Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Özet

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Özet

flüorometrik analiz amacı fagositozunu ve diğer hücresel süreçleri analiz verimli, düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi olarak hizmet etmektir. Bu teknik, hücre çeşitli özelliklerini incelemek için, yapışkan ve yapışkan olmayan, her iki hücre tipinde, çeşitli kullanılabilir. Fagositozu okuyan zaman flüorometrik tekniği gibi makrofajlar ve kimin floresan tripan mavisi varlığında sönmüş olabilir floresan etiketli opsonize edilmiş parçacıklar gibi fagositik hücre tiplerini kullanır. 96 oyuklu plakalar, floresan parçacıkların (yeşil veya kırmızı) yapışkan makrofaj kaplama izlenerek tatbik edilmektedir ve hücreler, zaman çeşitli miktarlarda fagosite izin verilir. Floresan parçacıkların içselleştirme sonra hücreler içsel olmayan, ya da sadece hücre yüzeyine yapışan bakterilerden floresan sinyalin yok olmasına olanak tripan mavisi ile yıkanır. Tripan yıkamayı takiben, hücreler, sabit, PBS ile yıkanır, birnd hücrelerin çekirdekleri etiketlemek için hizmet veren DAPI (nükleer mavi floresan etiket) ile boyandı. Levha çekirdek (mavi) okunması ya da bir parçacık içinde basit bir florometrik miktar olarak (kırmızı / yeşil) floresans yeşil nispi floresan birimlerinin oranı inceleyebilir: mavi ve hücre başına içsel floresan bakteri miktarının göstergesi olan bir fagositik endeksinin belirlenmesi. yıkama için 96 çukurlu bir yöntem ve çok kanallı pipet kullanılarak tahlil süresi, veri toplama sonuna fagositoz sonundan, 45 dakikadan daha azdır. Akış sitometrisi, benzer bir şekilde kullanılabilir, ancak fluorometri avantajı, yüksek verim, numune en az bir manipülasyon ve hücre başına floresan yoğunluğu hızlı ölçümü ile değerlendirme olarak hızlı bir yöntemdir edilebilir. Benzer stratejiler, esasen yapışkan hücreler, canlı etiketli bakteriler, aktin polimerizasyonu, ve floresan kullanılarak herhangi bir işlem uygulanabilir. Bu nedenle, fluorometri düşük maliyetli, yüksek throughp için umut verici bir yöntemdirhücresel süreçlerin çalışmada ut yetenekleri.

Giriş

Floresan sinyal miktarının belirlenmesi yaygın, akım sitometri konfokal mikroskopi ve ELISA multiplex için analiz FRET, PCR kadar bilimsel yöntemlerle çok sayıda kullanılmıştır. Floresan görüntüleme ve miktar geniş bir uygulama vardır ve çeşitli hücresel süreçlerin kantitatif analiz için harika bir araç olabilir. Floresan belirteçleri ve sinyal kullanımı son on yılda devrim olmuştur, ve floresan plaka okuyucu çıkması hücresel süreçleri sırasında yayılan floresan yüksek verim miktarının kolaylaştırmıştır.

Florimetrik analiz fagositoz miktarının büyük bir araç olarak hizmet verebilir. Fagositoz, 1800 ¹ Metchnikoff tarafından fagositoz keşfinden bu yana çalışılmıştır. Yıllar geçtikçe, çeşitli yöntemler bakteriyel, viral, fungal ve parazitik patojenler ^2-5 istila karşı doğal bağışıklık savunma için gerekli bu önemli süreci incelemek için kullanılmıştır. Sırayla miktar kullanılan mikroskopi ve Stereolojik tekniklerin Önceki yöntemler daha sonra içselleştirilmiş parçacıklar (manuel veya yazılım kullanımı ile) ^6-8 sayılarak ölçüldü phagocytosing hücreleri, görselleştirmek için. Kantitatif analiz için yalnız mikroskopi kullanılarak bazı dezavantajları bakterilerin manuel sayım emek yoğun ve gözlemci önyargı daha eğilimli olduğunu vardır. Fagositoz belirlenmesinde kullanılan diğer bir yöntem, bakteriyel kültür tabakalarına (fagositoz sonra) hücre lizatları bakterilerin kaplama mikrobiyolojik bir tekniktir, ancak bu yöntem bakteri mekanizmaları ve kısmen içsel bakterilerin varlığı hesaba başarısız olabilir. Bu yöntem mikroskopi göre daha emek yoğun ve analiz için birkaç gün sürer. Akış sitometri fagositoz ölçmek için hızlı, en etkili yolu olarak görünmektedir ve birçok grup ^9-11 tarafından kullanılmıştır, ancak yüksek maliyet yaygın in ile ilgiliDaha önce de belirtildiği deneylere göre analiz için gerekli gösterge en pahalı bir yöntem sağlar.

flüorometrik yöntem engelleyici maliyeti olarak değil floresan kullanarak ekipman tarafsız ölçümü sunar beri parçacık içselleştirilmesi analizi için flow sitometri için iyi bir alternatiftir. Fluorometri diğer katma faydaları, yüksek verimlilik ve etiketli içselleştirilmiş parçacıklar tarafından yayılan floresan ölçülmesi için yüksek verimlilik yetenekleri vardır.

Fluorometri Faydaları fagositoz dışındaki süreçlerin ölçümü için çıkarım olabilir. Örneğin, florometrik analiz aktin polimerizasyonunda hücre içi ya da zar bağlı reseptör, hücre geçirgenliği / canlılığı, transfeksiyon etkinliği değişiklikler ve modülasyon ifadesi değişikliklere yol açan herhangi bir işlem çalışma uygulanabilir. Florometrik tekniğin bir dezavantajı kullanılan etiketlerin bağlı olarak, yüksek olabilir, yaniDeney genellikle kat değişikliği veya kontrolden oranında artış göreli miktar üzerinden veri, göstererek çözülebilir değişkenliği deneme.

Protokol

NOT: daha önce yayınlanan çalışma ¹² kullanılan Bu protokol, fagositoz ve aktin polimerizasyonu miktar gibi birden fazla uygulama için de kullanılabilir. protokol değişikliği çeşitli kendisini ödünç, ve Tablo 1 hücre tipleri ve parçacıklar başarıyla geçmiş çalışmalarda kullanılan. Fagositoz veya aktin polimerizasyonu ölçümü için bu protokolün standart kullanımı Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şema 1:. Hücreler, kaplama muamele edilmiş ve yapışmaya bırakılmış sonra Şeması fagositoz aktin polimerizasyonu ve miktar tayini için flüorometrik tahlil yeşil floresan (FITC) ile etiketlenir parçacıklar fagositosis için hücrelere ilave edilir. Reaksiyon trypan veya antibi tarafından durdurulurotik yıkama (olmayan içsel parçacıkları elimine etmek için) ve tespit% 4 paraformaldehit ile gerçekleştirilir. Hücreler, daha sonra kırmızı floresan aktin etiket (rodamin falloidin) ve mavi floresan-etiketi (DAPI) ile boyanır. Fagositoz aktin polimerizasyonu ve endeksler yeşil / mavi (FITC / DAPI) ya da kırmızı / mavi (rodamin / DAPI) floresansın nispi floresan birimlerinin oranı olarak ölçülür.

1. Kaplama ve Tedavisi Hücreler

NOT: Başlamadan önce, plaka düzeni aşağıdaki kontrolleri en az 4 teknik tekrarlı tedaviler çalışan düşünün, ve şunlardır: sadece ve parçacık hücreleri sadece (tek başına ya da DAPI rodamin yalnız ile, lekesiz).

1. Kontaminasyondan örnekleri korumak amacıyla, steril hücre kültürü kaputu 1-4 adımda reaktiflerin tamamı ilave yürütmek için.
2. (Kuyu başına), 50 ul 1-5 x 10 ⁴ hücre 96 oyuklu bir plaka içerisinde Plaka makrofajlar (sıçangil J 774 hücre çizgisi) ve önceden ısıtılmış medya desteklenmiştir. Bu yöntem için ideal plakaları okuyucu özelliklerine bağlı olarak, şeffaf veya siyah dipleri siyah 96-kuyu plakalar vardır.
   1. (Fagositosis için canlı bakteri kullanılmıyorsa) takviye edilmiş bir ortam için, tamamlayıcı çağlayanının bir girişimi engellemek için FBS,% 10 ısı ve% 1 penisilin / streptomisin kullanın. Ile yapışmayan hücreler 1-2 yapışma saat ve yapışkan olmayan hücreler için izin verirse, 500 x g'de 10 dakika için hücreler ile plaka aşağı doğru döndürün.
3. 100 ul (1 x) bir son hacim için 50 ul 2x konsantrasyonda (takviye edilmiş ortam içinde, daha tercihen PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ya da) istenilen agonistleri / antagonistleri ya da araç kontrolü ekleyin ve bir zaman arzu edilen bir miktarda inkübe edilir. Çok kanallı pipet ve reaktif rezervuarları hızlı işleme kolaylaştıracaktır.

Floresan Parçacıkların 2. Opsonizasyon

ftp_upload / 52.195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/>
Tablo 1: Test edilen hücre tipleri ve fluorometrik olarak analiz floresan parçacıkların olmadığı, fagositoz ve aktin polimerizasyon Tablo 1 hücre tiplerinin kombinasyonu (hücre hatları ve primer hücreler) göstermektedir grup florometrik yöntemi ile kullanılan bildirildi.. Vahşi tip hücreler tarafından fagositoz ve aktin polimerizasyonu şu an dışında, aynı zamanda, bir GFP (yeşil flüoresan protein) ifade eden transfekte edilmiş hücreler tarafından fagositoz incelenmesi için, bu parçacıkların bir kısmı kullanmışlardır. . Floresan haberci ihtiva eden plasmidler ile transfekte edilmiş hücrelerin floresans da DAPI Tablo Efsaneye ek olarak hücresel marker olarak kullanılabilir: A - aktin polimerizasyonu; P - fagositoz; PT - GFP tarafından fagositoz transfekte hücreleri etiketli; OPDex - dekstran boncuk opsonize; HKOP - Isı opsonize öldürülen.

1. Floresan parçacıkların olmadığı ve etiketler her zaman ışıktan korunduğu, dur sağlamakışıkla ağartma önlemek için, hem de inkübasyon sırasında işleme, yıkama ing
   1. Üreticinin teknik özelliklerini kullanarak,: (E. coli K-12 suşu E2861) kuru parçacıklar için, floresan ısı öldürülmüş opsonize (HKOP) bakterileri dışarı tartın. 10 Herhalde kitle hesapları yapmak için özen: 1-20: 1 bakteri: hücre oranı (ya da en azından 10: 1 oranı - yaygın fagositoz miktarının kullanılır) ^13,14. Parçacıkların sayısı üreticisi tarafından sağlanan veya 1 mg / ml stok çözeltisi seri dilüsyonları couting ile tespit edilebilir.
   2. 50 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve en yüksek ayarda 1 dakika vorteksleyin. Doğru vorteks (burada ve protokol boyunca) parçacıklar opsonitasyonunu etkinliğini etkileyebilecek bir araya eğilimi gibi olun.
   3. Süspansiyon içinde olan zerrelerin gibi floresan etiketli dekstran boncuk (Dex boncuklar) için, 1 dakika vorteksleyin, stok çözeltisi, birim d boncuk konsantrasyonuna süspansiyon ya da bağlı olarak 50 ul alır1 boncuk: boncuk etermine montaj 10 kolaylaştırmak için hücre oranı.
2. Parçacıklara opsonizasyon reaktif eşit hacimde eklenir ve güçlü bir şekilde bir dakika girdap.
3. 1 saat boyunca 37 ° C'de bir reaktif opsonizasyon sahip partiküller inkübe edin.
4. İnkübasyondan sonra 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj parçacıkları ve fazla opsonizasyon reaktifi ihtiva eden üstte yüzen çıkarın. 100 ul PBS ilave edilmesiyle parçacıklar yıkanır, girdap 500 x g'de 5 dakika boyunca pelet ve santrifüjatın tekrar süspansiyon.
   1. Uygun opsonizasyonunu ve bağlanmamış antikor kaldırılmasını sağlamak için bu adımları iki kez tekrarlayın.
5. (Bir 96-delikli plaka için yeterli) ortam 5 ml bunları yeniden süspanse edilmesi suretiyle opsonize parçacıkların çalışma çözeltisi hazırlayın ve hücrelere ilave edilene kadar ışıktan uzakta depolamak.

3. Fagositoz

1. Steril reaktif rezervuar içindeki parçacıkların çalışma çözeltisi yerleştirin. Buradan, 50 ekleyin56 (50 ng / ml'lik bir son konsantrasyon için) aşama 1 'de hazırlanan hücrelere opsonize parçacıkların L ve fagositoz standart hücre kültür koşullarında oluşmasına izin verir. Bu yöntem (Şema 2) kullanılarak değerlendirilebilir fagositoz iki yöntem aşağıda görüntülenmiştir.

Şema 2:. Onlar yavaş yavaş iyi altındaki hücreleri ulaşmak gibi sürekli karşı senkronize fagositoz karşılaştırılması Sürekli fagositoz zamanla parçacıkların sürekli içselleşmesini gösterir. Bir tezat senkronizasyon adımı (santrifüj) hücre ile partikül temas artırılması ve hücreler tarafından derhal içselleştirilmesi lider, dibine çöker parçacıkları zorlar. Senkronize fagositoz daha hızlı bir bölümünü içselleştiren hızlı bir süreçtirparçacık temas: artmış hücre nedeniyle icles.

1. 1. Bakteri kuyunun dibine ulaşmak ve elde etmek için yavaş yavaş dibe batar ve hücreler ile temas, izin daha uzun zaman dilimlerini kullanmak gibi hücreler sürekli opsonize bakterileri fagosite izin Sürekli fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için hücrelerle dokunun. Bir zamanlaması, deney yapılması halinde, farklı zaman aralıklarında bakteri ekleyebilir ve işleme hızını artırmak için, aynı zamanda reaksiyonların tüm plaka durdurun.
   2. Parçacık artırır senkronize fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için: santrifüj yoluyla hücre teması, her zaman noktalarında senkronizasyonunu kolaylaştırmak için hücreleri ve parçacıklar (500 xg'de 5 dakika) kısa sürede parçacıklar ilave olarak içeren tüm plaka aşağı spin ve Hücre etkileşimi: parçacık hızlandırmak için.
      1. Sağ merkezkaç tamamlanmasından sonra başlayan süresi kursu ölçünfugation adım. Zamana yayılmış bir deneyi yürütülmesi durumunda aşağıda tarif edildiği gibi, farklı zaman aralıklarında bağımsız olarak her zaman noktasını durdurun.

NOT: senkronize fagositoz yöntemi biraz daha zahmetli bir öncekinden olduğunu, ancak daha kısa sürede daha yüksek fagositik indeksi sağlar.

4. Durdurma Fagositoz

1. Yapışkan hücreler için, süpernatant kaldırmak ve PBS ile seyreltildi tripan mavisi 50 ul: olmayan içsel bakteri floresan söndürmek için, (2: 1 seyreltme).
2. Yapışmayan hücreler için, plaka aşağı spin ve süpernatant kaldırmak. Seyreltilmiş tripan mavisi 50 ul ekleyin. Hücre kaybını en aza indirmek ve yeterli yıkama sağlamak için, her bir yıkama arasında en plaka (500 x g'de 5-10 dakika) santrifüj emin olun.
3. Tripan inkübasyon sonrasında, (de açık döner PBS kaldırılana kadar) herhangi bir kalıntı numuneler Tripan kaldırmak için PBS ile hücreleri iki kez yıkayın. Trypan fakat canlı bir bakteri ya da OPDex boncuk, floresan etiketli olmayan içsel ısı öldürülmüş bakteriyel parçacıkların floresan ^15,16 söndürmek için gösterilmiştir. Canlı bakteri için, penisilin, streptomisin, veya gentamisin yerine olmayan içsel partiküllerden floresan karıştırıcı etkilerini önlemek için tripan yıkama gibi antibiyotikler ile bir yıkama içerir.
4. PBS ile yıkayın, sonra% 4 paraformaldehid, 100 ul hücreleri saptamak, ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir (her bir yıkama için oyuk başına 100 ul). Bu adımda, bir haftaya kadar 4 ° C 'de hücreler, kaydetme ve boyama ve miktar, doğrudan devam edin.
   NOT: Tüm sonraki adımlar bu nokta önsöz hücre kültürü kaputu dışında yapılabilir oluştururlar.
5. Tüm sıvı çıkarın ve PBS içinde yeniden 5 ng / ml DAPI 50 ul ekle. Boyama için 5 dakika izin verin ve daha sonra iki kez PBS ile yıkayın. Yıkama adımından sonra, her bir kuyunun ve kayıt fagositozu PBS 50 ul ekleyin.

5. Aktin Boyama

Not: fagositoz ek olarak, florometrik yöntem lamellipodia, pseudopodiae inhibisyonu sırasında azalır aktin, yoğunluğunu ölçmek ve membran bir inhibitör (Şekil 1A) ile muamele sonucu olarak kabarması ile aktin polimerizasyonu miktarının sağlayacaktır. Bu fagositoz ek olarak aktin polimerizasyonu ölçümü ilgilenen varsa isteğe bağlı bir adımdır. Aktin polimerizasyon fagositoz için floresan parçacıklar kullanılarak, nihai hedefi ise isteğe bağlıdır.

1. Paraformaldehit sabitleme (adım 4.3) takiben, her bir yıkama için oyuk başına 100 ul PBS ile iki kez plakayı yıkayın. Nüfuziyet kabiliyeti PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında -5 dakika inkübe edilir.
2. (Yukarıdaki gibi) PBS ile% 0.1 Triton X-100, 2 kez yıkayın ve Labe spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 20 dakika boyunca,% 1 sığır serum albümini (BSA) ile blokel.
3. Engelleme ardından, BSA çözüm kaldırmak ve hemen rodamin Phalloidin ekleyin. , Rodamin leke çalışma çözeltisi hazırlamak (bir plaka için yeterli) PBS, 5 ml (üretici tarafından sağlanan) metanoik çözeltisi 100 ul kullanın. Çalışma çözeltisinden oyuk başına 50 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
   NOT: adımda çamaşır adımları ve DAPI boyama takiben 4.4 hücreleri ölçümü için hazır olacak.

6. sayısallaştırılması

1. Λ = 460 nm λ = 355 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak λ = 518 nm, mavi floresan de λ = 488 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak floresan plak okuyucu kayıt yeşil floresan ile fagositozu ölçmek için.
2. Λ = 355 nm ve λ = 460 nm (yukarıdaki gibi), ve kırmızı grip ile bir floresan plaka okuyucu kayıt mavi floresan kullanılarak aktin polimerizasyonu ölçmek içinλ = 584 nm ve emisyon filtresi λ = 620 nm uyarma filtresi üzerinden orescence.
   NOT: Orbital veya merkezi algılama kayıt için kabul edilebilir. Bazı hücre tiplerinin vaka yörünge kayıt avantaj olabilir hangi merkeze daha kuyudan, kenarına daha toplamak. Özellikle, yörünge etrafında üç nokta, ortalama aynı zamanda daha hassas sonuçlar elde etmek için kullanılabilir.
3. Aktin ölçümü (Grafik 1) vs parçacık etiket veya fagositik bağlı, (DAPI itibaren) mavi floresan okuma yeşil veya kırmızı floresan toplam RFU bölün. Yüksek olması nedeniyle plaka için plaka varyans, en iyi gözlenen eğilimleri göstermek ve daha güvenilir istatistiksel analiz kolaylaştırmak için, (örneğin = 0 kontrolü t göreceli olarak) göreceli indeksleri kullanın.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak fagositozunu ve sonraki aktin polimerizasyonu miktarının iki önemli yolu, sürekli veya senkronize fagositoz gözlemlemektir.

Mikroskopik analiz (Şekil 1B) florimetre kayıt ne karşılaştırılabilir floresan görüntüleri göstermektedir (ayrıca Diagram 1). Şekil 1B aktin kırmızı floresan, FITC yeşil floresan 268 HKOP E. etiketleri vardır coli, nükleer DAPI leke ve üç 269 birleştirilmiş görünt...

Tartışmalar

Florometrik tekniğin başlıca kısıtlamaları deney varyans yanı sıra geniş bir yıkama ve yapışkan olmayan hücrelerin kullanımı ile ortaya çıkan hücre kaybı vardır.

Varyans nedeniyle hazır çözeltinin hazırlanması sırasında tartım ve pipetleme gibi floresan parçacıkların varyasyon büyük ölçüde görülmektedir deney için deney parçacıkların aynı sayıda muhafaza tam bir yol değildir. (-; Parçacıklar hemen eklenen ve kaldırılan t = 0 kontrol) deneyler ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use
Fluorescent plate reader - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96-well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom - black plates
Multichannel pipette (8 - 12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)