대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

요약

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

초록

형광 분석의 목적 및 기타 탐식 세포 과정을 분석하는 효율적이고 비용 효과적인, 높은 처리량 방법으로 제공하는 것이다. 이 기술은 세포의 다양한 특성을 조사하기 위해, 점착성 및 비 점착성 세포 유형 모두의 다양한 이용 될 수있다. 식균 작용을 연구 할 때, 형광 기술은 대 식세포, 및 그 형광 트리 판 블루의 존재 하에서 소멸 될 수 형광 표지 된 입자로서 옵 소닌 포식성 세포 유형을 이용한다. 96 웰 플레이트, 형광 입자 (녹색 또는 빨간색)에 부착 된 대 식세포의 도금에 따라 투여하고 세포는 시간의 다양한 양의 탐식 할 수 있습니다. 형광 발색 입자의 내재화 후, 세포를 내재화되지 않거나 단지 세포 표면에 부착되는 박테리아로부터 형광 신호의 소멸을 촉진 트리 판 블루로 세척. 트리 판 세척 후, 세포를 고정, PBS로 세척하고,차 세포의 핵에 레이블을 제공 DAPI (핵 파란색 형광 라벨), 염색. 판 핵 (파란색)의 읽기 또는 입자를 통해 간단한 형광 정량 (적색 / 녹색) 형광 우리는 녹색의 상대 형광 단위의 비율을 검사 할 수 있습니다 : 파란색 셀 당 내면화 형광 박테리아의 양을 나타내는 식세포 인덱스를 결정합니다. 세척 96- 웰 방법 및 멀티 채널 피펫을 사용하여 분석의 기간은, 데이터 취득 종료 탐식 단부로부터, 45 분 미만이다. 유동 세포 계측법 유사한 방식으로 사용하지만 형광 측정의 장점은 높은 처리량, 샘플들의 최소 조작 셀당 형광 강도를 빠르게 정량화 평가의 신속한 방법이다 될 수있다. 유사한 전략은 본질적으로 비 부착 성 세포를 살아있는 박테리아 표지 액틴 중합하고 형광을 이용하여 임의의 처리를 적용 할 수있다. 따라서, 형광 측정 낮은 비용, 높은 throughp 유망한 방법이다세포 과정의 연구에서 유타 기능을 제공합니다.

서문

형광 신호의 정량화 널리 유동 세포 계측법, 공 촛점 현미경, 및 ELISA를 다중화 분석을 FRET, PCR에 이르기까지 과학적인 방법의 군중에서 사용되어왔다. 형광 이미징 및 정량화 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있으며, 다양한 세포 과정의 정량 분석​​을위한 훌륭한 도구가 될 수 있습니다. 형광 마커와 그 신호의 사용은 지난 10 년에 혁명되었고, 형광 플레이트 리더의 출현은 세포 과정 동안 방출되는 형광의 높은 처리량 정량화를 촉진했다.

형광 분석은 식균 작용의 정량화에 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 탐식 1800 ¹ Metchnikoff 의한 식세포의 발견 이후로 검토되고있다. 몇 년 동안, 다양한 방법은 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 병원균 ^{2-5 침입에} 대해 선천성 면역 방어에 필수적이 중요한 과정을 조사하기 위해 이용되어왔다. 순서대로 정량 활용 현미경 및 stereological 기술의 이전 방법은 다음 내면화 입자 (수동 또는 소프트웨어의 사용과) ^6-8의 계산에 의해 정량화 된 것을 시사하고 있습니다 세포를 시각화합니다. 정량 분석​​ 혼자 현미경을 사용하여 몇 가지 단점 박테리아의 수동 계산은 노동 집약적이고 관찰자 바이어스 경향이라고합니다. 식세포 작용의 정량화에 사용 된 또 다른 방법은 세균 배양 플레이트 상 (탐식 다음) 세포 용 해물로부터 세균의 미생물 도금 방법이지만,이 방법은 부분적으로 살균 메커니즘 내면화 박테리아의 존재를 고려하지 않을 수있다. 이 방법은 현미경에 비해 훨씬 더 노동 집약적이고 분석하는 데 몇 일이 소요됩니다. 유동 세포 계측법 탐식 정량화 가장 빠르고 효과적인 방법을 보인다 많은 그룹 ^9-11에 의해 이용되어 왔지만, 일반적으로 고비용에서와 연관된이전에 언급 된 분석법에 비해 분석에 필요한 strument는 가장 비싼 방법 만든다.

형광 방법은 엄청난 비용으로하지 형광 사용하여 장비의 편견 정량을 제공하기 때문에 입자 국제화의 분석을 위해 유동 세포 계측법 수있는 좋은 대안입니다. 형광 측정의 다른 추가적인 장점은 고효율 및 내재화 표지에 의해 방출 된 형광 입자를 정량 높은 처리 능력이다.

형광 측정의 장점은 식균 작용 이외의 프로세스의 정량화를 추정 할 수있다. 예를 들어, 형광 분석 액틴 중합 세포 또는 막 - 결합 수용체, 세포 투과성 / 생존력, 형질 전환 효능의 변화, 및 변조의 발현의 변화로 이어지는 모든 프로세스를 연구에 적용될 수있다. 형광 측정 기술의 한 가지 단점은 사용 된 레이블에 따라 하이가있을 수 있다는 것이다실험은 일반적으로 배 변경이나 컨트롤에서 % 증가로 상대적으로 정량화를 통해 데이터를 보여줌으로써 해결할 수 있습니다 변동성을 실험합니다.

프로토콜

참고 : 우리의 이전에 출판 된 작품 ^(12)에서 사용이 프로토콜은 식균 작용과 액틴의 중합 정량 등의 여러 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 다양한 변형라는 것으로하고, 표 1 세포 유형과 입자를 성공적으로 과거의 연구에 활용. 식균 작용 또는 액틴의 중합 정량이 프로토콜의 표준 사용은 그림 1에 예시되어있다.

그림 1 :. 세포, 도금 처리하고 준수하도록 허용 한 후 다이어그램은 식균 작용과 액틴의 중합 정량 형광 분석의 녹색 형광 (FITC)로 표지 입자가 식균 작용에 대한 세포에 추가됩니다. 반응은 트리 판 또는 antibi에 의해 정지귀 세척 (비 내재화 입자를 제거하기 위해)과의 고정은 4 % 파라 포름 알데하이드를 행한다. 세포는 이후 적색 형광 굴지의 레이블 (로다 민 팔로이 딘), 청색 형광 라벨 (DAPI)로 염색한다. 식균 작용과 액틴의 중합 인덱스는 녹색 / 청색 (FITC / DAPI), 또는 레드 / 블루 (로다 민 / DAPI) 형광의 상대 형광 단위의 비율로 정량화.

1. 도금 및 치료 세포

참고 : 시작하기 전에, 플레이트 레이아웃에서 다음 컨트롤을 적어도 4 기술 복제물로 처리를 실행 해보십시오, 여기에는 다음이 포함됩니다 만 입자 세포 만 (단독 DAPI 또는 로다 민 단독으로, 흠).

1. 샘플 오염으로부터 보호하기 위하여 세포 배양 무균 후드 1-4 단계에서 모든 시약 첨가를 실시한다.
2. (물론 당) 50 μL에서 1-5 × 10 ⁴ 세포에서 96 웰 플레이트에 플레이트 대 식세포 (쥐 J774 세포주) 의 예열 미디어를 보충. 이 방법에 적합 플​​레이트 리더 기능에 따라 취소 또는 검은 색 하의와 블랙 96 웰 플레이트입니다.
   1. (탐식 대한 생균을 사용하지 않는 경우)이 보충 미디어 들어 보체 캐스케이드의 간섭을 회피하기 위해 불 활성화 FBS를 10 % 열, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 사용한다. 이용한 부착 세포 접착 1-2 시간, 및 비 - 부착 세포를 허용하는 경우, 500 x g에서 10 분 동안 세포를 스핀 다운 플레이트.
3. 100 μL (1 배)의 최종 부피 50 μL에 2 배 농도 (보충 미디어,보다 바람직하게는 PBS에 재현 탁 또는)에서 원하는 작용제 / 길항제 또는 차량 제어를 추가하고 원하는 시간 시간 동안 배양한다. 멀티 채널 피펫 및 시약 저수지는 빠른 처리를 촉진 할 것이다.

형광 입자의 2 옵 소닌

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표 1 : 테스트 세포 유형과의 형광 분석 형광 입자 탐식 액틴 중합 표 1 세포 유형 조합 (세포주 및 일차 전지)를 도시 우리 그룹 형광 방법을 통해 사용될 것을.. 야생형 세포에 의한 식세포 작용과 액틴의 중합보고 이외에, 우리는 또한 GFP (녹색 형광 단백질)를 발현하는 형질 전환 세포의 탐식의 검사를 위해이 입자의 일부를 사용했다. . 형광 리포터를 함유하는 플라스미드로 형질 세포의 형광도 DAPI 표 범례에 더하여 셀룰러 마커로서 사용될 수있다 : A - 액틴 중합; P - 식균 작용; PT - GFP에 의한 식균 작용은 형질 전환 된 세포를 표지; OPDex - 덱스 트란 비드을 옵 소닌; HKOP - 열이 옵 소닌 죽였다.

1. 형광 입자와 라벨이 항상 빛으로부터 보호되어 있는지, 지속 시간을 확인photobleaching에 방지하기 위해서뿐만 아니라, 배양 중에 처리, 세정을 보내고
   1. 제조업체의 사양을 사용하여, (대장균 K-12 균주 E2861) 건조 입자를 들어, 형광 열 살해 옵 소닌 (HKOP) 박테리아를 달아. 10 확인 질량 계정을 만들주의 : 1 - 20 : 1 박테리아 : 세포의 비율 (또는 적어도 10 : 1의 비율을 - 일반적으로 식균 작용의 정량에 사용) ^{13, 14.} 입자의 수​​는 제조사에 의해 제공 또는 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액의 연속 희석을 couting 통해 결정될 수있다.
   2. 50 μl의 PBS에 재현 탁하고 가장 높은 설정에서 1 분 소용돌이. 적절한 와동을 (여기 프로토콜에 걸쳐) 입자가 옵 소닌의 효능에 영향을 미칠 수있는 집계 경향이 확인합니다.
   3. 현탁액에서 입자와 같은 형광 표지 덱스 트란 비드 (DEX 구슬)를 들면, 1 분 동안 와동 원액, 볼륨 D에서 비드 현탁액 또는 농도에 따라 50 μL를 취할한 비드 : 비드 etermine 마운트 (10)를 용이하게하기 위해 셀 비율.
2. 입자에 opsonizing 시약 같은 부피를 추가하고 적극적으로 다른 분 동안 와동.
3. 1 시간 동안 37 ° C에서 시약으로 opsonizing 입자 인큐베이션.
4. 인큐베이션 후, 500 XG에서 5 분 동안 원심 분리하여 입자를, 과잉 opsonizing 시약을 함유하는 상층 액을 제거한다. PBS 100 ㎕를 첨가하여 입자를 씻어 와류 500 x g에서 5 분간 펠렛을 재현 탁하고 centrifugate한다.
   1. 적절한 옵 소닌과 결합되지 않은 항체의 제거를 보장하기 위해 다음 단계를 두 번 반복합니다.
5. (하나의 96- 웰 플레이트에 충분한) 미디어 5ml에 재현 탁하여 그들 입자의 옵 소닌 작동 용액을 준비하고, 세포에 첨가 할 때까지 빛으로부터 떨어져 저장한다.

3. 탐식

1. 멸균 시약 저수지 입자의 작업 솔루션을 놓습니다. 여기에서, (50)를 추가56 (50 NG / ㎖의 최종 농도)에 단계 1에서 제조 한 세포로 옵 소닌 L 입자의 식균 작용이 표준 세포 배양 조건에서 발생할 수있다. 이 방법 (도 2)를 사용하여 평가 될 수있다 식균 작용의 두 가지 방법은 다음과 같습니다 그림.

도 2 :. 그들은 천천히 우물의 바닥에있는 세포에 도달으로 연속 대 동기화 식균 작용의 비교 연속 식균 작용은 시간이 지남에 따라 입자의 지속적인 국제화를 나타냅니다. 대조 동기화 단계 (원심 분리) 세포와 입자의 접촉을 강화하고, 세포에 의해 즉시 국제화 선도, 바닥에 가라 입자를 강제로. 동기화 식균 작용은보다 신속하게 부품을 내면화 빠른 과정이다입자에 들어갔을 때 : 증가 된 세포에 의한 icles.

1. 1. 박테리아가 잘 하단에 도달에 도착하는 그들은 천천히 바닥에 가라 세포와 접촉, 수 있도록 더 긴 시간 프레임을 사용으로 세포가 지속적으로 옵 소닌 세균을 탐식 할 수 있도록 지속적으로 식균 작용 방법 (도 2)의 경우 세포를 터치합니다. timecourse 실험을 실시하는 경우, 상이한 시간 간격에서 박테리아를 추가하고 처리 속도를 향상시키는 동시에 반응의 전체 플레이트를 멈춘다.
   2. 입자 향상 동기화 탐식 방법 (도 2)의 경우 : 원심 분리를 통해 세포 접촉, 모든 시점의 동기화를 용이하게하기 위해 세포 및 입자 (500 XG에서 5 분) 빨리 입자가 추가를 함유 플레이트 전체를 스핀 다운 세포의 상호 작용 : 입자를 촉진한다.
      1. 오른쪽 센트리의 완성 후 시작 시간 경과를 측정fugation 단계. 시간 경과 실험을 실시하면 후술하는 바와 같이, 상이한 시간 간격으로 독립적으로 각 시점을 멈춘다.

주 : 동기화 탐식 방법은 다소 번잡 이전부터이지만, 짧은 시간에 높은 균성 인덱스를 제공한다.

4. 중지 탐식

1. 부착 세포의 경우, 상층 액을 제거하고 PBS로 희석 트리 판 블루의 50 μl를 추가 비 내면화 박테리아의 형광을 소화하기 위해, (1 2 희석).
2. 비 부착 세포의 경우, 플레이트 스핀 다운 및 뜨는을 제거합니다. 희석 트리 판 블루의 50 μl를 추가합니다. 셀 손실을 최소화하고 충분한 세척을 가능하게하기 위해 각 세척 사이에서 플레이트 (500 XG에 5 ~ 10 분)을 원심 분리하여 확인합니다.
3. 트리 판 배양에 따라, (잘 명확 회전에서 PBS를 제거 할 때까지) 잔여 트리 판을 제거하기 위해 PBS로 세포를 두 번 씻는다. TRypan는하지만 살아있는 세균이나 OPDex의 구슬, 형광 표지 비 내면화 열 사망, 세균 입자의 형광 ^{(15, 16)을} 해소하는 것으로 나타났다. 살아있는 박테리아를 들어, 페니실린, 스트렙토 마이신 또는 겐타 마이신 대신 비 내면화 입자의 형광의 혼란 효과를 방지하기 위해 트리 판 세척과 같은 항생제와 세척을 포함한다.
4. PBS로 세척 한 후, 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎕에 세포를 고정하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다 (각 세척 용 웰 당 100 μL로). 이 단계에서 일주일까지 4 ° C에서 세포를 저장하거나, 염색 및 정량화에 직접 진행합니다.
   주 : 모든 후속 단계가이 점 머리말 세포 배양 후드의 외측에 형성 할 수있다.
5. 모든 액체를 제거하고 PBS에서 재구성 된 5 ng를 / ㎖에서 DAPI의 50 μl를 추가합니다. 염색 5 분 정도 기다린 다음, PBS로 두 번 세척한다. 세척 단계 후, 각 웰 기록 식균 작용에 PBS의 50 μl를 추가합니다.

5. 액틴 염색

주 : 식균 작용에 더하여, 형광 측정 방법은 멜리, pseudopodiae 억제되는 중에 액틴의 강도를 측정하고, 막이 억제제 (도 1A)와 처리의 결과로서 파동 운동하여 액틴 중합 정량화를 가능하게 할 것이다. 이 식균 작용뿐만 아니라 액틴의 중합 정량화에 관심이있는 경우 선택적인 단계입니다. 액틴 중합 식세포 작용에 대한 형광 물질을 사용하여, 최종 목표 인 경우에는 선택적이다.

1. 파라 포름 알데히드 고정 (4.3 단계)에 따라, 각각의 세척에 잘 당 100 μL에 PBS로 두 번 접시를 씻으십시오. 투과성으로 위해 PBS에 0.​​1 % 트리톤 X-100의 50 μl를 추가하고 RT -5 분 동안 품어.
2. (상기와 같은)와 함께 밖으로 PBS 0.1 % 트리톤 X-100을 2 회 반복하고, 라베의 비 - 특이 적 결합을 방지하기 위해 20 분 동안 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단리터.
3. 차단 후, BSA 솔루션을 제거하고 즉시 로다 민 팔로이 딘을 추가합니다. , 로다 민 얼룩의 작업 용액을 제조 (한 접시에 충분한) PBS 5ml에 (제조업체에서 제공) 메탄 계 용액 100 μl를 사용합니다. 작동 용액에서 웰 당 50 μL를 추가하고 실온에서 20 분 동안 배양한다.
   참고 : 단계에서와 같이 세척 단계와 DAPI 염색을 수행하면 4.4 세포가 정량 준비가 될 것입니다.

6. 정량화

1. λ = 460 nm에서 λ = 355 nm의 방출 필터의 여기 필터를 사용하여 λ = 518 nm의, 청색 형광에서 λ = 488 nm의 방출 필터의 여기 필터를 사용하여 형광 플레이트 판독기, 레코드 녹색 형광을 사용하여 식균 정량화.
2. λ = 355 nm의 λ = 460 nm의 (위)에, 그리고 빨간색 독감을 통해 형광 플레이트 리더, 기록 푸른 형광을 이용하여 액틴의 중합을 정량화하기λ = 584 nm의 방출 필터 λ = 620 nm에서 여기 필터를 통해 orescence.
   참고 : 궤도 또는 중앙 감지 녹화 허용됩니다. 일부 세포 유형은 케이스 궤도 기록 이점이 될 수있는 중앙보다 잘의 가장자리 자세히 모인다. 특히, 궤도 주위 3 점의 평균은 더 정확한 결과를 얻기 위해 사용될 수있다.
3. 굴지의 정량 (그림 1) 대 입자 라벨 또는 식세포에 따라 (DAPI에서) 푸른 형광 판독하여 녹색 또는 적색 형광의 총 RFU을 나눈다. 때문에 높은 판 - 투 - 플레이트 변화에 가장 잘 관찰 동향을 설명하기 위해 더 신뢰할 수있는 통계 분석을 용이하게하기 위해, (예 = 0 제어를 t에 상대적으로) 상대 인덱스를 사용합니다.

결과

이 프로토콜의 사용을 통해 식균 작용 및 후속하는 액틴 중합 정량 크게 두 가지 방법이 연속적 또는 동기화 탐식을 관찰하는 것이다.

현미경 분석 (도 1b)는 형광 기록 것과 유사한 형광 화상을 도시한다 (또한도 1 참조). 그림 1B에서 굴지의 적색 형광, FITC의 녹색 268 형광 HKOP E. 레이블입니다 대장균, 핵 DAPI 염색, 그리고 세 269의 병...

토론

형광 측정 기술의 주요 제한은 실험 분산뿐만 아니라 광범위한 세척 및 비 부착 세포의 사용과 관련된 세포의 손실이다.

분산이 때문에 원액의 제조 동안 계량 페팅 같은 형광 물질의 변화에​​ 크게 관측된다 실험 실험에서 입자의 동일 번호를 유지하는 정확한 방법이 아니다. (-; 입자는 즉시 및 제거가 t = 0 제어) 실험 간의 편차의 문제를 해결하기 위해, 데이터는 % 탐식 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use
Fluorescent plate reader - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96-well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom - black plates
Multichannel pipette (8 - 12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)