Method Article
This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.
La investigación en biomateriales y la ingeniería de tejidos a menudo incluye las investigaciones basadas en células in vitro, que requieren conocimiento inicial del número de células de partida. Mientras que los investigadores comúnmente Referencia su densidad de siembra esto no indica necesariamente el número real de células que se han adherido al material en cuestión. Este es particularmente el caso de los materiales, o andamios, que no cubren la base de las placas de cultivo celular estándar bien. Este estudio investiga la fijación inicial de las células madre mesenquimales humanas sembradas a un número conocido en poli electrohiladas (ε-caprolactona) de hilo después de 4 horas en la cultura. Hilados electrohiladas se celebraron en varias configuraciones distintas, incluidos los buques de biorreactor que giran a 9 rpm, insertos de cultivo celular colocados en placas de pocillos vinculantes bajos y politetrafluoroetileno (PTFE) comederos colocados dentro de cajas de Petri. Los dos últimos fueron sometidos a cualquiera de las condiciones estáticas o colocados en un agitador de placas (30 37 ° C, 5% de CO 2, la ubicación de las células sembradas se determinó mediante el ensayo de ADN de la célula. Los andamios fueron retirados de sus envases y se colocan en tampón de lisis. La fracción de los medios de comunicación se retiró y se centrifugó de manera similar - se desechó el sobrenadante y pellet disuelta con tampón de lisis. El tampón de lisis se añadió a cada receptáculo, o bien, y raspado para liberar a las células que pueden estar presentes. El ensayo de ADN de la célula determinó el porcentaje de células presentes en el andamio, medios de comunicación y las fracciones así. La unión celular fue baja para todos los montajes experimentales, con mayor apego (30%) para los hilos celebradas en insertos de cultivo celular y sometidos a agitación movimiento. Este estudio plantea conciencia para el número real de células correspondientes a los andamios con independencia de la densidad de la siembra de células indicado.
Andamios rutinariamente se están desarrollando e investigando para aplicaciones de biomateriales y la ingeniería tisular. Como tales, son comúnmente sembrados con células y su comportamiento in vitro caracterizadas a través de ensayos que determinan la proliferación celular y número de células, por ejemplo. Para los experimentos de este tipo, es imperativo que se conoce el número inicial de células y los investigadores a menudo indicar la concentración de siembra en términos de número de células por ml o 2 cm. Si bien esta es una buena práctica, especialmente con fines escala-up, que no tiene en cuenta el número real de células que se adhieren a la superficie de andamio (que también depende de las propiedades adhesivas de la superficie de biomaterial 1). Esto es especialmente cierto para andamios que no cubren la totalidad de la base de la placa de cultivo de células como células podrían caer fuera de la construcción y, debido a la naturaleza a menudo estática del experimento, nunca pueden venir de nuevo en contacto con el material de inteel descanso. Hilos de fibra Electrospun son un buen ejemplo de un andamio que no cubre la base del pozo (Figura 1). En este caso, y placas de unión bajas que no han sido tratados en la superficie se deben utilizar para evitar que las células se adhieran a la superficie de la placa y por lo tanto la distorsión de los resultados de cualquier ensayo bien fundamentada.
Y placas se utilizan fácilmente para la siembra de células en los andamios, pero no son el único método disponible. Sistemas de cultivos celulares de Rotary, un tipo de biorreactor desarrollado por la División de Ciencias de la Vida de la NASA en la década de 1980, de manera similar se pueden utilizar para sembrar andamios dentro de un entorno de tres dimensiones (3D) con la microgravedad simulada. Este tipo de biorreactor sigue siendo una opción popular entre los investigadores de todo el mundo y se ha incorporado en los estudios para la señalización celular 2,3, las células madre e ingeniería de tejidos 4,5 6,7. Lo que hace que el bioreactor rotativo preferible placas así es el mantenimientode un entorno 3D, que ayuda a evitar que las células diferenciadas a partir de dedifferentiating, como es a menudo el caso cuando se cultivan en condiciones convencionales 2D 8.
Este artículo investiga las diferentes técnicas para la siembra de células madre mesenquimales humanas en poli electrospun (ε-caprolactona) como hilos de fibra fabricada en Bosworth et al., 9 con el fin de maximizar el número inicial de células correspondientes a estos andamios dentro de un período de 4 h. Para el cultivo 2D, los hilos se llevaron a cabo de forma segura dentro y placas o (PTFE) comederos poli hechos a medida (tetrafluoroetileno) y se mantuvieron en condiciones estáticas, o agitaron a 30 rpm. Para la cultura 3D, se celebraron los hilos y las células dentro de los vasos de biorreactor que giran a 9 rpm.
Fabricación 1.Scaffold y Esterilización
2. La determinación de la zona Andamios superficie y número de células
3. Andamios Set-up - Cultivo Celular Inserción (Figura 1 A)
4. Andamios Set-up - Trough (Figura 1B)
5. Andamios Set-up - biorreactor de buques (Figura 1C)
Conteo 6. celular
Siembra 7. celular
8. Experimental Inicio
9. Ensayo de ADN
10. microscopio electrónico de barrido (SEM) Fijación
Los resultados ponen de manifiesto la ubicación de las células siguientes 4 horas después de la siembra para cada experimental investigado. Figura 2A muestra el porcentaje de células que se han unido a la superficie del andamio durante este tiempo. Un factor de conversión de 8,5 pg / célula se usó para convertir el contenido de ADN medido en el número de células y por lo tanto determinar el porcentaje de células 10. Para todos los montajes de siembra investigados, el porcentaje de unión celular es relativamente baja, con mayor adherencia de las células (30%) para andamios celebradas en insertos de cultivo celular y se agitó a 30 rpm (Insertar Shaker). Adherencia más bajo (15%) fue para andamios celebradas dentro de los insertos de cultivo celular y se mantiene bajo condiciones estáticas (Insertar estáticas).
Un gran número de las células estaban presentes dentro de la fracción papel (Figura 2B), sobre todo para las inserciones de cultivo de células mantenidas en placas bajas vinculantes (Insertar estáticas) y buques rotativos son 50% y 51%respectivamente. Andamios celebradas dentro de los canales demostraron un número elevado de células presentes en el propio titular - 48% de las células de Trough Shaker y el 50% para Trough estático.
Microscopía electrónica de barrido permitió una evaluación visual de los andamios sembrado de células (Figura 3). Imágenes representativas destacan una presencia limitada de las células en la superficie fibrosa, con independencia de la siembra de puesta a punto. Sin embargo, un mayor número de células y aglomerados de células estaban presentes en los andamios mantenidos dentro de los insertos de cultivo celular y se agitó a 30 rpm (Insertar Shaker).
Figura 1. montajes experimentales, donde Electrospun hilado se mantiene dentro; (A) insertos de cultivo celular y la placa de unión bien bajo; (B) poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) artesa y placa de Petri; y (C) recipiente biorreactor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ubicación de las células 4 horas después de la siembra Onto PCL Electrospun Hilos utilizando diferentes Siembra Set-ups. (A) demuestra el porcentaje de células que se han adherido al cadalso PCL (media ± desviación estándar), (B) destaca la propagación porcentaje de ubicación de la celda dentro de las tres fracciones - los medios de comunicación, bien y andamio (n = 4, los datos presentados como los valores medios). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Representante Scanning Electron micrografías para PCL electrohiladas Los hilos con células madre mesenquimales humanas, 4 horas después de la siembra inicial utilizando diferentes montajes experimentales. (Todas las imágenes con una ampliación 1.000X, barra de escala = 130 micras.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Matrices de fibra electrospun fabricados a partir de biopolímeros se utilizan regularmente para apoyar la unión de células y la proliferación para aplicaciones de biomateriales y / o de ingeniería de tejidos 11,12. En estos casos, las matrices son a menudo finas láminas de fibras que cubren fácilmente toda la base de una placa de cultivo celular y por lo tanto están en contacto completo con las células sembradas que mejora la unión celular. Sin embargo, si el andamio biomaterial no cubre completamente la base de la placa así, hay una alta probabilidad de que una gran proporción de las células sembradas no se quedará en contacto con el andamio y en última instancia, no podrá adjuntar. Este estudio investigó varios métodos diferentes para la siembra de células sobre andamios que no cubren la base de la placa, así, con el fin de determinar una técnica optimizada que podrían recomendarse para futuros experimentos basados en células.
Cinco diferentes montajes fueron investigados (Figura 1): Scaffolds (hilo electrospun) realizó utilizando insertos de cultivo celular en placas bajas así vinculante y sea mantenido bajo condiciones estáticas o sacudido a 30 rpm; andamios colocados dentro de depresiones PTFE estrechas y celebradas estática o sacudido a 30 rpm; y andamios alojados dentro de los vasos de biorreactor que giran a 9 rpm. Determinación del número de células que se habían adherido a los hilos electrospun por ensayo de ADN demostró un bajo porcentaje de unión para todos los montajes de siembra (Figura 2); y esto fue confirmado más lejos de micrografías electrónicas de exploración (SEM) (Figura 3). Greatest unión de las células - 30% o ~ 18.060 células -era observaron para los hilos que se celebraron en insertos de cultivo celular y sometidos a un movimiento continuo. Curiosamente, la unión de células más bajo (15%) se logró para hilos en poder de los insertos de cultivo celular, pero mantenido en condiciones estáticas, lo que sugeriría que la inclusión del movimiento radial tiene un efecto positivo en mantener las células en contacto con el andamio. No Obstante,cabe señalar que en circuito continuo de flujo de los medios podría ser responsable de los aglomerados de células observadas de las imágenes de SEM. El agitador de placas se encuentra en su posición más baja - 30 rpm - lo que podría ser una limitación a esta configuración. Con un movimiento radial más lenta puede ayudar a prevenir o reducir la aglomeración de células y también podría mejorar la unión celular como células experimentarán menos fuerza. Experimentos futuros deberían centrarse en la optimización de la velocidad de vibración ideal para mejorar la fijación de las células. La incorporación de movimiento para hilos celebradas dentro de los canales no dio lugar a una tendencia similar, con ambos escenarios rendimiento 18% apego (~ 10.836 células); aunque esto puede ser debido a la flotación parcial de los andamios dentro de las artesas (observado para artesas colocados en el agitador de placas) ya que no estaban ancladas a la base. Flotante parcial del andamio evitará cualquier células que han hundido hasta el fondo de la cubeta entre en contacto con el material y adherente. Para tsu especial configuración, la artesa se encuentra dentro de una placa de Petri y un volumen total de 10 ml de medio añadió. Las pequeñas dimensiones de la cuba significa que la mayoría de los medios de comunicación está presente dentro de la placa de Petri y si hay cualquier movimiento, las células se puede alejar de la cubeta en el plato petri y permanecer completamente fuera del alcance del andamio. Para superar estas limitaciones, experimentos adicionales deben incluir un paso adicional en el protocolo, por lo que los extremos de los andamios se fijan a la base de las cubetas utilizando finas agujas estériles, ya que esto debería evitar su flotación y movimiento (en particular para los andamios expuestos a movimiento radial), que en última instancia deberían conducir a un mayor número de células que unen al cadalso. 16% de las células se había unido a los hilos presentes dentro de los vasos rotativos. A pesar de ser una técnica bien establecida para la cultura en 3D, los problemas surgieron con la retirada de los andamios del principal puerto de los buques, lo que puede haber dado lugar a ATTAC vagamentecélulas hed están perdiendo. Los buques que se pueden abrir totalmente eliminaría este problema; estos están disponibles para la compra, pero son considerablemente más caros que los vasos desechables utilizados en este estudio.
Este estudio demuestra los problemas actuales con la siembra de los andamios que no cubren toda la base de placas estándar y de cultivo celular. Siembra un número de células conocida resultó en menos de un tercio de fijación al cadalso, a pesar de la superficie del andamio que permite que todas las células se adhieran. Esto podría tener consecuencias perjudiciales en otros ensayos basados en células que pueden evaluar la biocompatibilidad y célula-material de / célula-célula comportamiento y las interacciones con el andamio como un futuro dispositivo médico potencial. Otras limitaciones del estudio pueden incluir el punto de tiempo de 4 h - a pesar de ser lo suficientemente largo para garantizar la siembra de células inicial (células se ha demostrado que adherirse firmemente a sustratos en treinta minutos 13,14,15), puede ser razonable envestigate puntos de tiempo posteriores proporcionar células no proliferan durante un plazo de tiempo más largo, ya que de lo contrario sesgar el número de células de partida. Reducir el volumen de los medios de comunicación, en este caso 10 ml, podría también mejorar el contacto entre las células y andamio y en última instancia, aumentar la unión celular. Los estudios futuros también deben considerar la viabilidad celular como el proceso de la siembra de células puede causar daño celular y / o muerte celular 16. Análisis de ADN de la célula no diferencian entre células viables y no viables, como un ensayo en vivo / muerto como, por ejemplo, pondría de relieve el nivel de viabilidad.
Esta investigación plantea la conciencia con el número real de las células que se adhieren al cadalso a pesar de sembrar una cantidad conocida. Para los estudios que se basan en el número de partida de las células, es muy importante que los investigadores saben exactamente cuántos de esa cifra, de hecho, adherirse al sustrato de interés.
The authors declare that they have no competing financial interests.
Los autores desean agradecer y reconocer el Consejo de Investigación Médica para la financiación de esta investigación - MRC-FAP código concesión G1000788-98812.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Distilled water | in-house supply | n/a | |
Ethanol | Merck | 1117271000 | |
Phosphate Buffered Saline solution | Life Technologies | 70013016 | |
Human mesenchymal stem cells | PromoCell GmbH | C-12974 | |
MSC culture media | PromoCell GmbH | C-28010B | Warmed to 37 oC before use |
Supplement mix | PromoCell GmbH | C-39810 | Add to culture media |
Antibiotic/antimyotic mix | Sigma-Aldrich | A5955 | Add to culture media |
Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) | Sigma-Aldrich | 59417C | Warmed to 37 °C before use |
Cell culture flasks (T75) | Becton Dickinson Ltd | 353110 | |
Low binding 6-well plates | Costar Corning | 3471 | |
6-well CellCrowns | Scaffdex | C00003S | |
Petri-dish 50 ml deep | Sterilin | 124 | |
PTFE troughs | in-house production | n/a | |
Disposable RCCS vessels 10 ml | Synthecon | D-410 | |
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor | Synthecon | RCCS-4DQ | |
Shaker plate | Stuart | SSM1 | Mini Orbital Shaker |
Haemocytometer | Digital Bio | DHC-F01 | Disposable C-Chip |
Centrifuge tube | Deltalab | 352096, 429901 | 15 ml and 50 ml |
Centrifuge | Hettich | Rotafix 32 A | |
Syringe 3 ml | Shield Medicare Ltd | 3039820 | |
Pipettes | Sterilin | 40305, 47310, 40125 | 5, 10 and 25 ml |
Gilson pipettes | SLS | F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 | P2 - P1000 |
Pipette tips | SLS | PIP7852, PIP7834, PIP7840 | |
Micro test tube 1.5 ml | Eppendorf | 30125.15 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
PicoGreen Assay | Invitrogen | P7589 | Assay set-up in the dark |
Black 96-well plate | Greiner Bio One | 655086 | |
Fluorescent plate-reader | BGM Labtech | FLUOstar Optima | |
Glutaraldehyde 25% | TAAB Laboratories | G002 | Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 999-97-3 | |
Aluminium stubs (SEM) | Agar Scientific | G301 | |
Carbon tabs (SEM) | Agar Scientific | G3347N | |
Gold sputter coater | Edwards | S150B | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom World | Phenom Pro |
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