Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización

Resumen

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Resumen

Las células responden a la estimulación de quimiocinas por la pérdida de su forma redonda en un proceso llamado polarización, y mediante la alteración de la localización subcelular de muchas proteínas. Las técnicas clásicas de imágenes se han utilizado para estudiar estos fenómenos. Sin embargo, se requiere la adquisición manual de de muchas células, seguido de tiempo cuantificación de la morfología y la co-localización de la tinción de decenas de células. Aquí, un método rápido y potente se describe para estudiar estos fenómenos en muestras compuestas por varios miles de células por medio de un flujo de imágenes citometría de tecnología que combina las ventajas de un microscopio con los de un citómetro. El uso de linfocitos T estimulados con CCL19 y tinción para las moléculas MHC de clase I y actina filamentosa, una estrategia gating se presenta para medir simultáneamente el grado de alteraciones de la forma y el grado de co-localización de los marcadores que se ven afectados por la señalización de CCL19. Por otra parte, esta estrategia gating nos permitió OBSERVe la segregación de actina filamentosa (en el frente) y fosforilados proteínas Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (en la parte trasera) en las células T polarizadas después CXCL12 estimulación. Esta técnica también es útil para observar el efecto de bloqueo en la polarización de dos elementos diferentes: la inhibición de la polimerización de la actina por un inhibidor farmacológico y expresión de mutantes de la / PKC atípicas vía de señalización Par6. De este modo, se muestra evidencia de que esta técnica es útil para analizar tanto las alteraciones morfológicas y redistribuciones de proteínas.

Introducción

Las quimioquinas son pequeñas proteínas solubles que atraen a las células a ubicaciones especializados ^1. Por lo tanto, participan en la correcta posición de las células en los tejidos, una función crucial en el desarrollo y la fisiología. El sistema inmunológico no es una excepción a esta regla, ya que se basa en la acción de muchos tipos de células diferentes que actúan en concierto para montar una respuesta inmune efectiva. Mediante el control de la ubicación específica de un tipo de célula inmune en un estado dado, quimiocinas son pre-requerido antes de antígenos extraños pueden ser detectados y neutralizados.

En los linfocitos T, en particular, las quimioquinas se unen a receptores específicos de la superficie que, tras el acoplamiento, provocan muchas señales intracelulares (altura de calcio, la fosforilación de ERK, la activación de Rho GTPasas, el aumento de las integrinas de afinidad y alteraciones del citoesqueleto) que favorecen la motilidad celular T ^2,3. A nivel celular, se puede observar alteraciones morfológicas provocados a la estimulación de quimiocina.Estos cambios en las formas de células son especialmente dramática en las células T: células T en reposo tienen una morfología redonda de cordón cuando se viaja en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la detección de la presencia de quimiocinas en sitios de inflamación o en la proximidad de los órganos linfoides se va a cambiar la forma de las células T que ahora adoptar una morfología típica de "espejo de mano" que consiste en una forma bipolar: un borde de ataque en la parte delantera y un borde de salida, o urópodo, en la parte posterior ^4. Además, los componentes intracelulares pueden segregar en estas dos regiones opuestas de una célula T polarizada para sostener la migración. Por ejemplo, los filamentos de actina de polimerización aumenta tras la estimulación de quimiocina ⁵ y actina polimerizada se acumula en la parte delantera de una célula T polarizada ^2. Por otro lado, varias proteínas, tales como proteínas fosforiladas de la Ezrin-radixina-Moesin (ERM) de la familia que unen la membrana plasmática a la cortical del citoesqueleto de actina F, re-localizar en el urópodo de polarizadoLas células T ^6. Curiosamente, nosotros y otros han demostrado que se requiere este proceso de polarización para la migración de células T. De hecho, cualquier tratamiento que interfiere con polarización inhibir la motilidad celular. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de los miembros de la proteína atípica quinasas C (PKC) de la familia, la polarización celular y PKCζ PKCι bloques de T y su proceso de escaneo migratorio de las células dendríticas ^7. Polarización de las células T también está regulada por Rho GTPasas. Hemos demostrado que la modulación de la actividad de RhoA por la proteína Fam65b descrito recientemente interfiere con los cambios en la morfología de células T y su capacidad para migrar en un ensayo Transwell ^6. Como la polarización es un paso requisito previo para la motilidad celular, por lo que es crucial para poder cuantificar como una lectura principal de las respuestas a quimiocinas. Alteraciones de la forma de la célula se midieron previamente manualmente ^8. Sin embargo, este tipo de cuantificación es muy lento, de modo que por lo general sólo unos pocosdecenas de células se toman en cuenta.

Aquí, un nuevo método se presenta para cuantificar rápidamente el grado de alteraciones de la forma de los linfocitos T expuestos a quimioquinas estimulación. Un flujo de imágenes citometría de la tecnología (véase la Tabla de reactivos específicos / Equipment) se utiliza, que combina las ventajas de un citómetro de flujo y un microscopio ⁹ para cuantificar de manera eficiente la cantidad de células polarizadas en diferentes condiciones de estimulación de quimioquinas. Además de la cuantificación de las alteraciones morfológicas que uno puede medir la firmeza con esta tecnología, también es posible evaluar los cambios en la localización subcelular de algunas proteínas sobre la señalización de quimiocinas.

Protocolo

1. Preparación de los linfocitos T

1. Preparar ratón primaria o células T humanas como se describe ^10,11.
2. Cultivar las células T humanas en medio completo RPMI con 10% de suero humano AB a una densidad de 2 - 3 x 10 ⁶ células / ml.
   NOTA: El uso de suero de ternera fetal (FCS) en lugar de suero humano puede provocar la polarización espontánea de una gran fracción de células T humanas en cultivo. Mantener estas células en cultivo durante 4 - 5 días, y otro proceso en cualquier momento durante este período.
3. Mantener las células T de ratón en medio completo RPMI suplementado con 10% de FCS a una densidad celular similar. Utilice inmediatamente o al día siguiente, después de un cultivo O / N a 37 ° C en presencia de 10 ng / ml IL7.
4. Cultivar la línea celular T CEM humana en RPMI completo suplementado con 10% de FCS.

2. Estimulación de quimioquinas

1. Lave 5 x 10 ⁵ células por condición experimental en medio HBSS caliente suplementado con 10 mM Hepes. Para algunos experimentos, co-transfectar células T humanas primarias el día anterior con 2 g pmaxGFP y 8 g pcDNA3.1 ⁺ (vector vacío, control), PKCζ quinasa muerta, o plásmidos PAR6 N-terminales.
2. Resuspender el sedimento celular en medio cálido HBSS-Hepes (usar 0.3 ml x número de condiciones experimentales).
3. Distribuir las células en 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
   NOTA: Por lo tanto, un tubo que corresponde a una sola condición experimental contendrá 5 x 10 ⁵ células en 0,3 ml de medio HBSS-Hepes. Para algunos experimentos, añadir 500 nM latrunculina A o vehículo (DMSO) y se incuban las células durante 30 min antes de la estimulación de quimiocinas.
4. Añadir de 10 a 500 ng / ml o CCL19 de quimioquinas CXCL12 en cada tubo.
   NOTA: Utilizamos generalmente 10-200 quimiocina ng / ml para las células T humanas. CEM células no expresan el receptor CCR7 que une CCL19. Por lo tanto, las células CEM sólo serán capaces de responder a una estimulación CXCL12. Por otra parte, utilizar concentraciones más altas de quimioquinas (300-500 ng / ml) para polarizar las células T de ratón.
5. Voltear los tubos varias veces e incubar en un 37 ° C baño de agua durante 8 o 10 minutos para que las células T primarias o CEM, respectivamente.
6. Detener el proceso de polarización mediante la adición a cada tubo 0,3 ml de una solución caliente que contiene 2% de paraformaldehído (PFA) y Hepes 10 mM en PBS. Voltear los tubos y los incuban a 37 ° C durante 5 min.

3. Las tinciones

1. Transferencia de las células de los tubos de microcentrífuga a citometría de flujo tubos.
2. Llenar completamente los tubos con una solución de RT que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA), EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM en PBS.
3. Centrifugar los tubos a 460 g durante 4 min.
4. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de una solución a TA que contiene 5% de FCS en PBS.
5. Añadir 5 l de FITC-anti-HLA-ABC en cada tubo, vórtice, y los incuban durante 30 min a RT, lejos de la luz.
6. Lavar las células una vez con PBS que contiene 5% de FCS, unand una vez con PBS solo.
7. En RT: añadir 500 l 1% PFA, incubar durante 10 min, a continuación, lavar las células con una solución que contiene 1% de BSA, EDTA 0,5 mM y HEPES 10 mM en PBS.
8. Descartar el sobrenadante, llenar los tubos completamente con una solución de PBS que contenía 0,2% de BSA, 0,1% de saponina, EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM (tampón de permeabilización).
9. Lavar las células dos veces en este medio.
10. Voltear los tubos para eliminar el medio y Vortex a disociar el sedimento celular.
11. Añadir 0,25 g / ml TRITC-faloidina y / o una dilución 1: 100 de anticuerpo anti-P-ERM a cada tubo, vórtice ellos y se incuba durante 30 min a TA.
12. Lavar las células con el tampón de permeabilización. Incubar con un anticuerpo secundario fluorescente si es necesario.
13. Resuspender las células en 200 l de PBS y transferirlas a tubos de microcentrífuga.
    NOTA: Las células están listas para la adquisición. Alternativamente, mientras se mantiene un volumen máximo total de 200 l por tubo, añadir concentrado PFA a una final 1%concentración con el fin de preservar las tinciones si las células no están para ser usados ​​el mismo día para su posterior procesamiento.

4. Las imágenes Adquisición y Análisis

1. Encienda el aparato (véase la Tabla de específico Reactivos / Equipo) y se deja calibrar sí de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: El software INSPIRE se utilizó con un objetivo de 40X (0,75 NA). El software IDEAS 3,0 se utilizó para todos los cuantificaciones reportados.
2. Preparar una serie de ventanas de adquisición que se pueden guardar en una plantilla para futuros experimentos. Dibuja histogramas que cuantifican los valores de gradiente de RMS. De la población "In Focus", seleccionado en el RMS histograma gradiente, delimitar la población "célula única" en un histograma de la Zona. Una vez que el tubo de microcentrífuga se ha insertado en la máquina, ajustar la potencia del láser, la puerta en las células individuales y adquirir 5000 T linfocitos.
3. En las Ideas blandosware, abra el archivo de adquisición y crear un histograma que mostrará el valor del valor RMS gradiente de imágenes de campo claro (Canal 1) obtenida para cada célula individual. Dibuja una puerta en el histograma gradiente RMS que considera células que presentan RMS valor de gradiente anterior 57.
   NOTA: El gradiente de RMS permite tener en cuenta en el análisis sólo los linfocitos T que están en el plano focal. Hemos determinado empíricamente que las células individuales que presentan un valor de gradiente RMS superior a 57 están en el plano focal, y se pueden considerar con precisión.
4. En el menú Análisis / Máscaras, crear una nueva máscara, llamado Erode (M01,2) de la máscara de la morfología en las imágenes de campo claro M01, erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica de la zona, calculado sobre la máscara Erode (M01,2). Desde las celdas seleccionadas en la puerta anterior, abra un histograma que muestra el Área de células usando esta máscara de nueva creación.
   La morfología de las máscaras que están disponibles por: NOTApor defecto son mucho más grandes que el tamaño real de la célula. Por lo tanto, es más preciso para erosionar que hasta 2 píxeles.
5. Dibuja una puerta en las células T individuales, con exclusión de las microesferas y escombros (pequeña área) y los dobletes (grandes Area). Ajuste esta puerta en cada adquisición.
   NOTA: Las variaciones en el tamaño de la celda afectará a la posición de la puerta. Como las células T de ratón son más pequeños que las células T humanas que son ellos mismos más pequeño que las células CEM, el área de cada tipo de célula será proporcional a su tamaño.
6. Teniendo en cuenta las células individuales, en foco que fueron cerrada en los pasos anteriores, abrir un gráfico de puntos que consiste en el Raw Max Pixel en la tinción de HLA-ABC (Canal 2, eje x) como una función de la Raw Max Pixel en la faloidina tinción (Canal 4, eje y). Crear una puerta para excluir los eventos fluorescentes sin teñir o saturados. Abra dos histogramas que muestran la cruda Max Pixel para HLA-ABC (Canal 2) y phalloidin (Canal 4) coloraciones.
7. En el Análisis / menú Máscaras, createa nueva máscara, llamado Erode (M02,2) de la máscara de la morfología de las células HLA-ABC manchados (Canal 2), erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica que consiste en el parámetro de circularidad, calculado sobre la Erode (M02,2).
   NOTA: Este parámetro mide la desviación de la forma de la célula de un círculo. Por lo tanto, una célula T perfectamente redonda tendrá un valor alto circularidad mientras que las células polarizadas alargadas exhibirá un bajo índice de circularidad.
8. Posteriormente, crear otro histograma que reportar los valores de la función de circularidad de las células previamente cerradas. Utilice este histograma para trazar directamente la distribución de un individuo, población de células de enfoque de acuerdo con el valor de la circularidad para cada celda individual.
9. En cuanto a la forma del histograma para las células no estimuladas, dibujar una puerta para células polarizadas, a partir del valor circularidad más bajo hasta el valor límite de la circularidad donde la mayoría de las células no estimuladasse trazan. Mire la pantalla de estadísticas para el porcentaje de células polarizadas entre la población cerrada (% Recinto).
   NOTA: Hemos establecido esta puerta para los valores de índice de circularidad siguientes 13.
10. Con el fin de mirar a la polarización de la tinción de actina en las células, trazar un histograma para el Detalle Bright valor de similitud R3, comparando la tinción de HLA-ABC (canal 2) y la tinción faloidina (Canal 4).
    NOTA: Cuanto más grande sea el valor de esta característica, el más superpone las dos coloraciones son.
11. Usando la misma estrategia de gating como antes, trazar una puerta en las células no estimuladas para la tinción segregada que muestra el porcentaje de células con tinción de actina polarizada.
12. Cuando se haya completado, el porcentaje de células que muestran una segregación en la distribución de la MHC de clase I y tinciones con faloidina, el porcentaje de células polarizadas junto con los valores medios de los índices de la circularidad y la similitud de todas las células ± SD se muestran en la corresppaneles estadísticas onding.

Resultados

El primer ejemplo elegido aquí se refiere al uso de linfocitos T primarias humanas estimuladas con CCL19. Sin embargo, la misma estrategia se puede utilizar con las células T de ratón primario, líneas de células T o cualquier otro tipo de células sensibles a la estimulación de quimiocina. La estrategia gating que aquí se presenta incluye una serie de ventanas que se seleccionan los eventos enfocados, entonces las células individuales. Por último, la gama de intensidad de fluorescencia se sigue aquí como un ej...

Discusión

Usando una tecnología reciente del flujo de imágenes citometría, una estrategia rápida e informativo gating para analizar los eventos celulares y moleculares inducidos por la estimulación de quimiocinas se presenta. De un solo experimento, se pueden obtener dos tipos principales de información: los cambios en la morfología celular inducida por la estimulación de quimioquinas y la distribución subcelular de proteínas diferentes durante el proceso de polarización. Curiosamente, también se proporciona evidencia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis