Быстрая и надежная Анализ клеточной и молекулярной поляризации, индуцированной хемокинового сигнализации

Резюме

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Аннотация

Клетки реагируют на хемокинов стимуляцию теряют круглую форму в процессе, называемом поляризации, а изменения внутриклеточную локализацию многих белков. Классические методы визуализации были использованы для изучения этих явлений. Тем не менее, они требуют ручной приобретение многих клеток с последующим трудоемким количественной оценки морфологии и со-локализации окрашивания десятков клеток. Здесь быстрый и мощный способ описан для изучения этих явлений на образцах, состоящих из нескольких тысяч клеток с использованием потока изображений цитометрии технологии, которая сочетает в себе преимущества микроскопом с результатами цитометром. Использование Т-лимфоциты, стимулированные CCL19 и окрашивания для молекул MHC класса I и фибриллярного актина, стратегия стробирования представлены одновременно измерять степень формы изменения и степень совместной локализации маркеров, которые страдают от CCL19 сигнализации. Кроме того, эта стратегия стробирования позволило нам Observе сегрегация фибриллярного актина (на переднем плане) и фосфорилированного эзрина-Radixin-Moesin (фосфо-ERM) белки (сзади) в поляризованном Т-клеток после CXCL12 стимуляции. Эта методика также полезна для наблюдения за блокирующий эффект на поляризации двух различных элементов: ингибирование полимеризации актина путем фармакологического ингибитора и экспрессии мутантов Par6 / атипичной PKC сигнального пути. Таким образом, доказательства показали, что этот метод полезен для анализа как морфологические изменения и белковые перераспределения.

Введение

Хемокины небольшие растворимые белки, которые привлекают клетки специализированных местах ^1. Таким образом, они участвуют в правильном расположении клеток в тканях, важнейшие функции в процессе развития и физиологии. Иммунная система не является исключением из этого правила, как это полагается по действию многих различных типов клеток, которые действуют сообща, чтобы обеспечить эффективную иммунную реакцию. Управляя конкретного местоположения одного типа иммунных клеток в данном состоянии, хемокины предварительно требуется до чужеродные антигены могут быть обнаружены и нейтрализованы.

В Т-лимфоцитов, в частности, хемокинов связываются со специфическими рецепторами на поверхности, которые, при соединении, вызывают много внутриклеточные сигналы (рост кальция, ERK фосфорилирования, Rho GTPases активации, увеличение Интегрины близость и цитоскелета изменения), которые способствуют Т-клеток моторику ^2,3. На клеточном уровне, можно наблюдать морфологические изменения вызывали на хемокинов стимуляции.Эти изменения в клеточных форм особенно значительным в Т-клеток: покоящиеся Т-клетки имеют борта, как круглый морфологию при движении в потоке крови. Тем не менее, зондирование присутствии хемокинов в местах воспаления или в непосредственной близости от лимфоидных органов собирается изменить форму Т-клеток, в настоящее время принять типичный "ручное зеркало" Морфология, состоящий из биполярного виде: передний край на фронте и заднюю кромку, или Уропод, на задней ^4. Кроме того, внутриклеточные компоненты могут разделять в этих двух противоположных областей поляризованного Т-клеток для поддержания миграции. Например, актиновые филаменты полимеризации увеличивается при стимуляции хемокинов ⁵ и полимеризованного актина накапливается в передней части поляризованного Т-клеток ^2. С другой стороны, некоторые белки, такие как фосфорилированы белков Эзрин-Radixin-Moesin (ERM) семьи, которая свяжет плазматическую мембрану кортикальной F-актина цитоскелета, повторно локализовать в уропода поляризованногоТ-клетки ^6. Интересно, что мы и другие показали, что этот процесс поляризации требуется для Т миграции клеток. Действительно, любое лечение, что мешает поляризации будет ингибирования клеточной подвижности. Например, ингибирование активности членов атипичной протеинкиназ C (РКС) семьи, PKCζ и PKCι блоки T поляризации клеток и их миграции процесс сканирования дендритных клеток ^7. Т-клеток поляризация также регулируется Rho ГТФ. Мы показали, что модуляция активности RhoA по недавно описанного белка Fam65b мешает изменений Т-клеток в морфологии и их способности к миграции в анализе Transwell ^6. Как поляризации является необходимым условием для клеточного шаг подвижности, это, таким образом, важно, чтобы иметь возможность количественно оценить его в качестве основного считывания ответов хемокинов. Формы клеток изменения были ранее измеренное вручную ^8. Тем не менее, этот вид количественного очень много времени, так что, как правило, лишь немногиедесятки клеток учитываются.

Здесь новый метод представлен быстро количественно степень изменения формы Т-лимфоцитов, подверженных хемокинов стимуляции. Поток изображений цитометрии технологии (см таблицу специфических реагентов / Оборудование) используется, которая сочетает в себе преимущества проточной цитометрии и микроскопа ⁹ количественно эффективно количество поляризованных клетках в различных условиях хемокинов стимуляции. В дополнение к количественной оценки морфологических изменений, которые можно измерить энергично с этой технологией, можно также оценить изменения в субклеточном локализации некоторых белков при хемокинов сигнализации.

протокол

1. Получение Т-лимфоцитов

1. Подготовка первичной мышь или человека Т-клеток, как описано ^10,11.
2. Выращивают человека Т-клеток в полной RPMI среде с 10% человеческой сыворотки АВ с плотностью 2 - 3 × 10 ⁶ клеток / мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: использование эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), а не человеческой сыворотки может вызвать спонтанная поляризация крупной фракции Т-клеток человека в культуре. Храните эти клетки в культуре в течение 4 - 5 дней и дальнейшего процесса их в любое время в течение этого периода.
3. Поддержание мыши Т-клеток в полной RPMI среде, дополненной 10% FCS в подобной плотности клеток. Используйте сразу или на следующий день, после того, как O / N культуры при 37 ° С в присутствии 10 нг / мл IL7.
4. Культивируйте СЕМ человека Т-клеток линии в комплекте RPMI, дополненной 10% FCS.

2. Хемокин Стимуляция

1. Вымойте 5 х 10 ⁵ клеток на экспериментальной состоянии в теплой HBSS среде с добавлением 10 мМ Hepeс. Для некоторых экспериментов, со-трансфекции первичных человеческих Т-клеток накануне с 2 мкг pmaxGFP и 8 мкг pcDNA3.1 ⁺ (пустой вектор, контроль), PKCζ киназы мертвых, или N-концевых плазмид PAR6.
2. Ресуспендируют осадок клеток в теплой HBSS-Hepes среды (используйте 0,3 мл х количество экспериментальных условиях).
3. Распределите клеток в 1,5 мл микропробирок.
   Примечание: Таким образом, одна трубка, соответствующий одной экспериментальной состоянии будет содержать 5 × 10 ⁵ клеток в 0,3 мл HBSS-Hepes среды. Для некоторых экспериментов, добавить 500 нМ Латрункулин или транспортного средства (ДМСО) и инкубируют клетки в течение 30 мин перед стимуляцией хемокинов.
4. Добавить 10 до 500 нг / CCL19 мл или CXCL12 хемокинов в каждой пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем 10 - 200 нг / мл хемокинов для Т-клеток человека. CEM клетки не экспрессируют рецептор CCR7, что связывает CCL19. Таким образом, клетки СЕМ будет только в состоянии реагировать на CXCL12 стимуляции. Кроме того, использовать более высокие концентрации хемокинов (300 - 500 нг / мл) для поляризации Т-клеток мыши.
5. Флип трубок несколько раз и инкубировать их на водяной бане 37 ° в течение 8 или 10 мин для первичных Т-клеток или CEM, соответственно.
6. Остановить процесс поляризации путем добавления в каждую пробирку 0,3 мл теплого раствора, содержащего 2% параформальдегида (PFA) и 10 мМ Hepes в PBS. Переверните трубы и инкубировать их при 37 ° С в течение 5 мин.

3. окрашивания

1. Передача клеток из микропробирок с проточной цитометрии труб.
2. Заполните трубы полностью раствором RT, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ Hepes в PBS.
3. Центрифуга труб при 460 мкг в течение 4 мин.
4. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 100 мкл раствора RT, содержащей 5% FCS в PBS.
5. Добавить 5 мкл FITC-анти-HLA-ABC в каждую пробирку, вихревые их, и инкубируют их в течение 30 мин при комнатной температуре, в защищенном от света.
6. Промыть клетки один раз ФБР, содержащим 5% ФТС,ND один раз только PBS.
7. В RT: добавить 500 мкл 1% PFA, инкубировать в течение 10 мин, затем промыть клетки с раствором, содержащим 1% BSA, 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ HEPES в PBS.
8. Жидкость над осадком сливают, заполняют трубы полностью раствором PBS, содержащим 0,2% БСА, 0,1% сапонина, 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ HEPES (пермеабилизации буфер).
9. Промыть клетки дважды в этой среде.
10. Флип трубы, чтобы удалить среду и вихревых их отделить осадок клеток.
11. Добавить 0,25 мкг / мл TRITC-фаллоидином и / или один: 100 разбавление анти-Р-ERM антитела в каждую пробирку, вихревые их и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
12. Вымойте клеток с буфером пермеабилизации. Инкубируйте с флуоресцентным вторичного антитела, если это необходимо.
13. Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS и передачи их в микроцентрифужных пробирках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки готовы к приобретению. С другой стороны, при сохранении общего максимального объема 200 мкл на пробирку, добавляют концентрированную PFA до конечной 1%концентрация для того, чтобы сохранить окрашивания, если клетки не будут использоваться в тот же день для дальнейшей обработки.

4. Изображения для сбора и анализа

1. Включите аппарат (см таблицу специфических реагентов / Оборудование), и пусть он калибровки себя в соответствии с инструкциями изготовителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: программное обеспечение INSPIRE был использован с 40х объективом (0,75 NA). ИДЕИ 3,0 программного обеспечения был использован для всех зарегистрированных количественными.
2. Подготовить ряд окон приобретение, которое может быть сохранено в качестве шаблона для будущих экспериментов. Нарисуйте гистограммы, которые количественно значения градиента RMS. Из "В фокусе" населения, отобранных на RMS градиент гистограммы, разграничить населения "Single Cell" на гистограмме Района. После того, как микроцентрифужных трубки был вставлен в устройство, регулировки мощности лазера, ворота на отдельные клетки и приобрести 5000 Т-лимфоцитов.
3. В Идей мягкихпосуда, откройте файл приобретения и создать гистограмму, которая будет показывать значение среднеквадратичного значения градиента для изображений в светлом поле (канал 1), полученные для каждой отдельной клетки. Нарисуйте ворота на гистограммы градиентного RMS, что считает клетки, обладающие RMS значение градиента выше 57.
   ПРИМЕЧАНИЕ: градиент RMS позволяет учитывать в анализе только Т-лимфоцитов, которые находятся в фокальной плоскости. Мы определены эмпирически, что отдельные клетки, проявляющие градиента среднеквадратичное значение превосходит 57 в фокальной плоскости, и может быть точно считать.
4. В анализ / меню Маски, создать новую маску, называется Ирода (M01,2) от морфологии маску на светлое изображений M01, эродированных 2 пикселей. Тогда, в анализу / Особенности меню, создать новую функцию Area, рассчитанного на Ирода (M01,2) маски. Из клеток, выбранных на предыдущем ворот, откройте гистограмму, показывающую диапазон ячеек, использующих эту вновь созданную маску.
   ПРИМЕЧАНИЕ: морфология маски, которые доступны напо умолчанию намного больше, чем фактический размер ячейки. Таким образом, является более точным, разрушать его до 2 пикселей.
5. Нарисуйте ворота на отдельных Т-клеток, за исключением калибровки бисером и мусора (малая площадь) и дублетов (большая площадь). Отрегулируйте эти ворота на каждом приобретения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения в размер ячейки будет влиять на положение ворот. Как Т-клетки мыши меньше, чем Т-клеток человека, которые сами по себе меньше, чем клеток СЕМ, площадь каждого типа клеток будут пропорционально его размеру.
6. С учетом одно-, в фокусе клетки, которые были стробированных на предыдущих шагах, открыть точка участок, состоящий из исходных Max Pixel на окрашивание по HLA-ABC (канал 2, ось х) в зависимости от сырья Макс пиксела на фаллоидином окрашивание (Channel 4, ось у). Создать ворота, чтобы исключить неокрашенных или насыщенные события люминесцентные. Открытые две гистограммы, показывающие Raw Макс пикселей для HLA-ABC (канал 2) и фаллоидина (канал 4) окрашивания.
7. В анализ / меню Маски, создаEA новая маска, называется Ирода (M02,2) от морфологии маска HLA-ABC окрашенных клеток (канал 2) подорвало из 2 пикселей. Тогда, в анализу / Особенности меню, создать новую функцию, состоящую из параметра округлости, рассчитанный на Erode (M02,2).
   Примечание: Этот параметр измеряет отклонение формы клеток из круга. Таким образом, совершенно круглые Т-клеток будет иметь большое значение округлости, тогда как удлиненные поляризованных клеток будет демонстрировать низкий коэффициент округлости.
8. Впоследствии, создать еще один гистограмму, которая будет отчитываться значения функции округлости из ранее закрытых ячеек. Эта гистограмма непосредственно участок распределение индивидуального, в фокусе клеточной популяции в соответствии с величиной округлости для каждой отдельной клетки.
9. Глядя на форму гистограммы для нестимулированных клеток, нарисуйте ворота для поляризованных клетках, начиная с самой низкой стоимостью округлости до предела округлость значения, где большинство нестимулированных клетокнанесены. Посмотрите на дисплей статистики по проценту поляризованных клетках среди закрытом населения (% закрытого типа).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы поставили эти ворота для значений индекса округлости ниже 13.
10. Для того, чтобы смотреть на поляризации актина окрашивания в клетках, построить гистограмму для ярких деталях значение подобия R3, сравнивая окрашивание HLA-ABC (канал 2) и окрашивание фаллоидином (Channel 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: больше значение этой функции, более налагаются два окрашивания есть.
11. Используя ту же стратегию стробирования, как и прежде, участок ворота на не стимулированных клеток для раздельного окрашивания, который показывает процент клеток с окрашиванием поляризованного актина.
12. После завершения процент клетки, обладающие сегрегации в распределении МНС класса I и фаллоидином окрашивания, процент поляризованных клетках вместе со средними значениями округлости и индексы общности всех клеток ± SD показаны в-корреспондентonding Статистика панелей.

Результаты

В первом примере выбраны здесь относится к использованию человеческих первичного Т-лимфоцитов, стимулированных CCL19. Тем не менее, та же стратегия может быть использована с основным мыши Т-клеток, Т-клеточных линий или любого другого типа клеток в ответ на стимулирование хемокинов. Стра...

Обсуждение

Использование недавно созданной технологии потока изображений цитометрии, быстрый и информативный стратегия стробирования для анализа клеточных и молекулярных событий, вызванных хемокинов стимуляции представлена. Из одном эксперименте, можно получить два основных типа информации:...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis