ml) unter Verwendung von vollständigen OP9 Medien. Aliquot in 1,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C. Folgen Sie den Empfehlungen des Lieferanten, die auf Stabilität und Lagerung (IL-7 ist bei -80 ° C für bis zu 12 Monate haltbar).
6. Vorbereitung 1,000x Leukemia Inhibitory Factor (LIF) (10 ug / ml) durch eine 1:10 Verdünnung von 10 ⁷ Einheiten LIF in ES-Zell-Medien. Speicher Aliquots bei 4 ° C ist. Notieren Sie die vom Hersteller auf den aliquoten Fläschchen vorgesehen Ablaufdatum.
   HINWEIS: Das Produkt ist in konzentrierter oder verdünnter Form mindestens 18 Monate ab dem Datum der Herstellung stabil.
7. Bereiten gelatinisierten 6-Well-Platten von 1,5 ml von 0,1% Gelatine-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Teller in den sterilen Abzug bei Raumtemperatur mit Deckel auf, so dass mindestens 30 min für die Beschichtung. Die Schalen können auch in einem befeuchteten Inkubator über Nacht stehen gelassen werden. Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Gelatinelösung direkt vor Zellaussaat. Lassen Sie sich nicht die Gelatinelösung vollständig trocknen im gut.

2. Vorbereitung und Wartung von Feeder-Zellen und embryonalen Stammzellen der Maus (MESC)

Hinweis: Alle Zellen inkubiert in einer befeuchteten 37 ° C-Inkubator mit 5% CO _2.

1. Auftauen embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)
   1. Quick-tauen eine gefrorene Fläschchen (~ 5 x 10 ⁶ Zellen / Flasche) von Mitomycin C-behandelten (oder anderweitig mitotisch verhaftet) MEFs und sie auf einem 15-ml-Tube.
   2. 8 ml ES-Zell-Medien, um den aufgetauten Zellen in einem Dropdown-weise Mode allmählich verdünnen das DMSO aus dem Gefriermedium.
   3. Zentrifuge Zellen bei 400 x g bei 4 ° C für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Zellpellet in 3 ml ES-Zellmedium.
   4. Vorbereiten einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 33 ml vorgewärmten ES-Zellmedium. Fügen Sie die 3 ml resuspendiertes MEFs, um das Endvolumen auf 36 ml zu bringen.
   5. Verteilen 3 ml der resuspendierten MEFs in jede Vertiefung zwei gelatinierte 6-Well-Platten. Legen Sie die Platten in den Brutschrank für mindestens sechs Stunden, um damit die Zellen anlagern und ausbreiten vor der Aussaat die mESCs auf sie. Diese mitotisch verhaftet Feeder-Schichten kann für mehrere Tage nach der ersten Aussaat verwendbar sein, wenn ihre Medien wird alle 2-3 Tage gewechselt.
      HINWEIS: Frisch verhaftet MEFs können ebenfalls verwendet werden.
   6. Seeding mESCs
      1. Quick-tauen ein Fläschchen mit einem gefrorenen MESC Klon in der 37 ° C-Wasserbad und bereiten Zellen, wie in 2.1.1-2.1.3 beschrieben.
         HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von MESC aus einer konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte.
      2. Entfernen Sie das Medium aus einer gut (pro MESC Klon) der 6-Well-Platte mit MEF verhaftet Monoschichten (in Schritt 2.1.5 vorbereitet) und Samen der 3 ml mESCs auf dem MEF-Monoschicht. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF (10 ng / ml). Zurück Gerichte in den Brutschrank.
   7. ES-Zell-Wartung und Trypsin-vermittelte Durchgang
      HINWEIS: Medienwechsel täglich, oder Split basierend auf Zusammenfluss von MESC. Optimal, Ernte und Split / re-Platte die Zellen jeden zweiten Tag.
      1. ES-Zell-Medien entfernen und waschen mESCs mit 2 ml PBS. PBS zu entfernen. 1 ml 0,25% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 3-5 min.
      2. Sammeln trypsiniert Zellen und übertragen sie in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Kräftig pipettieren die Zellsuspension zu brechen Klumpen von mWSR. 2 ml des vollständigen ES-Zellmedium zu der Zellsuspension, um das Trypsin zu neutralisieren.
      3. Spin-Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 3 ml ES-Zellmedium.
      4. Entfernen Sie das Medium aus 6-Well-Platten, die bereit verhaftet MEF-Monoschichten. Die geeignete Menge der Zellsuspension (basierend auf dem gewünschten Aufteilungsverhältnis) in 3 ml ES-Zellmedium in jede Vertiefung ausgesät zu werden. Hinzufügen 3 ul 1,000x LIF. Eine konfluente MESC gut aufgeteilt 1: 6 bereit für den Durchgang in 2 Tagen sein.
   8. OP9 / OP9-DL1 Zelle Instandhaltung
      1. Tauwetter ein Fläschchen OP9 Zellen (befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 mit OP9 Medien)
      2. 7 ml OP9 Medien bis 10 cm Gewebekulturschale. Fügen Sie die 3 ml resuspendierten Zellen in einem Dropdown-weise Weise, Verteilung Zellen im ganzen Platte. Legen Sie die Zellen über Nacht im Brutschrank.
      3. Prüfen Sie am nächsten Tag den Zusammenfluss der OP9 Zellen. Wenn das Gericht viele tote Zellen enthält schwimm Remove die Medien und die 10 ml frischem OP9 Medien. Gibt die Schale in den Inkubator, wenn fast voll Fluss nicht beachtet wird. Split (unter Verwendung von Trypsin) 1: 4 in der Nähe der konfluenten Monolayer OP9.
         HINWEIS: Die Platten sollten gleiche Ebene Zusammenfluss wieder in ca. 2 Tagen zu erreichen. Achten Sie darauf, OP9 Zellen über-konfluent werden zu lassen.
      4. Einfrieren der frühen Passagen der OP9 Zellen als Erweiterung Aktien.
         HINWEIS: Wir frieren 2 Fläschchen von OP9 Zellen von einem in der Nähe von konfluenten 10 cm Schüssel. Jedes Fläschchen der Expansion Lager weiter propagiert werden, um Arbeitsvorräte, die später in MESC Co-Kultur-Experimente verwendet werden zu erstellen. Bewahren Sie alle OP9 Bestände in flüssigem Stickstoff eingefroren und nicht in der -80 ° C-Gefrierschrank, da Temperaturschwankungen können sich negativ auf die Qualität der friert.

   3. OP9-DL1 Co-Kultur-Verfahren

   1. Co-Kultur-Zubereitungen
      1. Etwa eine Woche vor dem Beginn der Ko-Kultur, auftauen MEFs, mESCs und OP9 Zelle arbeiten stocks. Seit OP9-DL1 Zellen nicht bis Co-Kultur-Tag 8 erforderlich ist, tauen die OP9-DL1 Zellen während der ersten drei Tage nach der Co-Kultur-Initiation. Erhalten oder zu frieren alle Zellen, wie gebraucht.
      2. Bestimmen die Anfangszahl von 10 cm-Platten mit OP9 Zellmonoschichten zu 80% Konfluenz auf Co-Kultur Tag 0, basierend auf dem Ausmaß des Experiments zu erreichen (zB Anzahl der MESC Klone unterschieden werden und die Anzahl der Co-Kultur-Zeitpunkte analysiert werden). Um nach einer Co-Kultur vorzubereiten, teilen nahezu konfluenten Gericht OP9 Zellen zwischen 1: 4 und 1: 6 zwei Tage vor, wenn die Monoschichten benötigt werden.
         HINWEIS: Man wird zumindest eine Platte pro ESC-Klon müssen. Typischerweise ausgesät eine einzige ESC-Klon auf einer einzigen Platte am Tag 0 (wie unten beschrieben) sollte genügend Zellen liefern zu sechs Platten am Tag 5 Gang Samen. Jeder Tag 5 Platte ermöglicht eine anschließende Analyse Zeitpunkt.
      3. Seit OP9 Monoschichten kontinuierlich für die Co-Kulturpassage erforderlich sein, achten Sie darauf, immer maintain einer ausreichenden Anzahl von zusätzlichen OP9 Kulturplatten parallel mit der Co-Kultur.
   2. Tag 0: Einleitung der Co-Kultur
      1. Sammeln MESC wie in 2.3.1-2.3.4. Zählen Sie die Zellen.
      2. Für jeden Klon MESC vorbereiten 5 x 10 ⁴ MESC in 10 ml OP9 Medien pro Platte.
         Hinweis: Obwohl wir es nicht verwendet wird, stellen wir fest, dass ein alternatives Medium, das aus α-MEM, 10% FBS und 5 × 10 ^-5 M β-Mercaptoethanol wurde auch zur Verwendung bei der Differenzierung Co-Kulturen ¹⁰ gemeldet.
      3. Entfernen Sie alte Medien aus OP9 Gerichte und fügen Sie die 10 ml MESC Suspension auf die Gerichte kümmern, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Die Schalen werden in der 37 ° C-Inkubator.
   3. Tag 3: Medienwechsel
      1. Gerichte zu entfernen aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Kolonien sollten anfangen, Glanz verlieren und erscheinen abgeflacht.
      2. Entfernen Sie das Medium aus Speisen und schonend 10 ml frischem OP9Medien.
      3. Bringen Sie die Co-Kulturschalen in den Inkubator. Mesoderm-wie Koloniebildung täglich visuell zu überwachen, um den Zeitpunkt der Zuführung OP9 Mono Vorbereitung für den nächsten Durchgang (Tag 5), die nicht bis ~ 80-90% der Kolonien visuell Mesoderm-ähnliche Morphologie Anzeige durchgeführt werden sollte informieren. Maximale Verschiebung des Tag 5 Zelltransfer Schritt 2 Tage.
   4. Tag 5: Trypsin-vermittelte Durchgang mit Pre-Beschichtung.
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 10 cm-Schalen mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen. Fahren Sie mit den nächsten Schritten nur, wenn die Co-Kulturen visuell die in Schritt 3.3.3 beschriebenen Funktionen anzuzeigen (siehe auch Repräsentative Ergebnisse).
      1. Entfernen Sie das Medium aus den Co-Kulturschalen. 4 ml PBS zu waschen. Schwenken Sie die PBS und entfernen. 4 ml 0,25% Trypsin und die Schalen in Inkubator für ~ 5 min.
      2. Stören die Schicht von Zellen durch Trypsin heftiges Pipettieren, dabei nicht zu hohe Luftblasen einzuführen, bis einehomogenen, überwiegend Einzelzellsuspension erreicht.
      3. 4 ml komplette OP9 Medien und mischen durch Pipettieren. Transferzellen in eine neue, leere Schüssel 10 cm und in den Brutschrank für 30 Minuten, damit sich die Zellen zu OP9 an der Schale haften. Diese "Pre-plating" Schritt reduziert die Anzahl von Zellen OP9 zum nächsten Schritt der Co-Kultur überführt.
      4. Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Zellsiebe.
      5. Sammeln nicht-adhärenten Zellen von der vorgalvanisierten Gericht und leiten sie durch die Zelle Sieb in die Röhre. Vorsichtig waschen die Schale mit 6 ml PBS und geben es durch den gleichen Filter, so dass die Zellen angebracht OP9 hinter sich.
      6. Zentrifuge Zellen bei 400 x g 5 Minuten bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml vollständigem OP9 Medien. Zählen Sie die Zellen.
      7. Entfernen Sie die Medien aus 10 cm-Platten mit optimal zusammenfließenden OP9 Zellen.
      8. Für jedes Analysezeitpunkt, Samen 5 x 10 ⁵ Zellen auf dem OP9 monoSchicht in 10 ml Endvolumen.
      9. Mit 5 ng / ml humanes rekombinantes Flt-3L und die Schalen in Inkubator.
   5. Tag 8: hämatopoetischen Vorläuferzelle (HPC) Sammlung
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellmonoschichten, so dass sie in der ~ 80% konfluent in der Zeit für diesen Schritt.
      1. Bereiten Sie 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe.
      2. Entfernen Sie die Gerichte aus dem Inkubator und beobachten unter dem Mikroskop. Shiny Cluster HPC sollte locker an die OP9 Monolage befestigt werden. Sammeln, wie viele dieser Zellen wie möglich durch Waschen (aber nicht übermäßig zu stören) die OP9 Monoschicht mit einer Pipette und die vorhandenen Medien auf dem Teller. Um Schaumbildung zu verhindern, zumindest 1 ml des Mediums in der Spitze der Pipette in dieser Sammlung HPC / Waschschritt immer verlassen.
      3. Führen Sie die Zellen durch die 40 um Sieb in einem Rohr. 8 ml PBS auf die gleiche Platte und überprüfen unter dem Mikroskop, wenn alle HPC wirwieder gesammelt. Wiederholen des Wasch / Sammelschritt mit PBS und (falls erforderlich) mit kräftiger Waschen. Belastung der Zellen in das Rohr bereits die Zellen von der gleichen Platte enthält.
      4. Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist.
      5. Bereiten Sie ein Master-Mix von 3 ml (pro Platte ausgesät am Tag 5) des OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7.
      6. Überstand entfernen und Pellet in OP9 Medien mit Flt-3L + IL-7-Master-Mix (3 ml pro 10 cm Schale verarbeitet). Übertragen Sie die gesammelten Zellen von jeder Platte in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit OP9 Zellen.
         1. Um Zellen zu Monozyten-, B-Zell-Linien fahren oder Erythrozyten-, Saatgut die gesammelten Zellen auf OP9 Zellen. T-Zellen stammen, Saatgut der Zellen auf OP9-DL1 Zellmonoschichten.
      7. Legen Sie die 6-Well-Platten in Inkubator.
   6. Tag 10: Medienwechsel
      1. Bereiten Sie eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen für jede einzelne MESC Klon-Feeder-Zelltyp Combination in Co-Kultur.
      2. Bereiten Sie eine Mischung aus Master OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7. Bereiten Sie 3 ml für jeden gut.
      3. Sanft sammeln Medien aus jedem Well der 6-Well-Platte kombiniert Medien von mehreren Brunnen die gleiche ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält.
      4. 2 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) in jedes Well.
      5. Zentrifuge die gesammelten Medien bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und jedes Pellet resuspendieren (sehr klein, wenn sichtbar) in 1 ml OP9 Medien Master-Mix (siehe 3.6.2) pro Vertiefung ursprünglich in Schritt 3.6.3 gesammelt.
      6. Verteilen Sie 1 ml der Zellen wieder in jede Vertiefung, von dem die Medien ursprünglich erhoben bringt die Lautstärke in jedem gut 3 ml. Bringen Sie die Gerichte in den Inkubator.
   7. Tag 12: Kein Durchgang Trypsin
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus eine ausreichende Anzahl von 6-Well-Platten mit OP9 oder OP9-DL1 Zellen, so dass sie optimal in der Zeit konfluent für dieses s werdenTEP. Tag 12 ist ideal für die Durchflusszytometrie Analysen der Entwicklung von Erythrozyten-, Monozyten-und T-Zellen frühzeitig.
      1. Bereiten Sie ein Master-Mix (3 ml für jede Vertiefung, die in Co-Kultur fortsetzen wird) von OP9 Medien mit 5 ng / ml Flt-3L und 1 ng / ml IL-7.
      2. Vorbereitung 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 40 um Siebe (eine für jeden Klon ESC-Feeder-Zelltyp in Kombination Co-Kultur).
      3. Kräftig pipettieren die vorhandenen Medien in jede Vertiefung, um alle Zellen (einschließlich der Monoschicht) in der gut zu zerlegen. Fahren Sie mit kraftvollen Pipettieren bis ein Zustand ähnlich einer Einzelzellsuspension erreicht.
      4. Die gesammelten Zellen passieren durch das Sieb in das Rohr. 3 ml PBS in jedes Well zu waschen und zu sammeln alle übrigen Zellen. Pass-Zellen durch die gleiche Sieb. Kombinieren Sie mehrere Zellen aus dem gleichen Brunnen ESC Klon-Feeder-Zelltyp Kombination enthält.
      5. Entsorgen Sie die Zelle Sieb und entfernen einen aliquoten entspricht einem gut (~ 6 ml) für jede gewünschteDurchflusszytometrie (oder andere) analysiert, um aus an diesem Tag durchgeführt werden. Bewahren Sie diese Aliquots auf Eis vor dem Gebrauch.
      6. Zentrifuge Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen. Das Pellet aus den 50 ml-Zentrifugenröhrchen in 3 ml pro Vertiefung Master-Mix neu ausgesät werden. 3 ml pro Vertiefung jeder Zellsuspension auf die entsprechende Feeder-Zelltyp und die Schalen in den Brutschrank.
   8. Tag 14: Medienwechsel
      1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert.
   9. Tag 16: Kein Durchgang Trypsin
      HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus 6-Well-Schalen optimal zusammenfließenden OP9 oder OP9-DL1 Zellen für diesen Schritt.
      HINWEIS: Tag 16 ist ideal für die Durchflusszytometrie-Analysen der B-Lymphozyten und T-Zellen mittlere Stufe.
      1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert.
   10. Tag 18: Medienwechsel
       1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.6 skizziert.
   11. Tag 20: Kein Durchgang Trypsin
       HINWEIS: Tag 20 is ideal für die Durchflusszytometrie analysiert der Mitte bis späten Stadium der Entwicklung T-Zellen.
       1. Folgen Sie den Schritten in Abschnitt 3.7 skizziert. Falls gewünscht, tragen differenzierenden Zellen vergangenen Tag 20 Wechselmedienwechsel und kein Trypsin Gänge alle zwei Tage, mit täglichen Überwachung der Lymphozyten-Expansionsrate.

Ergebnisse

Wenn auf MEFs in Gegenwart von LIF wachsen kann mESCs in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden. Unter idealen Bedingungen als kompakte Kolonien von Zellen durch ein leuchtender Ring im Phasenkontrast-Mikroskopie umgeben (Abbildung 1) erscheinen sie. Diese Kulturen muss täglich überwacht werden. Je nach dem Zusammenfluss der Zellen, können Medien verändert oder Zellen können geteilt werden. Benachbarte MESC Kolonien nicht bis zur Berührung miteinander kommen. Eine normale, gesunde...

Diskussion

Die OP9-DL1 Co-Kultursystem wurde verwendet, um die Rolle der verschiedenen Genprodukte bei der Entwicklung von Blutzelltypen aus Stammzellen zu untersuchen. ^8,12,13 Es wurde auch ein effektives Modell, um die Funktion des Gens regulatorischen DNA zu untersuchen erwiesen während der zellulären Differenzierung. ^9,14 Mit diesem Ansatz als Alternative zum gesamten Mausmodelle können erhebliche Einsparungen an Zeit und Kosten für die Experimente, die viele grundlegende Fragen der Hämatopoese-Adres...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab