Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Riepilogo

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Abstract

L'obiettivo dell'analisi fluorimetrica è di servire come un efficiente, economico, metodo ad alta velocità di analisi di fagocitosi e di altri processi cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata in una varietà di tipi di cellule, sia aderenti e non aderenti, per esaminare una serie di proprietà cellulari. Quando si studia la fagocitosi, tecnica fluorimetrica utilizza tipi di cellule fagocitiche come i macrofagi, e le particelle opsonizzati fluorescente cui fluorescenza può essere spento in presenza di blu trypan. Dopo la placcatura dei macrofagi aderenti in piastre a 96 pozzetti, particelle fluorescenti (verde o rosso) sono amministrati e le cellule sono autorizzati a fagocitare per vari periodi di tempo. Dopo internalizzazione delle particelle fluorescenti, le cellule vengono lavate con trypan blu, che facilita estinzione di segnale fluorescente dai batteri che non sono internalizzati, o sono semplicemente aderendo alla superficie cellulare. Al termine del lavaggio trypan, le cellule sono lavate con PBS, fisso, unnd colorati con DAPI (etichetta nucleare fluorescente blu), che serve a etichettare nuclei delle cellule. Con una semplice quantificazione fluorimetrico attraverso la lettura piatto di nucleare (blu) o particella (rosso / verde) di fluorescenza si può esaminare il rapporto tra unità di fluorescenza relativi di verde: blu e determinare un indice di fagocitosi indicativa della quantità di batteri fluorescenti interiorizzato per cella. La durata del test utilizzando un metodo e multicanale 96 pozzetti pipette per il lavaggio, da fine fagocitosi a fine acquisizione dati, è inferiore a 45 min. Citometria a flusso potrebbe essere utilizzato in modo simile, ma il vantaggio di fluorometria è la sua alta produttività, rapida metodo di valutazione con minima manipolazione dei campioni e veloce quantificazione di intensità fluorescente per cella. Strategie simili possono essere applicati a cellule non aderenti, batteri vivi etichettati, actina polimerizzazione, e sostanzialmente qualsiasi processo che utilizza fluorescenza. Pertanto, fluorimetria è un metodo promettente per il suo basso costo, alta throughpcapacità ut nello studio dei processi cellulari.

Introduzione

Quantificazione del segnale fluorescente è stato ampiamente utilizzato in una moltitudine di metodi scientifici che vanno dalla PCR, citometria a flusso, microscopia confocale e FRET analisi multiplex ELISA. Fluorescenza imaging e quantificazione ha una vasta applicazione e può essere un ottimo strumento per l'analisi quantitativa dei vari processi cellulari. L'uso di marcatori fluorescenti e il loro segnale è stato rivoluzionato negli ultimi dieci anni, e la comparsa di lettori di piastre fluorescenti ha facilitato l'alta quantificazione throughput fluorescenza emessa durante i processi cellulari.

Analisi fluorimetrica può servire come un grande strumento di quantificazione di fagocitosi. Fagocitosi è stato studiato dopo la scoperta dei fagociti da Metchnikoff nel 1800 ^1. Nel corso degli anni, una varietà di metodi sono stati utilizzati per esaminare questo importante processo essenziale per la difesa immunitaria innata contro l'invasione batterica, virale, fungina e patogeni parassiti ^2-5. Metodi precedenti di quantificazione utilizzata microscopia e tecniche stereologici al fine di visualizzare le cellule che sono phagocytosing, che sono stati poi quantificati contando di particelle interiorizzate (manualmente o con l'uso di software) ^6-8. Alcuni svantaggi di usare solo la microscopia per l'analisi quantitativa sono che il conteggio manuale dei batteri è lavoro intensivo e più inclini a pregiudizi dell'osservatore. Un altro metodo utilizzato nella quantificazione della fagocitosi è la tecnica microbiologica di placcatura di batteri lisati cellulari (seguenti fagocitosi) su piastre di coltura batterica, ma questo metodo può non tenere conto di meccanismi e presenza di batteri in parte internalizzati battericida. Questo metodo è ancora più alta intensità di lavoro rispetto alla microscopia e richiede diversi giorni per analizzare. Flusso sembra citometria essere il più veloce, più efficace per quantificare fagocitosi ed è stato utilizzato da molti gruppi ^9-11, ma il costo elevato comunemente associato con l'instrumento necessario per l'analisi, è il metodo più costoso rispetto ai saggi precedentemente menzionati.

Il metodo fluorimetrica è una buona alternativa per citometria a flusso per l'analisi di internalizzazione delle particelle in quanto offre la quantificazione imparziale di apparecchiature di fluorescenza utilizzando tale non è il costo proibitivo. Altri benefici aggiunti di fluorometria sono ad alta efficienza, ed elevate capacità di throughput per quantificare la fluorescenza emessa dalle particelle interiorizzati etichettati.

Vantaggi di fluorometria possono essere estrapolati per la quantificazione di processi diversi fagocitosi. Ad esempio, l'analisi fluorimetrica può essere applicato per studiare qualsiasi processo che porta a cambiamenti nell'espressione di intracellulare o recettori di membrana, cambiamenti nella permeabilità delle cellule / redditività, l'efficacia di trasfezione, e la modulazione di polimerizzazione. Uno svantaggio della tecnica fluorimetrica è che, a seconda delle etichette utilizzate, ci può essere un altoesperimento di sperimentare la variabilità che di solito può essere risolto dimostrando dati attraverso la quantificazione relativa, come il cambiamento volte o cento di aumento dal controllo.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per più applicazioni come la quantificazione della fagocitosi e polimerizzazione usati nel nostro lavoro precedentemente pubblicato ^12. Il protocollo si presta ad una varietà di modifica e tipi e particelle Tabella 1 elenca cellulari impiegato con successo in studi precedenti. Uso standard di questo protocollo per la quantificazione di fagocitosi o polimerizzazione è illustrato in Figura 1.

Schema 1:. Schema di test fluorometrica per la quantificazione di fagocitosi e polimerizzazione Dopo che le cellule sono placcati, trattati, e ha permesso di aderire, particelle etichettate con fluorescenza verde (CIC) vengono aggiunti alle cellule per la fagocitosi. La reazione viene fermato da trypan o antibilavaggio otic (per eliminare particelle non-internalizzato) e fissaggio viene effettuato con 4% paraformaldeide. Le cellule vengono poi colorate con etichetta rossa fluorescente actina (rodamina falloidina) e l'etichetta fluorescente blu (DAPI). Indici di fagocitosi e polimerizzazione sono quantificate in un rapporto di unità di fluorescenza relativi di verde / blu (FITC / DAPI), o rosso / blu (rhodamine / DAPI) fluorescenza.

1. placcatura e Celle Trattamento

NOTA: Prima di cominciare, prendere in considerazione l'esecuzione dei trattamenti con almeno 4 repliche tecniche, e comprendono i seguenti controlli nel layout piatto: solo le cellule (senza macchia, con il solo DAPI o rhodamine solo) solo e particelle.

1. Condurre tutte aggiunta di reagenti in passaggi 1-4 in una cappa sterile coltura cellulare al fine di proteggere i campioni dalla contaminazione.
2. Macrofagi Piatto (murino linee cellulari J774) in una piastra a 96 pozzetti a 1-5 x 10 ⁴ cellule in 50 ml (per bene) di supporto integrato preriscaldato. Piatti ideali per questo metodo sono piastre da 96 pozzetti neri con fondo trasparente o nero, a seconda delle capacità del lettore.
   1. Per i media integrati, utilizzare il 10% di calore inattivato FBS per evitare interferenze del complemento a cascata, e l'1% di penicillina / streptomicina (se non si utilizza batteri vivi per fagocitosi). Se utilizzando cellule aderenti permettono 1-2 ore per l'adesione, e le cellule non aderenti, centrifugare la piastra con le cellule per 10 min a 500 x g.
3. Aggiungere agonisti / antagonisti desiderati o controllo del veicolo a concentrazioni 2x (risospese in PBS o più preferibilmente, in mezzi integrazioni) in 50 microlitri per un volume finale di 100 microlitri (1x) e incubare per un tempo desiderato. Pipetta multicanale e reagenti serbatoi faciliterà l'elaborazione più veloce.

2. Opsonizzazione di particelle fluorescenti

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Tabella 1: Testato tipi di cellule e particelle fluorescenti nell'analisi fluorometrica di fagocitosi e la polimerizzazione di actina tabella 1 illustra le combinazioni di tipi di cellule (linee cellulari e cellule primarie) che il nostro gruppo ha utilizzato con il metodo fluorimetrico.. Altro che guardare la fagocitosi e polimerizzazione dalle cellule di tipo selvatico, abbiamo anche utilizzato alcune di queste particelle per l'esame di fagocitosi da cellule trasfettate che esprimono un GFP (green fluorescent protein). Fluorescenza delle cellule trasfettate con plasmidi contenenti reporter fluorescenti può anche essere utilizzato come marcatore cellulare in aggiunta a DAPI Tabella legenda:. A - polimerizzazione actina; P - fagocitosi; PT - fagocitosi da GFP etichettati cellule transfettate; OPDex - opsonizzati tallone destrano; HKOP - calore ucciso opsonizzati.

1. Assicurarsi che le particelle e le etichette fluorescenti sono protetti dalla luce in ogni momento, during trattamento, il lavaggio, così come durante l'incubazione per evitare photobleaching
   1. Per particelle secche, pesare uccisi opsonizzati (HKOP) batteri calore fluorescente (E2861: E. coli K-12 ceppo), utilizzando le specifiche del produttore. Fare attenzione per assicurarsi che i conti di massa per il 10: 1 - 20: 1 batteri: rapporto cellulare (o almeno un rapporto di 10: 1 - comunemente usato in quantificazione della fagocitosi) ^13,14. Numero di particelle può essere fornita dal produttore o determinato mediante couting diluizioni seriali di 1 mg / ml di soluzione.
   2. Risospendere in 50 microlitri PBS e vortex per 1 minuto a posizione più alta. Garantire la corretta vortex (qui e in tutto il protocollo), come le particelle tendono ad aggregarsi che può influenzare l'efficacia di opsonizzazione.
   3. Per le particelle in sospensione di tali perle destrano come fluorescente (sfere DEX), vortice soluzione madre per 1 minuto, prendere 50 ml di sospensione o in funzione della concentrazione tallone del volume determine monte di perline per facilitare 10: 1 perlina: rapporto cellulare.
2. Aggiungere un volume uguale di reagente opsonizzante alle particelle e vigorosamente vortex per un altro minuto.
3. Incubare le particelle con opsonizzare reagente a 37 ° C per 1 ora.
4. Dopo l'incubazione, centrifugare le particelle per 5 minuti a 500 xg, e rimuovere il supernant contenente reagente in eccesso opsonizzante. Lavare le particelle aggiungendo 100 ml di PBS, vortex per risospendere il pellet, e centrifugato per 5 min a 500 x g.
   1. Ripetere questa procedura due volte per assicurare la corretta opsonizzazione e la rimozione di anticorpi non legato.
5. Preparare la soluzione di lavoro di particelle opsonizzati da essi risospendere in 5 ml di media (sufficienti per una piastra a 96 pozzetti) e conservare al riparo dalla luce fino aggiunta alle cellule.

3. Fagocitosi

1. Posizionare la soluzione di lavoro di particelle in un serbatoio di reagente sterile. Da qui, aggiungere 5056; l di particelle opsonizzati alle cellule preparate nel passaggio 1 (ad una concentrazione finale di 50 ng / ml) e lasciare fagocitosi avvenga a condizioni standard di coltura cellulare. Di seguito vengono illustrate due metodi di fagocitosi che possono essere valutati con questo metodo (Figura 2).

Schema 2:. Confronto continuo rispetto sincronizzare fagocitosi fagocitosi continua indica internalizzazione continuo di particelle nel tempo che lentamente raggiungono le cellule sul fondo del pozzo. Un passo di sincronizzazione contrasto (centrifugazione) costringe le particelle a depositarsi sul fondo, migliorando il contatto particella con la cella, e portando a internalizzazione immediata dalle cellule. Fagocitosi sincronizzato è un processo più veloce, che interiorizza più rapidamente parteicles a causa della maggiore delle cellule: contatto di particelle.

1. 1. Per il metodo fagocitosi continua (Figura 2) che consentono alle cellule di batteri fagocitano continuamente opsonizzati che lentamente si depositano sul fondo e vengono a contatto con le cellule, utilizzano tempi più lunghi per consentire i batteri per raggiungere il fondo del pozzo e ottenere in toccare con le cellule. Se condurre un esperimento timecourse, aggiungere batteri ad intervalli di tempo differenti e arrestare l'intera piastra di reazioni allo stesso tempo per migliorare la velocità di elaborazione.
   2. Per il metodo sincronizzato fagocitosi (Figura 2) che migliora particella: il contatto delle cellule via centrifugazione, centrifugare l'intera piastra contenente cellule e particelle (5 min a 500 xg) non appena vengono aggiunte le particelle, per facilitare la sincronizzazione di tutti i punti di tempo e per accelerare la particella: interazione cellulare.
      1. Misurare il decorso partire subito dopo il completamento del Centrifugation passo. Se condurre un esperimento andamento temporale, arrestare ogni punto di tempo in modo indipendente ad intervalli di tempo differenti come descritto di seguito.

NOTA: Il metodo sincronizzato fagocitosi è un po 'più laboriosa da quella precedente, ma fornisce un più elevato indice di fagocitosi in un tempo più breve.

4. Fagocitosi Arresto

1. Per cellule aderenti, rimuovere il surnatante e aggiungere 50 ml di diluito trypan blu con PBS (diluizione 1: 2), per estinguere la fluorescenza dei batteri non internalizzati.
2. Per le cellule non-aderenti, girare la piastra e rimuovere il surnatante. Aggiungere 50 ml di diluito blu trypan. Assicurarsi di centrifugare la piastra a (5-10 min a 500 xg) tra ciascun lavaggio per minimizzare la perdita di cellule e consentire un adeguato lavaggio.
3. Dopo l'incubazione trypan, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere ogni residuo trypan (fino alla PBS rimosso dal pozzo diventa chiaro). Trypan ha dimostrato di placare la fluorescenza ^15,16 di non interiorizzati fluorescente, calore ucciso, particelle batteriche, ma non per i batteri vivi o OPDex perline. Per batteri vivi, includere un lavaggio con antibiotici come la penicillina, streptomicina, gentamicina o al posto del lavaggio trypan per evitare effetti confondenti di fluorescenza di particelle non interiorizzato.
4. Fissare cellule con 100 ml di 4% paraformaldeide, e incubare per 15 min a temperatura ambiente, poi lavare con PBS (a 100 microlitri per pozzetto per ogni lavaggio). A questo punto, salvare le cellule a 4 ° C per un massimo di una settimana, o procedere direttamente alla colorazione e quantificazione.
   NOTA: Tutti i passi successivi formano questo punto prefazione può essere fatto di fuori della cappa coltura cellulare.
5. Rimuovere tutto il liquido e aggiungere 50 ml di DAPI a 5 ng / ml in PBS ricostituito. Lasciare 5 min per la colorazione, e poi lavare due volte con PBS. Dopo la fase di lavaggio, aggiungere 50 ml di soluzione salina in ogni fagocitosi bene e record.

5. Actin Colorazione

NOTA: Oltre alla fagocitosi, il metodo fluorimetrico consentirà quantificazione di polimerizzazione dell'actina dall'intensità di actina, che viene ridotta durante inibizione lamellipodia, pseudopodiae misurazione, e la membrana arruffando come risultato del trattamento con un inibitore (Figura 1A). Questo è un passaggio facoltativo se interessati quantificazione di polimerizzazione actina in aggiunta alla fagocitosi. Se polimerizzazione actina è l'obiettivo finale, con particelle fluorescenti per la fagocitosi è facoltativo.

1. Dopo paraformaldeide fissaggio (fase 4.3), lavare la piastra due volte con PBS a 100 ml per pozzetto per ogni lavaggio. Aggiungere 50 ml di 0,1% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione e incubare per -5 min a RT.
2. Lavare 0,1% Triton X-100 2 volte con PBS (come sopra), e bloccare con 1% di albumina sierica bovina (BSA) per 20 minuti per evitare di legame non specifico della label.
3. Dopo il blocco, rimuovere la soluzione BSA e aggiungere immediatamente rodamina falloidina. Per preparare la soluzione di lavoro di macchia rodamina, utilizzare 100 ml di soluzione methanoic (fornita dal costruttore) in 5 ml di PBS (sufficiente per una piastra). Dalla soluzione di lavoro aggiungere 50 microlitri per pozzetto ed incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Dopo i passaggi di lavaggio e colorazione DAPI come al punto 4.4 delle cellule sarà pronto per la quantificazione.

6. Quantificazione

1. Per quantificare la fagocitosi utilizzando un lettore di fluorescenza, record di fluorescenza verde con filtro di eccitazione a λ = 488 nm e filtro di emissione a fluorescenza λ = 518 nm, e blu con filtro di eccitazione a λ = 355 nm e filtro di emissione a λ = 460 nm.
2. Per quantificare la polimerizzazione di actina utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza, record di fluorescenza blu con λ = 355 nm e λ = 460 nm (come sopra), e rosso influenzaorescence via filtro di eccitazione a λ = 584 nm e filtro per le emissioni λ = 620 nm.
   NOTA: Orbital o rilevamento centrale è accettabile per la registrazione. Alcuni tipi di cellule riuniscono più al bordo del pozzo rispetto al centro, nel qual caso la registrazione orbitale può essere di vantaggio. In particolare, la media di tre punti intorno l'orbita potrebbe essere utilizzato anche per ottenere risultati più accurati.
3. Dividere la RFU totale di fluorescenza verde o rossa da blu lettura di fluorescenza (dal DAPI), seconda etichetta di particelle o phagocytic vs. actina quantificazione (Figura 1). A causa dell'alta varianza piastra a piastra, utilizzare indici relativi (quali rispetto a t = 0 controllo), per illustrare meglio tendenze osservate e per facilitare l'analisi statistica più affidabile.

Risultati

Due modi principali di quantificare fagocitosi e la successiva polimerizzazione actina attraverso l'utilizzo di questo protocollo è di osservare la fagocitosi continua o sincronizzato.

Analisi microscopica (Figura 1B) mostra immagini fluorescenti paragonabili a ciò che il fluorimetro sta registrando (vedi anche Figura 1). Nella Figura 1B sono fluorescenza rossa di actina, verde 268 fluorescenza FITC etichette HKOP E. coli, mac...

Discussione

I principali limiti della tecnica fluorimetrica sono varianza sperimentale nonché perdita cellulare associata con ampio lavaggio e l'uso di cellule non aderenti.

Variance si osserva soprattutto a causa della variazione di particelle fluorescenti come pesatura e pipettaggio durante la preparazione della soluzione madre non è un modo esatto di mantenere numeri identici di particelle da esperimento per esperimento. Per affrontare il problema della varianza tra esperimenti, i dati possono ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use
Fluorescent plate reader - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96-well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom - black plates
Multichannel pipette (8 - 12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)