케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

요약

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

초록

세포는 과정이라고 편광 자신의 원형을 잃고으로 많은 단백질의 세포 내 현지화를 변경하여 자극을 케모카인에 응답합니다. 고전 이미징 기술은 이러한 현상을 연구하는데 사용되어왔다. 그러나 이러한 형태 및 세포의 수만 염색 공동 지역화 시간 소모적 정량화 하였다 많은​​ 세포의 수동 요구를 취득. 여기서, 신속하고 강력한 방법은 사이토의 것과 현미경의 장점을 결합한 기술 계측법 촬상 흐름을 이용하여 상기 셀 수천 이루어진 샘플들에 이러한 현상을 연구하기 위해 설명된다. MHC 클래스 I 분자와 사상 액틴 용 CCL19 염색 자극 T 림프구를 사용하여, 게이팅 전략 동시에 형상 변화의 정도 및 CCL19 시그널링에 의해 영향 마커의 공동 국산화 정도를 측정하기 위해 제공된다. 또한,이 게이팅 전략은 observ 우리를 허용전자 CXCL12 자극 후 편광 T 세포 (전면) 사상 액틴과 (후면) 인산화 Ezrin-Radixin-Moesin (포스 ERM) 단백질의 분리. Par6 / 비정형 PKC 신호 전달 경로의 돌연변이 발현 억제제 및 약리학 적으로 액틴 중합 억제제 등이 기술은 두 개의 서로 다른 편광 소자에 차단 효과를 관찰하는데 유용 하였다. 따라서, 증거는이 기술은 단백질의 형태 학적 변화 및 ​​재분배 모두를 분석하는 유용한 것을 알 수있다.

서문

케모카인 전문 위치 ^1에 세포를 유치 작은 수용성 단백질이다. 따라서, 그들은 조직에서 세포의 정확한 위치, 개발 및 생리에 중요한 기능에 참여하고 있습니다. 이 효과적인 면역 반응을 탑재 콘서트 행동 많은 다른 종류의 세포의 작용에 의존으로 면역 시스템은이 규칙에 예외는 아닙니다. 외부 항원이 검출 중화되기 전에 주어진 상태에서 하나의 면역 세포 유형의 특정 위치를 제어함으로써, 케모카인 장치들이 필요하다.

특히 T 림프구에서, 케모카인은 T 세포 운동성 ^{2,3- 호의} 결합시, 다양한 세포 내 신호를 유도하는, 특정한 표면 수용체 (칼슘 증가, ERK 인산화의 Rho GTP 아제 활성, 인테그린 친화 세포 골격 변화의 증가)에 결합한다. 세포 수준에서, 하나는 케모카인 유도 자극에 형태 학적 변화를 관찰 할 수있다.세포 모양에서 이러한 변화는 T 세포에서 특히 극적 : 혈류에 여행 할 때 휴식 T 세포가 구슬처럼 둥근 형태를 가지고있다. 앞에 리딩 에지​​ : 그러나, 염증 부위에 또는 림프 기관의 근방에서 케모카인의 존재를 감지 해주기 양극성 형태로 이루어진 전형적인 "핸드 미러"형태를 채택하는 T 세포의 모양을 변경하려고 그리고 다시 ^4에서 트레일 링 에지, 또는 uropod. 또한, 균체 내 성분은 마이그레이션을 유지 편광 T 세포의 두 대향하는 영역으로 분리 할 수​​있다. 예를 들면, 케모카인 자극 ⁵ 및 액틴 중합시 액틴 필라멘트 중합 증가 편광 된 T 세포 ^(2)의 전방에 축적한다. 한편, 이러한 피질 F 액틴 세포 골격에 세포막 링크 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM)과 가족의 인산화 된 단백질과 같은 여러 가지 단백질의 편광 uropod에 다시 문 지역화T 세포 ^(6). 흥미롭게도, 우리 등이 분극 처리는 T 세포의 이주를 위해 필요하다는 것을 보여 주었다. 실제로, 편광을 방해하는 어떤 치료는 세포의 운동성을 억제합니다. 예를 들어, 비정형 단백질 구성원의 활성의 억제는 C (PKC) 계열, 및 PKCζ PKCι 블록 T 세포와 수지상 세포 편광 ^7들의 이동성 스캔 과정 키나아제. T 세포 분극도의 Rho GTP 아제에 의해 조절된다. 우리는 최근에 기재된 Fam65b에서 RhoA 의한 단백질 활성의 조절이없이 Transwell 분석 ⁶ 마이그레이션 T 세포 형태의 변화 및 능력을 방해 것을 보여 주었다. 편광 세포 운동성위한 필수 단계로서, 케모카인은 응답의 메인 리드로 정량화 할 수있는 것이 결정적으로 중요하다. 세포 모양의 변화는 이전에 수동으로 ⁸ 측정 하였다. 그러나, 이러한 종류의 정량은 매우 시간 소모적이며, 그 보통 몇 그래서세포의 수만 고려된다.

여기서, 새로운 방법이 급속 케모카인 자극에 노출 된 T 림프구의 형상 변화의 정도를 정량화하기 위해 제시된다. 기술 계측법 촬상 유동은 케 모킨 자극 상이한 조건에서 효율적으로 편광 된 세포의 양을 정량화하는 유세포 및 현미경 ^(9)의 이점을 결합하는 데 사용된다 (특정 시약 / 장비의 도표 참조). 하나의 기술이 견고하게 측정 할 수있는 형태 학적 변화의 정량화에 또한, 케모카인 시그널링시 일부 단백질의 세포 내 위치 변화를 평가하는 것도 가능하다.

프로토콜

T 림프구의 1. 준비

1. ^{10, 11 설명} 된대로 기본 마우스 또는 인간 T 세포를 준비합니다.
2. 3 × ¹⁰⁶ 세포 / ml - (2)의 농도에서 10 % 인간 AB 혈청 완전한 RPMI 배지에서 인간 T 세포를 배양.
   주 : 배양 인간 T 세포의 많은 부분의 자발 분극을 유도 할 수 소 태아 혈청 (FCS) 대신에 인간 혈청을 사용. 이 기간 동안 언제든지 5 일 추가로 과정을 - 4 문화에서 이러한 세포를 보관하십시오.
3. 유사한 세포 밀도로 10 % FCS가 보충 된 완전 RPMI 배지에서 마우스 T 세포를 유지한다. 10 NG / ㎖ IL7의 존재하에 37 ℃에서 즉시 또는 다음 날, O / N에서 배양 한 후 사용한다.
4. 완전한 RPMI 10 % FCS로 보충 된 CEM 인간 T 세포주를 배양.

2. 케모카인 자극

1. 10 mM의 Hepe 보충 따뜻한 HBSS 매체에 실험 조건 당 5 × 10 ⁵ 세포를 씻으의. 몇 가지 실험을 위해, 2 μg의 pmaxGFP 8 μg의 한 pcDNA3.1 ⁺ (빈 벡터 제어), 죽은 PKCζ 키나아제, 또는 N- 말단 Par6 플라스미드로 전날 차 인간 T 세포를 공동 형질.
2. 따뜻한 HBSS - 헤 페스 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁 (실험 조건 0.3 ㎖의 X 번호를 사용).
3. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 배포합니다.
   주 : 따라서 단일 실험 조건에 대응 한 튜브를 0.3 ㎖의 HBSS - 헤 페스 매체에 5 × ¹⁰⁵ 세포를 포함 할 것이다. 일부 실험에서, 500 nM의 Latrunculin 또는 비히클 (DMSO)를 첨가하고, 케모카인 자극 전에 30 분 동안 세포를 배양한다.
4. 각 튜브에 10 NG / ㎖의 CCL19 또는 CXCL12 케모카인 (500)에 추가합니다.
   참고 : 우리는 보통 10 사용 - 인간 T 세포에 대한 200 NG / ml의 케모카인을. CEM 세포는 CCL19 결합 CCR7 수용체를 발현하지 않습니다. 따라서, CEM 세포 만 CXCL12 자극에 응답 할 수있다. 500 N - 또한, 높은 케모카인 농도 ((300)를 사용하여g / ml)를 마우스 T 세포를 편광 시키.
5. 튜브를 수회 뒤집고 각각 일차 T 세포 또는 CEM을 8 또는 10 분 동안 37 ° C까지 수조에서이를 부화.
6. 각 튜브에 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 PBS의 10 mM의 Hepes를 함유 따뜻한 용액 0.3 ㎖를 첨가하여 분극 처리를 중지. 튜브를 뒤집어 5 분 동안 37 ° C에서 그들을 부화.

3. 염색과

1. 튜브 유동 세포 계측법하기 위해 마이크로 원심 튜브에서 세포를 전송합니다.
2. 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 mM의 EDTA PBS 및 10 mM의 Hepes를 함유 RT 용액으로 완전히 관을 채운다.
3. 4 분 동안 460 XG에 튜브를 원심 분리기.
4. 상층 액을 제거하고 PBS에서 5 % FCS를 함유 RT 용액 100 ㎕에 세포를 재현 탁.
5. 멀리 빛, 소용돌이를, 각 튜브에 FITC-항 HLA-ABC의 5 μl를 추가하고, 실온에서 30 분 동안 그들을 품어.
6. , PBS 5 %를 FCS를 함유 한 번 세포를 씻으한 번만 PBS와 ND.
7. RT에서 : 다음 1 % BSA, 0.5 mM의 EDTA와 PBS에서 10 mM의 HEPES를 포함하는 용액으로 세포를 씻어 10 분 동안 품어, 500 ㎕의 1 % PFA를 추가합니다.
8. 상층 액을 버리고 PBS는 0.2 % BSA, 0.1 % 사포닌, 0.5 mM의 EDTA 10 mM의 헤 페스 (투과성으로 버퍼)를 포함하는 용액으로 완전히 튜브를 입력합니다.
9. 이 매체에 두 번 세포를 씻으십시오.
10. 배지를 제거하고 세포 펠릿을 해리하도록 와류 튜브 플립.
11. 각각의 튜브에 방지 P-ERM 항체의 100 희석, 소용돌이를하고 실온에서 30 분 동안 품어 : 및 / 또는 1 0.25 ㎍ / ㎖의 TRITC-Phalloidin의를 추가합니다.
12. 투과성으로 버퍼와 세포를 씻으십시오. 형광 이차 항체로 인큐베이션 필요한 경우.
13. 200 μl의 PBS에 세포를 재현 탁하고 마이크로 원심 튜브로 전송.
    참고 : 세포는 획득을위한 준비가되어 있습니다. 튜브에 200 μL의 최대 총 부피를 유지하면서 선택적으로, 최종 1 %로 농축시켜 추가 PFA세포는 추가 처리를 위해 당일 사용되지 않아야하는 경우, 순서의 염색 농도를 유지한다.

4. 이미지 수집 및 분석

1. 장치 (특정 시약 / 장비의 표 참조)로 전환하고 제조업체의 지침에 따라 자체를 교정 할 수 있습니다.
   참고 : INSPIRE 소프트웨어는 40 배 목표 (0.75 NA)로 사용되었다. IDEAS 3.0 소프트웨어는 모든보고 정량화에 사용되었다.
2. 미래의 실험 템플릿에 저장할 수 있습니다 획득 일련의 창을 준비합니다. RMS 그라데이션 값을 정량화 히스토그램을 그립니다. RMS 그라데이션 막대 그래프에서 선택한 "초점에서"인구에서, 지역의 히스토그램에서 "단일 셀"인구 경계를 정하다. 마이크로 원심 튜브가 기기에 삽입되면, 각 셀에 대한 게이트 레이저 파워를 조정하고 5000 T 림프구를 취득.
3. 부드러운 아이디어도자기, 인수 파일을 열고 각 셀에 대해 얻은 밝은 필드 이미지의 그라데이션 RMS 값의 값을 표시하는 막대 그래프 (채널 1)을 만듭니다. 57 위의 RMS에게 그라데이션 값을 나타내는 세포를 고려 RMS 그라데이션 히스토그램에 게이트를 그립니다.
   참고 : RMS 구배 분석 초점면에있는 경우에만 T 림프구에서 고려 허용합니다. 우리는 (57)에 우수한 그라데이션 RMS 값을 나타내는 각각의 세포는 초점면에 있고, 정확하게 고려 될 수 있음을 경험적으로 결정했다.
4. 분석 / 마스크 메뉴에서, 2 픽셀의 침식 시야 이미지 M01,의 형태 마스크에서 (M01,2)을 침식라는 새로운 마스크를 만들 수 있습니다. 그런 다음, 분석 / 침식 (M01,2) 마스크 계산 영역의 새로운 기능을 만들 메뉴를 갖추고 있습니다. 게이트 이전에 선택된 셀로부터,이 새로 만든 마스크를 이용하여 상기 셀 영역을 나타내는 히스토그램을 연다.
   참고 :에 의해 사용할 수있는 형태의 마스크디폴트는 셀의 실제 크기보다 훨씬 더 크다. 따라서,이 화소로까지 침식 더 정확하다.
5. 교정 구슬과 이물질 (작은 지역)과 이중선 (대형 지역)을 제외한 개별 T 세포에 게이트를 그립니다. 각 인수에서이 게이트를 조정합니다.
   주 : 셀 크기에 변동이 게이트의 위치에 영향을 미칠 것이다. 마우스 T 세포가 스스로 CEM 세포보다 작은 인간 T 세포보다 작은 같이, 각 세포 유형의 면적의 크기에 비례한다.
6. 이전 단계에서 게이트 된 하나에 초점 세포를 감안하면, 팔로이 딘의 원시 최대 픽셀의 함수로 HLA-ABC 염색에 원시 최대 픽셀의 (채널 2, X 축)로 구성되는 점 음모를 엽니 다 염색 (채널 4, Y 축). 흠 또는 포화 형광 이벤트를 제외 게이트를 만듭니다. 원시 최대 HLA-ABC를위한 픽셀 (채널 2) 팔로이 딘 (채널 4)의 염색을 보여주는 열기 두 히스토그램.
7. 분석 / 마스크 메뉴, CREAT에서2 픽셀의 침식 HLA-ABC 염색 된 세포 (채널 2)의 형태 마스크에서 (M02,2)을 침식라는 개 새로운 마스크. 그런 다음, 분석 / 침식 (M02,2)에 계산 된 원형 매개 변수로 구성된 새로운 기능을 생성, 메뉴 특징.
   참고 :이 매개 변수는 원에서 셀 모양의 편차를 측정합니다. 따라서, 완전한 원형 T 세포는 낮은 원형도 지수를 나타낼 것이다 편광 신장 세포 반면 높은 원형도 값을 가질 것이다.
8. 이어서, 이전 셀로부터 게이트 된 원형 형상의 값을보고 다른 히스토그램을 생성한다. 직접 각각의 개별 셀에 대한 원형도 값에 따라 개인 합초 세포군의 분포를 플롯이 히스토그램을 사용한다.
9. 비 - 자극 된 세포에 대한 히스토그램의 형상을 살펴보면, 원형 제한값까지 낮은 원형도 값에서 시작하여, 편광 된 셀을 그리 게이트 여기서 비 자극 된 세포의 대부분플롯됩니다. 게이트 인구 중 편광 세포의 비율에 대한 통계의 디스플레이를 확인합니다 (%는 정문).
   참고 : 우리는 13 아래 원형 인덱스 값이 게이트를 설정했습니다.
10. 세포에서 액틴 염색 편광보고하기 위하여, HLA-ABC 염색 (채널 2) 및 팔로이 딘 염색을 비교 밝은 세부 비슷한 R3 값에 대한 히스토그램을 플롯 (채널 4).
    주 :이 기능의 더 큰 값이 더 적 착색 개의 중첩이다.
11. 이전과 같은 게이팅 전략을 사용하여, 편광 액틴 염색 세포의 백분율을 나타낸다 분리 염색 비 자극 된 세포에 게이트 플롯.
12. 완료되면, MHC 클래스 I 및 팔로이 딘 염색에 함께 SD ± 모든 세포의 원형과 비슷한 인덱스의 평균값으로 편광 된 세포의 비율의 분포에 편석을 나타내는 세포의 비율은 corresp에 나타낸다onding 통계 패널.

결과

여기에서 선택된 첫 번째 예 CCL19 자극 인간 차 T 림프구의 용도에 관한 것이다. 그러나 동일한 전략은 기본 마우스 T 세포, T 세포 라인 또는 케모카인 자극에 응답하여 임의의 다른 세포 유형과 함께 사용될 수있다. 여기에 제시된 게이팅 전략 포커스 이벤트 후, 단일 세포를 선택하는 일련의 윈도우를 포함한다. (그림 1) 또는 CCL19 자극 (그림 2) T 림프구 휴식의 MHC 클래스 I...

토론

계측법, 신속하고 유익한 게이팅 전략 케모카인 자극에 의​​해 유도 된 세포 및 분자 이벤트를 분석하는 촬상 흐름의 최신 기술을 사용하는 것이 제시된다. 케모카인 자극 분극 공정 동안 서로 다른 단백질의 세포 내 분포에 의해 유도 된 세포 형태의 변화 : 하나의 실험에서, 하나는 정보의 두 가지 유형을 얻을 수있다. 흥미로운 증거가 통계적 견고성과 전체 세포 집단의 작은 부분의 분석이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis