Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Resumo

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Resumo

O objectivo da análise fluorométrico é para servir como um custo eficaz, eficiente método de transferência, a análise de alta fagocitose e outros processos celulares. Esta técnica pode ser usada em uma variedade de tipos de células, tanto aderentes e não aderentes, para analisar uma variedade de propriedades celulares. Ao estudar a fagocitose, a técnica utiliza fluorométrico tipos de células fagocíticas, tais como macrófagos, e partículas opsonizadas marcados com fluorescência cuja fluorescência pode ser extinto na presença de azul de tripano. Após plaqueamento de macrófagos aderentes em placas de 96 poços, as partículas fluorescentes (verde ou vermelha) são administrados e células são deixadas a fagocitose por montantes variados de tempo. Após internalização de partículas fluorescentes, as células são lavadas com azul de tripano, a qual facilita a extinção do sinal de fluorescência a partir de bactérias que não são internalizadas, ou são apenas aderem à superfície da célula. Após a lavagem de tripano, as células são lavadas com PBS, fixadas, umand coradas com DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que serve para etiquetar os núcleos de células. Por uma quantificação fluorometric simples através de leitura de placas de nuclear (azul) ou partícula (verde / azul) fluorescência podemos examinar a proporção de unidades de fluorescência relativa de verde: azul e determinar um índice fagocitário indicativo de quantidade de bactérias fluorescentes internalizadas por célula. A duração do ensaio utilizando um método e multicanal 96 poços pipetas para a lavagem, a partir da extremidade de fagocitose ao fim de aquisição de dados, é inferior a 45 min. A citometria de fluxo pode ser usado de uma maneira semelhante mas a vantagem de fluorometria é o seu elevado rendimento, o método de avaliação rápida com o mínimo de manipulação de amostras rápida e quantificação da intensidade de fluorescência por célula. Estratégias similares podem ser aplicados para as células não aderentes, as bactérias marcadas vivo, a polimerização da actina, e essencialmente qualquer processo utilizando fluorescência. Portanto, fluorometria é um método promissor para o seu baixo custo, alta throughpcapacidades ut no estudo de processos celulares.

Introdução

Quantificação do sinal fluorescente tem sido amplamente utilizado em uma infinidade de métodos científicos que vão de PCR, citometria de fluxo, microscopia confocal, e se aflige análise multiplex ELISA. Imagens de fluorescência e quantificação tem uma ampla aplicação e pode ser uma ótima ferramenta para análise quantitativa de vários processos celulares. A utilização de marcadores fluorescentes e o seu sinal foi revolucionada na última década, e aparecimento de leitores de placas fluorescentes facilitou a elevada taxa de transferência de quantificação de fluorescência emitida durante processos celulares.

Análise Fluorometric pode servir como uma grande ferramenta na quantificação de fagocitose. A fagocitose tem sido estudada desde a descoberta dos fagócitos por Metchnikoff em 1800 ^1. Ao longo dos anos, uma grande variedade de métodos têm sido utilizados para examinar este processo importante essenciais para a defesa imune inata contra a invasão bacteriana, virai, fúngica e parasitas patogénicos ^2-5. Os métodos anteriores de microscopia de quantificação utilizados e técnicas de estereologia, a fim de visualizar as células que são fagocitando, que foram, então, quantificada por contagem de partículas internalizadas (manualmente ou com o uso de software) ^6-8. Algumas desvantagens de usar microscopia sozinho para análise quantitativa são de que a contagem manual de bactérias é um trabalho intensivo e mais propenso a viés do observador. Outro método utilizado na quantificação da fagocitose é a técnica microbiológica de chapeamento de bactérias a partir de lisados ​​celulares (após fagocitose) em placas de cultura de bactérias, mas este método pode não têm em conta os mecanismos de bactericidas e presença de bactérias parcialmente internalizados. Este método é ainda mais trabalhosa em comparação com microscopia e demora vários dias a analisar. A citometria de fluxo parece ser a forma mais rápida e mais eficaz para quantificar a fagocitose e tem sido utilizado por vários grupos de ^9-11, mas o custo elevado comumente associada com o nostrument necessários para a análise faz com que seja o método mais caros quando comparados com os ensaios mencionados anteriormente.

O método fluorometric é uma boa alternativa para a citometria de fluxo para análise de partículas internalização uma vez que oferece quantificação imparcial de fluorescência usando equipamento que não é tão custo proibitivo. Outros benefícios adicionais de fluorometria são de alta eficiência, e recursos de alto rendimento para quantificar fluorescência emitida pelas partículas internalizados marcados.

Benefícios de fluorometria pode ser extrapolada para a quantificação de outros processos de fagocitose. Por exemplo, a análise fluorométrico pode ser aplicada ao estudo de qualquer processo que conduza a alterações na expressão intracelular ou de receptores ligados a membranas, as alterações na permeabilidade celular / viabilidade, a eficácia de transfecção, e modulação em polimerização da actina. Uma desvantagem da técnica fluorométrico é que, dependendo das etiquetas utilizadas, pode haver um elevadoexperiência para experiência variabilidade que normalmente pode ser resolvido através da demonstração de dados por meio de quantificação relativa, como a mudança vezes ou por cento de aumento do controle.

Protocolo

NOTA: Este protocolo pode ser utilizado para várias aplicações, tais como a quantificação de fagocitose e actina de polimerização tal como utilizado no nosso trabalho previamente publicado ^12. O protocolo presta-se a uma variedade de modificações, e tipos Tabela 1 apresenta a lista de células e partículas utilizado com sucesso em estudos anteriores. Uso padrão deste protocolo para a quantificação de fagocitose ou actina polimerização é ilustrado no diagrama 1.

Diagrama 1:. Diagrama de ensaio fluorométrico para a quantificação de fagocitose e a polimerização da actina Depois as células são plaqueadas, tratada, e deixou-se aderir, partículas marcadas com fluorescência verde (FITC) são adicionados às células para a fagocitose. A reacção é parada por tripano ou antibilavagem ótica (para eliminar partículas não interiorizado) e a fixação é realizada com 4% paraformaldeído. As células são posteriormente corados com etiqueta vermelha fluorescente actina (rhodamine phalloidin) e etiqueta fluorescente azul (DAPI). Os índices de fagocitose e a polimerização da actina são quantificadas como uma proporção de unidades de fluorescência relativa de verde / azul (FITC / DAPI) ou azul (rodamina / DAPI) fluorescência / vermelho.

1. chapeamento e tratamento de células

NOTA: Antes de começar, execute os tratamentos com pelo menos 4 repetições técnicos, e incluem os seguintes controles no layout da placa: apenas células (imaculada, com DAPI sozinho ou rhodamine sozinho) e de partículas só.

1. Conduzir todo adição de reagentes nos passos 1-4 em uma capa de cultura de células estéril, a fim de proteger as amostras de contaminação.
2. Placa de macrófagos (linha de células de murino J774) em uma placa de 96 cavidades, com 1-5 x 10 células em ⁴ ul (50 por poço) suplementado meios de pré-aquecido. Pratos ideais para este método são negros placas de 96 poços com fundos transparentes ou pretos, consoante as capacidades de leitor.
   1. Por meio suplementado, utilizar 10% de FBS inactivado pelo calor a fim de evitar a interferência da cascata do complemento, e 1% de penicilina / estreptomicina (se não utilizar bactérias vivas para fagocitose). Se se trabalha com células aderentes permitir 1-2 h, para aderência, e para as células não aderentes, girar para baixo a placa com as células durante 10 min a 500 x g.
3. Adicionar desejados agonistas / antagonistas ou controlo de veículo a uma concentração 2x (ressuspensas em PBS ou, mais preferivelmente, em meio suplementado) em 50 ul, para um volume final de 100 ul (1x) e incubar durante um período de tempo desejado. Pipeta multicanal e de reagente reservatórios irá facilitar o processamento mais rápido.

2. Opsonização de partículas fluorescentes

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Tabela 1: Testado tipos de células e partículas fluorescentes em análise fluorométrico de fagocitose e a polimerização da actina Tabela 1 ilustra combinações de tipos de células (linhagens de células, e as células primárias) que o nosso grupo utilizados através do método fluorométrico.. Excepto olhando para a fagocitose e a polimerização da actina por células do tipo selvagem, que também têm utilizado algumas dessas partículas para exame de fagocitose por células transfectadas que expressam um GFP (proteína fluorescente verde). A fluorescência das células transfectadas com plasmídeos contendo repórteres fluorescentes também pode ser utilizado como um marcador celular, além de DAPI individualidades Tabela:. A - a polimerização da actina; P - fagocitose; PT - a fagocitose por células transfectadas GFP marcado; OPDex - opsonizado talão dextrano; HKOP - calor matou opsonizado.

1. Certifique-se de que as partículas fluorescentes e etiquetas são protegidos da luz em todos os momentos, during processamento, lavar roupa, bem como durante a incubação, a fim de evitar a fotodegradação
   1. Para partículas secas, pesar mortos opsonizadas (HKOP) bactérias calor fluorescente (E2861: E. coli K-12 estirpe), por meio de especificações do fabricante. Tome cuidado para se certificar de que as contas de massa para 10: 1 - 20: 1 bactérias: índice de célula (ou, pelo menos, uma proporção de 10: 1 - comumente usado na quantificação de fagocitose) ^13,14. Número de partículas pode ser fornecida pelo fabricante ou determinados através couting diluições em série da solução de reserva de 1 mg / ml.
   2. Ressuspender em 50 ul de PBS e em vórtice durante 1 minuto, a configuração mais elevada. Assegurar vórtex adequada (aqui e em todo o protocolo) que as partículas tendem a agregar o que pode afectar a eficácia de opsonização.
   3. Para as partículas em suspensão tais como pérolas de dextrano marcados com fluorescência (esferas DEX), a solução estoque de vórtice durante 1 minuto, duração de 50 ul de suspensão ou, dependendo da concentração do volume do grânulo determine monte de contas para facilitar a 10: 1 talão: índice de célula.
2. Adicionar um volume igual de reagente de opsonização de partículas e vortex vigorosamente por mais um minuto.
3. Incubam-se as partículas com opsonizantes reagente a 37 ° C durante 1 h.
4. Após a incubação, as partículas centrifugar durante 5 minutos a 500 xg, e remover o sobrenadante contendo excesso de reagente opsonizante. Lavam-se as partículas através da adição de 100 ul de PBS, vortex para ressuspender o sedimento, e centrifugado durante 5 min a 500 x g.
   1. Repita essas etapas duas vezes para assegurar opsonization adequada e remoção do anticorpo não ligado.
5. Preparar a solução de trabalho de partículas opsonizadas por ressuspensão em 5 ml de meio (suficiente para uma placa de 96 poços) e armazenar até ao abrigo da luz adição às células.

3. A fagocitose

1. Coloque a solução de trabalho de partículas em um recipiente de reagente estéril. A partir daqui, adicionar 5056; l de partículas opsonizadas para as células preparadas na etapa 1 (para uma concentração final de 50 ng / ml) e permitir que a fagocitose ocorrer em condições de cultura de células padrão. São apresentados abaixo dois métodos de fagocitose que podem ser avaliadas através deste método (Esquema 2).

Diagrama 2:. Comparação de fagocitose contínua versus fagocitose sincronizar contínua indica interiorização contínua de partículas ao longo do tempo à medida que lentamente atingir as células no fundo do poço. Um passo de sincronização contrastante (centrifugação) força as partículas de afundar para o fundo, aumentando o contacto de partícula com a célula, e que conduz à internalização imediato pelas células. Fagocitose sincronizado é um processo mais rápido que internaliza mais rapidamente parteicles devido ao aumento da célula: o contato de partículas.

1. 1. Para o método de fagocitose contínua (Diagrama 2) que permitem que as células de fagocitar bactérias opsonizados continuamente à medida que lentamente afundam para o fundo e entrar em contacto com as células, utiliza intervalos de tempo mais longos para permitir que as bactérias para atingir o fundo do poço e em contato com as células. Se a realização de uma experiência timecourse, adicionar bactérias em intervalos de tempo diferentes e parar a totalidade da placa de reacções ao mesmo tempo para aumentar a velocidade de processamento.
   2. Para o método sincronizado fagocitose (Diagrama 2) que aumenta a partícula: o contacto de células através de centrifugação, rotação para baixo toda a placa contendo as células e partículas (5 min a 500 xg), logo que as partículas são adicionadas, para facilitar a sincronização de todos os pontos de tempo e para acelerar a partícula: interação célula.
      1. Medir o curso de tempo começando logo após a conclusão do centripasso fugation. Se a realização de uma experiência ao longo do tempo, parar cada ponto de tempo, independentemente, em diferentes intervalos de tempo, como descrito abaixo.

NOTA: O método fagocitose sincronizado é um pouco mais trabalhoso do anterior, mas fornece o índice fagocitário maior em menos tempo.

4. A fagocitose Parando

1. Para as células aderentes, remover o sobrenadante e adicionar 50 ul de azul de tripano diluída com PBS (diluição 1: 2), a fim de extinguir a fluorescência das bactérias não-internalizado.
2. No caso de células não-aderentes, girar para baixo a placa e remover o sobrenadante. Adicionar 50 ul de azul de tripano diluída. Assegurar a centrifugar a placa a (5-10 minutos a 500 xg) entre cada lavagem, a fim de minimizar a perda de células e permitir a lavagem adequada.
3. Após a incubação de tripano, lavar as células duas vezes com PBS, para remover qualquer resíduo de tripano (até o PBS removido do poço ficar transparente). Trypan foi mostrado para extinguir a fluorescência de ^15,16 não internalizados marcado por fluorescência, mortas pelo calor, partículas de bactérias, mas não para as bactérias vivas ou grânulos OPDex. Para as bactérias vivos, incluem uma lavagem com antibióticos, como a penicilina, estreptomicina, gentamicina ou em vez da lavagem de tripano para evitar efeitos de confusão de fluorescência de partículas não-internalizado.
4. Fixar as células com 100 uL de paraformaldeído a 4%, e incubar durante 15 min à temperatura ambiente, em seguida lava-se com PBS (em 100 ul por poço para cada lavagem). Neste passo, salvar as células a 4 ° C durante até uma semana, ou prosseguir directamente para a coloração e quantificação.
   NOTA: Todos os passos subsequentes formar este ponto prefácio pode ser feito fora da capa de cultura de células.
5. Remover todo o líquido e adicionar 50 ul de DAPI a 5 ng / ml reconstituídos em PBS. Permitir 5 min para a coloração, e depois lave duas vezes com PBS. Após o passo de lavagem, adicionar 50 ul de PBS a cada poço e ficha fagocitose.

5. Actin Coloração

NOTA: Para além da fagocitose, método fluorométrico irá permitir a quantificação de a polimerização da actina, medindo a intensidade de actina, que é reduzida durante a inibição da lamelip�ios, pseudopodiae, e enrugamento da membrana, como resultado de tratamento com um inibidor (Figura 1A). Este é um passo opcional se interessado na quantificação da polimerização de actina em adição à fagocitose. Se a polimerização de actina é o objetivo final, utilizando partículas fluorescentes para a fagocitose é opcional.

1. A seguir à fixação paraformaldeído (passo 4.3), lavar a placa duas vezes com PBS a 100 ul por poço para cada lavagem. Adicionar 50 ul de 0,1% de Triton X-100 em PBS durante a permeabilização e incubar durante -5 minutos à temperatura ambiente.
2. Lave a 0,1% de Triton X-100 a 2 vezes com PBS (como acima), e bloquear com 1% de albumina de soro bovino (BSA) durante 20 minutos para evitar a ligação não específica do label.
3. Após o bloqueio, retire a solução BSA e adicione imediatamente rhodamine phalloidin. Para preparar a solução de trabalho de rodamina mancha, utilizar 100 ul de solução metanóico (fornecido pelo fabricante) em 5 ml de PBS (suficiente para uma placa). A partir da solução de trabalho adicionar 50 ul por cavidade e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Seguindo os passos de lavagem e coloração DAPI como no passo 4.4 células estará pronto para a quantificação.

6. Quantificação

1. Para quantificar a fagocitose usando um leitor de placas fluorescentes, ficha fluorescência verde usando filtro de excitação em λ = 488 nm e filtro de emissão de fluorescência em λ = 518 nm, e azul com filtro de excitação em λ = 355 nm e filtro de emissão em λ = 460 nm.
2. Para quantificar a polimerização de actina utilizando um leitor de placas fluorescentes, ficha azul fluorescência via λ = 355 nm e λ = 460 nm (como acima), e vermelho gripeorescence através de filtro de excitação a λ = 584 nm e filtro de emissão λ = 620 nm.
   NOTA: Orbital ou central de detecção é aceitável para a gravação. Alguns tipos de células para recolher mais a borda do poço do centro da cidade, caso em que a gravação orbital pode ser vantajosa. Em particular, a média de três pontos em torno da órbita também poderia ser usado para obter resultados mais precisos.
3. Dividir a RFU total de fluorescência verde ou vermelha por azul de leitura de fluorescência (a partir de DAPI), dependendo da etiqueta partícula ou fagocítica vs quantificação actina (Diagrama 1). Devido à alta variância placa-to-plate, use índices relativos (como em relação a T = 0 controle), para melhor ilustrar as tendências observadas e para facilitar a análise estatística mais confiável.

Resultados

Duas formas principais de quantificar a fagocitose e a subsequente polimerização da actina, através da utilização deste protocolo é de observar fagocitose contínua ou sincronizada.

A análise microscópica (Figura 1B) ilustra imagens fluorescentes comparáveis ​​ao que o fluorometer está gravando (veja também o Diagrama 1). Na Figura 1B são fluorescência vermelha de actina, verde 268 fluorescência de FITC etiquetas HKOP E...

Discussão

As principais limitações da técnica são fluorométrico de variação experimental, bem como a perda de células associadas com a lavagem e a utilização de células não-aderentes extensa.

A variação é observada em grande parte devido à variação em partículas fluorescentes como pesagem e pipetagem durante a preparação da solução não é uma maneira exata de manutenção de números idênticos de partículas de experiência para experiência. Para resolver o problema da varia?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use
Fluorescent plate reader - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96-well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom - black plates
Multichannel pipette (8 - 12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)