ケモカインシグナリングにより誘導される細胞と分子分極の迅速かつ堅牢な分析

要約

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

要約

細胞は、偏光と呼ばれるプロセスで、かつ多くのタンパク質の細胞内局在を変化させることによって、彼らの丸い形状を失うことによる刺激ケモカインに応答します。古典的な画像化技術は、これらの現象を研究するために使用されてきた。しかしながら、それらは時間のかかる形態の定量化および細胞の数の染色の共局在続く多くの細胞の手動取得を必要とした。ここでは、迅速かつ強力な方法は、サイトメーターのものと顕微鏡の利点を組み合わせたイメージングフローサイトメトリー技術を用いて細胞数千からなるサンプルにこれらの現象を研究するために記載されている。 MHCクラスI分子および繊維状アクチンのためのCCL19及び染色で刺激したTリンパ球を使用して、ゲーティング戦略を同時に形状変化の程度及びCCL19シグナル伝達によって影響されるマーカーの共局在化の程度を測定するために提示されている。また、このゲーティング戦略はobservに私たちを許可E CXCL12刺激後の偏T細胞中で（フロントで）繊維状アクチンと（後方の）リン酸化されたエズリン - ラディキシンモエシン（リン酸化ERM）タンパク質の分離。 Par6 /非定型PKCシグナル伝達経路の変異体の薬理学的阻害剤と式でアクチン重合の阻害：この手法は、2つの異なる要素の偏光に遮断効果を観察することが有用であった。したがって、証拠は、この技術は、形態学的変化およびタンパク質の再分配の両方を分析するのに有用であることが示されている。

概要

ケモカインは、特殊な場所¹に細胞を引き付ける小さな可溶性タンパク質である。したがって、それらは、組織中の細胞の正確な位置決め、発達および生理学において重要な機能に関与する。それは効果的な免疫応答を協調して作用する多くの異なる細胞型の作用に依存して、免疫系は、この規則の例外ではない。外来抗原が検出され、中和され得る前に、所定の状態でつの免疫細胞型の特定の位置を制御することによって、ケモカインは、予め求められている。

特に、Tリンパ球において、ケモカインは、T細胞の運動^2,3を支持^し係合すると、多くの細胞内シグナルを誘発する、特異的な表面受容体（カルシウム上昇、ERKリン酸化のRho GTPアーゼ活性化、インテグリン親和性および細胞骨格の変化の増加）に結合する。細胞レベルでは、人は、ケモカイン刺激により誘発される形態学的変化を観察することができる。細胞形状の変化はT細胞に特に劇的である：血流中に移動するとき、休止T細胞は、ビーズ状の丸い形態を持っている。前方に前縁しかしながら、炎症部位において又はリンパ系器官の近傍でのケモカインの存在の検出は、現在のバイポーラ形からなる典型的な「ハンドミラー」形態を採用するT細胞の形状を変更しようとしているそしてバック⁴で立ち下がりエッジ、または腹肢、。また、細胞内成分は、マイグレーションを維持するために、偏T細胞のこれらの二つの対向領域に分離することができる。例えば、ケモカイン刺激⁵と重合アクチン時アクチンフィラメントの重合増加が偏T細胞²の前面に蓄積する。一方、皮質F-アクチン細胞骨格を血漿膜にリンクエズリン - ラジキシン、モエシン（ERM）ファミリーのリン酸化タンパク質のようないくつかのタンパク質は、偏光の腹肢に再局在化するT細胞を^6。興味深いことに、本発明者らおよび他のこの分極処理は、T細胞の遊走に必要とされることを示した。確かに、偏光と干渉する任意の治療は、細胞の運動性を阻害します。例えば非定型プロテインキナーゼC（PKC）ファミリー、PKCζおよびPKCιブロックT細胞分極および樹状細胞⁷のそれらの遊走スキャン処理のメンバーの活性の阻害。 T細胞の分極ものRho GTPアーゼによって調節される。我々は、最近記載Fam65bタンパク質によるRhoAの活性の調節は、T細胞の形態の変化及びトランスウェルアッセイ⁶中を移動する能力を妨害することを示している。分極は、細胞の運動性の前提条件のステップであるとして、それはケモカイン応答の主要な読み出しとして定量化することができるようにすることが重要である。細胞形状の変化は、以前に手動⁸を測定した。しかし、定量化のこの種は、非常に時間のかかるであり、その通常は数そう細胞の数が考慮される。

ここでは、新たな方法を迅速にケモカイン刺激にさらされるTリンパ球の形状変化の度合いを定量化するために提示される。イメージングフローサイトメトリー技術（ 具体的な試薬/機器の表を参照）、フローサイトメーターの利点を組み合わせた、使用され、ケモカイン刺激の異なる条件で効率的に偏光した細胞の量を定量する顕微鏡^9。一つは、この技術でロバスト測定できる形態変化の定量化に加えて、ケモカインシグナリングの際にいくつかのタンパク質の細胞内局在の変化を評価することも可能である。

プロトコル

Tリンパ球の調製

1. ^10,11を説明したように一次マウスまたはヒトT細胞を準備します。
2. 3×10 ⁶細胞/ mlの- 2の密度で、10％ヒト血清ABを含む完全RPMI培地中のヒトT細胞を養う。
   注：代わりに、ヒト血清のウシ胎児血清（FCS）を使用すると、培養中のヒトT細胞の大部分の自発分極を誘発することができる。 4培養におけるこれらの細胞を維持 - 5日、さらに、この期間中にいつでもそれらを処理。
3. 類似の細胞密度で、10％FCSを補充した完全RPMI培地中でマウスT細胞を維持する。 10ng / mlのIL7の存在下で、37℃でO / N培養した後、次の日すぐに使用するか。
4. 完全RPMI中CEMヒトT細胞株を育成10％FCSを補充した。

2.ケモカイン刺激

1. 10 mMのHEPEを補足した暖かいHBSS培地で実験条件あたり5×10 ⁵細胞を洗浄S。いくつかの実験のために、2μgのpmaxGFP及び8μgのをpcDNA3.1 ^+（空ベクター対照）、デッドPKCζキナーゼ、またはN末端​​Par6プラスミドで前日初代ヒトT細胞を共トランスフェクトする。
2. 温かいHBSS-Hepes緩衝培地中で細胞ペレットを再懸濁し（実験条件0.3mlのxの番号を使用する）。
3. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を配布します。
   注：したがって、単一の実験条件に対応する1管は0.3ミリリットルHBSS-HEPES培地中で5×10 ^5個の細胞が含まれています。いくつかの実験では、500 nMのラトランクリンAまたは媒体（DMSO）を追加し、ケモカイン刺激の前に30分間細胞をインキュベート。
4. 各チューブに10から500 / mlのCCL19またはCXCL12ケモカインを追加します。
   注： - ヒトT細胞のための200 / mlのケモカイン我々は通常、10を使用しています。 CEM細胞は、CCL19に結合するCCR7受容体を発現しない。そのため、CEM細胞だけCXCL12刺激に反応することができるようになります。 500 n - でまた、より高いケモカ​​イン濃度（300を使用グラム/ ml）をマウスのT細胞を分極する。
5. チューブを数回反転し、それぞれ、一次T細胞またはCEM 8または10分間37℃の水浴中でそれらを培養する。
6. 各チューブに2％パラホルムアルデヒド（PFA）及びPBS中10mMのHepesを含む温かい溶液0.3mlを加えて分極処理を停止する。チューブを反転し、5分間37℃でそれらをインキュベートする。

3.染色は

1. チューブフローサイトメトリーマイクロチューブから細胞を転送します。
2. 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.5mMのEDTA、PBS中の10mMのHepesを含むRT溶液で完全にチューブを埋める。
3. 4分間460×gでチューブを遠心。
4. 上清を捨て、PBS中の5％FCSを含有するRT溶液100μlで細胞を懸濁します。
5. 離れて光から、渦それらを、各チューブに、FITC抗HLA-ABCの5μl加えて、室温で30分間、それらをインキュベートする。
6. PBSで5％FCS、Aを含むで細胞を1回洗浄する一度PBSでのみND。
7. RTで：1％のBSA、0.5mMのEDTA、PBS中10mMのHEPESを含む溶液で細胞を洗浄し、10分間インキュベートし、500μlの1％PFAを加える。
8. 上清を捨て、0.2％BSA、0.1％サポニン、0.5mMのEDTAおよび10mMのHepes（透過化緩衝液）を含むPBS溶液で完全にチューブを埋める。
9. この培地中で細胞を2回洗浄する。
10. 培地を除去し、細胞ペレットを解離するためにそれらをボルテックスするチューブを裏返し。
11. 、各チューブに抗P-ERMの抗体の100倍希釈渦にそれらを、室温で30分間インキュベート：0.25 / mlのTRITCファロイジンおよび/または1を追加します。
12. 透過化バッファーで細胞を洗浄。必要に応じて、蛍光二次抗体とインキュベートします。
13. 200μlのPBSに細胞を再懸濁し、マイクロチューブに転送。
    注：細胞を取得するための準備ができている。また、チューブあたり200μlの最大総量を維持しながら、最終的に1％に濃縮されたPFAを追加細胞は、さらなる処理のために同じ日に使用されるべきではない場合染色を保存するために集中。

4.イメージの取得と分析

1. 装置のスイッチを入れ（ 特定の試薬​​/機器の表を参照）、それはメーカーの指示に従って、それ自体を校正しましょう。
   NOTE：INSPIREソフトウェアは対物レンズ40倍（0.75 NA）で使用した。 IDEAS 3.0ソフトウェアは、報告されたすべての定量化のために使用された。
2. 将来の実験のためのテンプレートに保存することができます取得一連のウィンドウを準備します。 RMS勾配値を定量化ヒストグラムを描画します。 RMS勾配ヒストグラム上で選択し「フォーカスでは「集団から、エリアのヒストグラムの「単一セル」の人口をdelimitate。マイクロ遠心チューブが機械内に挿入された後、個々の細胞上にゲートをレーザーパワーを調整し、5000 Tリンパ球を取得する。
3. アイデアでソフトウェアは、取得ファイルを開き、個々のセルに対して得られた明視野画像（チャンネル1）のための勾配RMS値の値が表示されたヒストグラムを作成します。 57より上のRMSの勾配値を示す細胞を考慮RMS勾配ヒストグラムにゲートを描きます。
   注：RMS勾配分析において考慮焦点面内にある唯一のTリンパ球を取ることができる。我々は、57よりも優れたRMS勾配値を示す個々の細胞を焦点面にあり、正確に考慮することができることを実験的に決定している。
4. 解析/マスクは、メニューでは、2画素の侵食された明視野画像M01、上の形態学のマスクから（M01,2）を侵食すると呼ばれる、新しいマスクを作成します。その後、分析に/むしばむ（M01,2）マスク上の計算されたエリアの新機能を、作成し、メニューを用意しています。前のゲートに選択された細胞から、この新しく作成されたマスクを使用してセルの面積を示すヒストグラムを開きます。
   注：によって利用可能な形態学マスクデフォルトでは、セルの実際のサイズよりもはるかに大きいです。これにより、2ピクセルにそれを侵食することがより正確である。
5. キャリブレーションビーズや破片（小エリア）とダブレット（大面積）を除く、個々のT細胞上にゲートを描きます。各取得時にこのゲートを調整します。
   注：セルサイズの変動は、ゲートの位置に影響を与える。マウスT細胞はCEM細胞より小さい自体、ヒトT細胞よりも小さいように、各細胞型の領域は、その大きさに比例する。
6. 前のステップでゲートしたシングル、焦点の合った細胞を考慮すると、ファロイジンでのRAWマックス·ピクセルの関数として、HLA-ABC染色に直接上限·ピクセルからなるドットプロット（チャネル2、X軸）を開く染色（チャンネル4、Y軸）。無染色または飽和蛍光イベントを除外するためにゲートを作成します。 HLA-ABC（チャネル2）とファロイジン（チャンネル4）染色のために直接上限画素を示すオー​​プンつのヒストグラム。
7. 解析/マスクメニュー、レコード生成で2画素の浸食HLA-ABC染色細胞（チャネル2）の形態のマスクから（M02,2）をむしばむと呼ばれるEA新しいマスク、、。その後、分析に/むしばむ（M02,2）で計算真円度パラメータからなる​​新しい機能を作成し、メニューを用意しています。
   注：このパラメータは、円からの細胞形状の偏差を測定します。したがって、完全に丸いT細胞は、低円形度を示すことになる細長い極性細胞に対し高い真円度値を有する。
8. その後、以前にゲート細胞から円形の特徴の値を報告します別のヒストグラムを作成します。個々のセルのための円形度の値に応じて合焦細胞集団、直接個々の分布をプロットするために、このヒストグラムを使用する。
9. 非刺激細胞のためにヒストグラムの形状を見ると、極性細胞のためにゲートを描き、非刺激細胞のほとんどの真円度の限界値まで最低の真円度の値で始まるプロットされている。ゲーテッド人口（％はゲートで囲われた）の間で偏細胞の割合の統計表示を見てください。
   注：我々は、13以下の円形度指数値のため、このゲートを設定している。
10. 細胞内のアクチン染色の偏光を見るために、HLA-ABC染色（チャネル2）およびファロイジン染色を比較し、明るい詳細類似R3の値のヒストグラムをプロット（チャンネル4）。
    注：この大きな特徴の値は、二以上の染色である重畳。
11. 前と同じゲート戦略を使用して、偏アクチン染色を有する細胞のパーセンテージを示す分離された染色のための非刺激細胞上にゲートをプロットする。
12. 完了すると、MHCクラスIおよびファロイジン染色、偏光された細胞の割合の分布に偏析を示す細胞のパーセンテージは平均±SD、全てのセルの真円度と類似度指標の平均値をcorrespに示されていると共にonding統計パネル。

結果

ここで選択された最初の例では、CCL19で刺激したヒト一次Tリンパ球の使用に関する。しかし、同じ戦略は、初代マウスT細胞、T細胞株またはケモカイン刺激に応答する任意の他の細胞型で使用することができる。ここで紹介するゲーティング戦略は集中イベント、単一のセルを選択一連のウィンドウが含まれています。 （ 図1）またはCCL19刺激された（ 図2）Tリンパ?...

ディスカッション

イメージングフローサイトメトリーの最近の技術を使用して、ケモカイン刺激によって誘発される細胞および分子事象を分析するための迅速かつ有益なゲーティング戦略が提示されている。ケモカイン刺激及び分極プロセス中の異なるタンパク質の細胞内分布によって誘導される細胞形態の変化：単一の実験から、人は情報の2つの主要なタイプを得ることができる。興味深いことに、証拠は...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis