Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Resumen

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Resumen

El objetivo del análisis fluorométrico es servir como un costo efectivo, método rendimiento eficiente, de alta de analizar la fagocitosis y otros procesos celulares. Esta técnica se puede utilizar en una variedad de tipos de células, tanto adherentes y no adherentes, para examinar una variedad de propiedades celulares. Al estudiar la fagocitosis, la técnica fluorométrica utiliza tipos de células fagocíticas tales como macrófagos, y las partículas opsonizadas marcados con fluorescencia, cuya fluorescencia se puede extinguir en presencia de azul de tripano. Después de chapado de macrófagos adherentes en placas de 96 pocillos, partículas fluorescentes (verde o rojo) se administran y las células se les permite fagocitar por cantidades variadas de tiempo. Después de la internalización de las partículas fluorescentes, las células se lavan con azul de tripano, lo que facilita la extinción de la señal fluorescente a partir de bacterias que no se internalizan, o son simplemente se adhieren a la superficie de la célula. A continuación del lavado de tripano, las células se lavaron con PBS, se fijaron, unand teñidas con DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que sirve para etiquetar núcleos de las células. Por una sencilla cuantificación fluorométrico través de la lectura de la placa nuclear (azul) o de partículas (verde / rojo) de fluorescencia que puede examinar la relación de unidades relativas de fluorescencia de color verde azul y determinar un índice de fagocitosis indicativo de la cantidad de bacterias fluorescentes internalizadas por célula. La duración del ensayo utilizando un método y multicanal 96 pocillos pipetas para el lavado, desde el extremo de la fagocitosis hasta el final de la adquisición de datos, es menos de 45 min. La citometría de flujo podría ser utilizado de una manera similar pero la ventaja de fluorometría es su alto rendimiento, rápido método de evaluación con una mínima manipulación de las muestras y cuantificación rápida de intensidad de fluorescencia por célula. Estrategias similares se pueden aplicar a las células no adherentes, bacterias marcadas en vivo, la polimerización de actina, y esencialmente cualquier proceso que utiliza fluorescencia. Por lo tanto, fluorometría es un método prometedor para su bajo costo, alta throughpcapacidades ut en el estudio de procesos celulares.

Introducción

La cuantificación de la señal fluorescente ha sido ampliamente utilizado en una multitud de métodos científicos que van desde PCR, citometría de flujo, microscopía confocal, y el análisis FRET para multiplexar ELISA. Imágenes de fluorescencia y cuantificación tiene una amplia aplicación y puede ser una gran herramienta para el análisis cuantitativo de diversos procesos celulares. El uso de marcadores fluorescentes y su señal se ha revolucionado en la última década, y la aparición de lectores de placas fluorescentes ha facilitado la cuantificación de alto rendimiento de la fluorescencia emitida durante los procesos celulares.

Análisis Fluorométrico puede servir como una gran herramienta en la cuantificación de la fagocitosis. La fagocitosis se ha estudiado desde el descubrimiento de los fagocitos por Metchnikoff en 1800 ^1. A través de los años, una variedad de métodos se han utilizado para examinar este importante proceso esencial para la defensa inmune innata contra la invasión bacteriana, viral, fúngica y parásitos patógenos ^2-5. Los métodos anteriores de cuantificación utilizado técnicas de microscopía y estereológicos el fin de visualizar las células que se phagocytosing, que luego se cuantificó por recuento de partículas internalizadas (manualmente o con el uso de software) ^6-8. Algunas desventajas en el uso de microscopía solo para el análisis cuantitativo son que el recuento manual de las bacterias es una labor intensiva y más propenso a sesgo del observador. Otro método utilizado en la cuantificación de la fagocitosis es la técnica microbiológica de chapado de bacterias de lisados ​​celulares (siguientes fagocitosis) en placas de cultivo de bacterias, pero este método puede fallar para dar cuenta de los mecanismos bactericidas y presencia de bacterias parcialmente internalizadas. Este método es intensivo incluso más mano de obra en comparación con la microscopía y lleva varios días para analizar. La citometría de flujo parece ser la forma más rápida, más eficaz para cuantificar la fagocitosis y ha sido utilizado por muchos grupos de ^9-11, pero el alto costo asociado comúnmente con el eninstrumento necesario para el análisis hace que sea el método más caro en comparación con los ensayos mencionados anteriormente.

El método fluorométrico es una buena alternativa a la citometría de flujo para el análisis de la internalización de partículas, ya que ofrece la cuantificación insesgada de fluorescencia utilizando equipo que no es tan costo prohibitivo. Otros beneficios añadidos de fluorometría son de alta eficiencia, y las capacidades de alto rendimiento para la cuantificación de la fluorescencia emitida por las partículas internalizadas etiquetados.

Beneficios de la fluorometría pueden extrapolarse a la cuantificación de los procesos distintos de la fagocitosis. Por ejemplo, el análisis fluorométrico se puede aplicar para estudiar cualquier proceso que conduce a cambios en la expresión intracelular o de receptores unidos a membrana, los cambios en la permeabilidad celular / viabilidad, la eficacia de la transfección, y la modulación en la polimerización de actina. Una desventaja de la técnica fluorométrica es que, dependiendo de las etiquetas utilizadas, puede haber un altoexperimento para experimentar la variabilidad que por lo general puede ser resuelto mediante la demostración de los datos a través de la cuantificación relativa, como el cambio veces o por ciento de aumento de control.

Protocolo

NOTA: Este protocolo se puede utilizar para múltiples aplicaciones tales como la cuantificación de la polimerización de la fagocitosis y la actina, como se usa en nuestro trabajo publicado previamente ^12. El protocolo se presta a una variedad de modificación, y los tipos Tabla 1 listas de células y partículas utilizado con éxito en estudios anteriores. Uso estándar de este protocolo para la cuantificación de la polimerización fagocitosis o actina se ilustra en el diagrama 1.

Diagrama 1:. Diagrama de ensayo fluorométrico para la cuantificación de la polimerización de actina Después de la fagocitosis y las células se sembraron, se trata y se dejaron adherir, partículas marcadas con fluorescencia verde (FITC) se añaden a las células durante la fagocitosis. La reacción se detiene por tripano o antibilavado ótico (para eliminar las partículas no internalizadas) y la fijación se realiza con 4% de paraformaldehído. Las células son posteriormente teñidas con etiqueta de color rojo fluorescente actina (rodamina phalloidin) y marcador fluorescente azul (DAPI). Índices de la fagocitosis y la polimerización de actina se cuantifican como una relación de unidades relativas de fluorescencia de verde / azul (FITC / DAPI) o azul (rodamina / DAPI) fluorescencia roja /.

1. Chapado y Pilas de Tratamiento

NOTA: Antes de comenzar, considere la posibilidad de ejecutar los tratamientos con al menos 4 repeticiones técnica, e incluyen los siguientes controles en el diseño de la placa: sólo las células (sin manchas, con DAPI solo o rodamina solo) y de partículas solamente.

1. Llevar a cabo todas adición de reactivos en los pasos 1-4 en una campana de cultivo celular estéril con el fin de proteger las muestras de la contaminación.
2. Macrófagos placa (línea celular murina J774) en una placa de 96 pocillos a 1-5 x 10 ⁴ células en 50 l (por pocillo) de los medios de comunicación complementado precalentado. Placas ideales para este método son placas de 96 pocillos de color negro con fondos transparentes o negro, dependiendo de las capacidades del lector.
   1. Por medio suplementado, utilizar 10% FBS inactivado por calor para evitar la interferencia de la cascada del complemento, y 1% de penicilina / estreptomicina (si no se utiliza bacterias vivas para la fagocitosis). Si se utilizan células adherentes permiten 1-2 horas para la adhesión, y para las células no adherentes, girar hacia abajo la placa con las células durante 10 min a 500 x g.
3. Añadir deseados agonistas / antagonistas o vehículo de control a una concentración 2x ​​(resuspendieron en PBS o más preferiblemente, en medio suplementado) en 50 l para un volumen final de 100 l (1x) y se incuba durante una cantidad de tiempo deseado. Pipeta multicanal y reactivos embalses facilitar el procesamiento más rápido.

2. Opsonización de partículas fluorescentes

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Tabla 1: Probado tipos de células y partículas fluorescentes en el análisis fluorométrico de la Tabla 1 ilustra combinaciones de tipos de células (líneas celulares, y células primarias) que nuestro grupo ha utilizado a través del método fluorométrico la fagocitosis y la polimerización de actina.. Además de observar la fagocitosis y la polimerización de actina por células de tipo salvaje, también hemos utilizado algunas de estas partículas para el examen de la fagocitosis por las células transfectadas que expresan un GFP (proteína fluorescente verde). La fluorescencia de las células transfectadas con plásmidos que contienen los reporteros fluorescentes también se puede utilizar como un marcador celular además de DAPI leyenda de la tabla:. A - polimerización de la actina; P - fagocitosis; PT - fagocitosis por células transfectadas GFP marcado; OPDex - opsonizado cordón de dextrano; HKOP - calor mató opsonizó.

1. Asegúrese de que las partículas fluorescentes y etiquetas se protegen de la luz en todo momento, during tratamiento, el lavado, así como durante la incubación con el fin de evitar photobleaching
   1. Para partículas secas, pesar bacterias calor fluorescente muertos opsonizadas (HKOP) (E2861: E. coli K-12 cepa), utilizando las especificaciones del fabricante. Tenga cuidado para asegurarse de que las cuentas de masas de 10: 1 a 20: 1 bacterias: proporción de células (o al menos una proporción de 10: 1 - comúnmente utilizado en la cuantificación de la fagocitosis) ^13,14. Número de partículas puede ser proporcionado por el fabricante o determinarse mediante couting diluciones en serie de 1 mg solución / ml.
   2. Resuspender en 50 l de PBS y agitar durante 1 minuto en la posición más alta. Asegurar vórtex adecuada (aquí y en todo el protocolo) como las partículas tienden a agregarse que pueden afectar a la eficacia de opsonización.
   3. Para las partículas en suspensión tales como perlas de dextrano marcados con fluorescencia (cuentas DEX), vórtice la solución madre de 1 min, tomar 50 l de suspensión o dependiendo de la concentración del talón en el volumen dmontaje etermine de cuentas para facilitar 10: 1 del grano: proporción de células.
2. Añadir un volumen igual de reactivo de opsonización de las partículas y agitar vigorosamente durante otro minuto.
3. Se incuban las partículas con opsonizantes reactivo a 37 ° C durante 1 hora.
4. Después de la incubación, centrifugar las partículas durante 5 min a 500 xg, y retire el sobrenadante que contiene exceso de reactivo opsonizante. Lavar las partículas mediante la adición de 100 l de PBS, vórtice para resuspender el pellet, y centrifugado durante 5 min a 500 x g.
   1. Repita estos pasos dos veces para asegurar la opsonización y eliminación de anticuerpo no unido adecuada.
5. Preparar la solución de trabajo de partículas opsonizadas por resuspensión en 5 ml de medio (suficiente para una placa de 96 pocillos) y almacenar lejos de la luz hasta la adición a las células.

3. La fagocitosis

1. Coloque la solución de trabajo de partículas en un depósito de reactivo estéril. Desde aquí, añadir 5056; l de partículas opsonizadas a las células preparadas en el paso 1 (para una concentración final de 50 ng / ml) y dejar que se produzca la fagocitosis en condiciones de cultivo celular estándar. A continuación se ilustran dos métodos de fagocitosis que se pueden evaluar mediante este método (Diagrama 2).

Diagrama 2:. Comparación de la continua versus sincronizar la fagocitosis fagocitosis continuas indica internalización continua de partículas con el tiempo a medida que lentamente llegar a las células en la parte inferior del pozo. Un paso de sincronización de contraste (centrifugación) obliga a que las partículas se hunden hasta el fondo, mejorando el contacto de las partículas con la célula, y lleva a la internalización inmediata por las células. Fagocitosis sincronizada es un proceso más rápido que interioriza más rápidamente parteicles debido al aumento de células: el contacto de las partículas.

1. 1. Para el método de la fagocitosis continua (Diagrama 2) que permiten a las células fagocitan las bacterias opsonizadas continuamente a medida que lentamente se hunden hasta el fondo y entran en contacto con las células, utilizan marcos de tiempo más largos para permitir que las bacterias alcanzan la parte inferior del pozo y obtener en tocar con las células. Si la realización de un experimento de transcurso de tiempo, añadir bacterias a diferentes intervalos de tiempo y detener toda la placa de reacciones al mismo tiempo para mejorar la velocidad de procesamiento.
   2. Para el método sincronizado fagocitosis (Diagrama 2) que mejora la partícula: el contacto célula a través de centrifugación, de girar toda la placa que contiene las células y partículas (5 min a 500 xg) tan pronto como se añaden las partículas, para facilitar la sincronización de todos los puntos de tiempo y para acelerar la partícula: interacción celular.
      1. Mida el curso de tiempo a partir justo después de la finalización de la centripaso fugation. Si la realización de un experimento de curso de tiempo, detener cada punto de tiempo independientemente en diferentes intervalos de tiempo como se describe a continuación.

NOTA: El método de la fagocitosis sincronizada es algo más laborioso de la anterior, pero proporciona mayor índice fagocítico en un tiempo más corto.

4. La fagocitosis Detención

1. Para las células adherentes, eliminar el sobrenadante y añadir 50 l de azul de tripano diluido con PBS (dilución 1: 2), con el fin de extinguir la fluorescencia de las bacterias no internalizadas.
2. Para las células no adherentes, de girar la placa y eliminar el sobrenadante. Añadir 50 l de azul de tripano diluida. Asegúrese de centrifugar la placa a (5-10 min a 500 xg) entre cada lavado a fin de minimizar la pérdida de células y permitir un lavado adecuado.
3. Después de la incubación de tripano, lavar las células dos veces con PBS para eliminar cualquier tripano residual (hasta que el PBS retira del pozo se vuelve clara). Trypan se ha demostrado que apagar la fluorescencia ^15,16 de calor mató, partículas bacterianas no internalizados marcado con fluorescencia, pero no para las bacterias vivas o perlas OPDex. Para bacterias vivas, incluir un lavado con antibióticos tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina o en lugar del lavado de tripano para evitar efectos de confusión de la fluorescencia de las partículas no internalizadas.
4. Fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 4%, y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente, a continuación, lavar con PBS (a 100 l por pocillo para cada lavado). En este paso, salvar a las células a 4 ° C durante un máximo de una semana, o ir directamente a la tinción y cuantificación.
   NOTA: Todos los pasos posteriores forman este punto prólogo se puede hacer fuera de la campana de cultivo celular.
5. Quite todo el líquido y añadir 50 l de DAPI a 5 ng / ml reconstituido en PBS. Permitir 5 min para la tinción, y lavar dos veces con PBS. Después de la etapa de lavado, se añaden 50 l de PBS a cada fagocitosis bien y registro.

5. La actina tinción

NOTA: Además de la fagocitosis, el método fluorométrico permitirá la cuantificación de la polimerización de actina mediante la medición de la intensidad de la actina, que se reduce durante la inhibición de lamellipodia, pseudopodiae, y la membrana plasmática como resultado de tratamiento con un inhibidor (Figura 1A). Este es un paso opcional si está interesado en la cuantificación de la polimerización de actina, además de la fagocitosis. Si la polimerización de actina es la meta final, utilizando partículas fluorescentes para la fagocitosis es opcional.

1. Después de la fijación de paraformaldehído (paso 4.3), lavar la placa dos veces con PBS a 100 l por pocillo para cada lavado. Añadir 50 l de 0,1% de Triton X-100 en PBS para la permeabilización e incubar durante -5 min a TA.
2. Lave 0,1% de Triton X-100 2 veces con PBS (como anteriormente), y bloquear con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 20 min para evitar la unión no específica de la label.
3. Después del bloqueo, retire la solución de BSA y añadir inmediatamente rodamina phalloidin. Para preparar la solución de trabajo de tinción de rodamina, utilice 100 l de solución de metanoico (proporcionado por el fabricante) en 5 ml de PBS (suficiente para una placa). De la solución de trabajo añadir 50 l por pocillo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Después de las etapas de lavado y tinción DAPI como en el paso 4.4 células estará listo para su cuantificación.

6. Cuantificación

1. Para cuantificar la fagocitosis usando un lector de placas fluorescente, la fluorescencia verde registro usando el filtro de excitación a λ = 488 nm y filtro de emisión de fluorescencia a λ = 518 nm, y azul usando el filtro de excitación a λ = 355 nm y filtro de emisión a λ = 460 nm.
2. Para cuantificar la polimerización de la actina usando un lector de placas fluorescente, la fluorescencia azul registro a través de λ = 355 nm y λ = 460 nm (como anteriormente), y rojo de la gripeorescence a través de filtro de excitación a λ = 584 nm y filtro de emisión λ = 620 nm.
   NOTA: Orbital o detección central es aceptable para la grabación. Algunos tipos de células se reúnen más hasta el borde del pozo que el centro, en el que la grabación orbital caso puede ser ventajoso. En particular, promedio de tres puntos alrededor de la órbita también podría ser usada para obtener resultados más precisos.
3. Divida la RFU total de fluorescencia verde o roja por lectura de fluorescencia azul (de DAPI), dependiendo de la etiqueta de partículas o fagocítica vs. cuantificación actina (Diagrama 1). Debido a la alta variación de placa a placa, utilizar índices relativos (tales como relativa a t = 0 control), para ilustrar mejor las tendencias observadas y para facilitar el análisis estadístico más fiable.

Resultados

Dos de las principales formas de cuantificar la fagocitosis y la polimerización de la actina posterior a través de la utilización de este protocolo es observar la fagocitosis continuo o sincronizado.

El análisis microscópico (Figura 1B) ilustra imágenes fluorescentes comparables a lo que está grabando el fluorómetro (también ver Diagrama 1). En la Figura 1B son fluorescencia roja de actina, verde 268 de fluorescencia de FITC etiquet...

Discusión

Las principales limitaciones de la técnica fluorométrica son varianza experimental, así como la pérdida de células asociada con un lavado extensivo y el uso de células no adherentes.

Varianza se observa en gran parte debido a la variación en partículas fluorescentes como pesaje y de pipeteado durante la preparación de la solución madre no es una manera exacta de mantener números idénticos de partículas de experimento a experimento. Para abordar el problema de la varianza entre l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use
Fluorescent plate reader - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96-well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom - black plates
Multichannel pipette (8 - 12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)