Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T

Resumen

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Resumen

Presentamos una adaptación de la novela del ensayo de migración celular Radial monocapa, informó por primera vez para medir la migración radial de las células tumorales adherentes en las proteínas de la matriz extracelular, para la medición de la motilidad de las células marcadas con fluorescencia, humanos no adherente o efectoras inmunes murino. Esta técnica emplea un colector de acero inoxidable y 10 pocillos deslizante de Teflon para depositar focalmente células T no adherentes en los pocillos preparadas con monocapas confluentes de células tumorales o proteínas de la matriz extracelular. Microscopía de fluorescencia de luz y / o multi-canal se utiliza para seguir el movimiento y comportamiento de las células efectoras con el tiempo. Los colorantes fluorescentes y / o vectores virales que codifican para transgenes fluorescentes se utilizan para etiquetar diferencialmente los tipos de células para la imagen. Este método es distinto del de tipo similar en ensayos in vitro que el seguimiento de la migración / invasión horizontal o vertical utilizando cámaras de diapositivas, agar o transwell placas. El ensayo permite que los datos detallados de imagen para Be recogido con diferentes tipos de células que se distinguen por marcadores fluorescentes específicos; incluso subpoblaciones específicas de células (es decir, transducidas / nontransduced) pueden ser monitoreados. Parcelas de superficie intensidad de fluorescencia se generan utilizando canales específicos de fluorescencia que se corresponden con el tipo de célula que migra. Esto permite una mejor visualización de la movilidad de las células inmunes no adherente en momentos específicos. Es posible reunir pruebas de otras funciones de células efectoras, tales como la citotoxicidad o la transferencia de vectores virales de efector a células diana, también. Por lo tanto, el método permite a los investigadores documentan microscópicamente-célula a célula interacciones de diferencialmente marcado con, no adherente con células adherentes de diferentes tipos. Dicha información puede ser especialmente relevante en la evaluación de tipos de células inmunes biológicamente manipuladas o activados, cuando se desea una prueba visual de la funcionalidad con las células diana tumorales antes de su uso para la terapia del cáncer.

Introducción

El ensayo de migración de células Radial monocapa se desarrolló originalmente para medir las propiedades infiltrantes de células tumorales adherentes ^1-4 en portaobjetos recubiertos con matriz extracelular (ECM), las proteínas ^5-7 o con componentes de ECM individuales, tales como fibronectina o laminina ^1,2. La técnica involucrada sembrar una suspensión de células individuales de células tumorales en el centro de pozos utilizando un colector de células de sedimentación de acero inoxidable (CSM). Después de la sedimentación, las células tumorales se adherirá a la parte inferior del pozo y el cambio en el diámetro de la población celular inicial en el tiempo se utilizó para establecer una tasa de movilidad horizontal. El ensayo de migración de células Radial Monocapa proporciona una ventaja visual sobre otros métodos existentes que emplean transwell placas de ensayo de las capacidades migratorias in vitro de células; estos ensayos no son propicias para la imagen ^8. Además, también proporciona una gran cantidad de libertad en la elección del punto de tiempos cuando se evalúa la migración, sin límite en el número de puntos de tiempo un investigador podría elegir a la imagen después de la sedimentación.

Debido a que la capacidad de migrar es una funcionalidad importante para las células no adherentes, especialmente en el área de la inmunoterapia o donde pueden ser utilizados como vehículos de administración para los vectores virales, se adaptó el uso de la CSM para evaluar la migración de células no adherentes tipos en monocapas de células tumorales, además de las proteínas de ECM. El beneficio añadido de microscópicamente la visualización de la migración de las células no adherentes en monocapas de células tumorales viables, en ECM complejo aislado del tumor, o en los componentes de ECM individuales hace que este ensayo versátil. Los ensayos que emplean pocillos recubiertos con una sola proteína extracelular no reflejan con exactitud el sustrato tejido o tumor ECM las células se migrar a través in vivo.

Aquí, utilizamos alorreactivas linfocitos T citotóxicos (alloCTL), sensibilizados a gran histocompcomplejo atibility (MHC) de proteínas utilizando reacciones unidireccional de células tumorales de linfocitos mixtos (MLTR) o reacciones de linfocitos mixtos (MLR) ^9, como nuestro representante tipo de células no adherentes. Hemos probado células tanto de origen humano y murino. Cuando la migración se midió en monocapas tumorales, las células tumorales empleadas eran objetivos, ya sea parcial pertinentes, se presentan algunas de las mismas proteínas MHC se encuentran en la población de células utilizado para sensibilizar a los efectores, o metas plenamente pertinentes, con un conjunto completo de moléculas del MHC que el efectores habían sensibilizado hacia. En algunos experimentos, se utilizó CellTracker fluorescente de color rojo CMPTX o tinte proliferación celular eFluor 670 para diferenciar entre las células efectoras y diana. También utilizamos la transducción con codificación de vectores virales para proteínas fluorescentes como una forma adicional de visualizar las células. Para ciertos ensayos, transduced la alloCTL con vectores retrovirales de replicación (RRV) que codifican para el verde esmeralda (EMD) de la proteína fluorescente ^10,11; para othres, las células tumorales fueron transducidas con vectores lentivirales que codifican mStrawberry.

El alloCTL se sembraron a través de un canal del colector en el centro de cualquiera de las monocapas de células tumorales o ECM cosechadas a partir de monocapas de células tumorales. Interacciones de las células adherentes y no adherentes se visualizaron por la luz y / o por microscopía de fluorescencia con el tiempo. Interrupción en la monocapa de células tumorales a baja potencia, o tumorales células con núcleos fragmentados a alta potencia fueron los indicadores de lesión celular por lisis y la apoptosis, respectivamente. Hemos creado digitalmente mapas fluorescentes intensidad superficie que muestran la migración de las células fluorescentes T no adherentes en los cultivos en monocapa. También notamos la citotoxicidad engendró a la monocapa de células de glioma adherente después de la formación de agrupaciones de la alloCTL no adherente superpuesto. Además, se observó la transducción horizontal de RRV-EMD desde el alloCTL a la monocapa de glioma.

Protocolo

1. Preparación de los portaobjetos

1. Insertar diapositivas colector de sedimentación celular en bolsas de esterilización y selle con cinta de autoclave. Oriente el lado recubierto de teflón de la corredera del lado del papel de la bolsa para evitar los depósitos de plástico en los pozos.
2. Bolsas de autoclave durante 15 min a 121 ° C.
3. Saque los portaobjetos de la bolsa de esterilización dentro de una cabina de bioseguridad y colocar en un 150 x 15 mm placa de Petri estéril estéril. Hasta cuatro diapositivas puede caber por plato. Colocar una placa de 35 x 10 mm Petri junto a las diapositivas. Añadir 2-3 ml de _H2O estéril para proporcionar humidificación.
4. Diapositivas pre-capa con poli-D-lisina en 100 g / ml mediante el uso de un volumen suficiente para cubrir la totalidad de bien. Después de una hora a RT, aspirar la solución y enjuague la superficie del pozo dos veces pipeteando 1x PBS sobre la superficie de los pocillos.
5. Opcionalmente, añadir fibronectina u otros componentes de ECM para asegurar más fuerte adherencia de las células del tumor. Añadir fibronectina a 5 g / ml en un volumen suficiente That los pozos no se secará dentro de un período corto de tiempo a temperatura ambiente.
   1. Después de 1 hora, aspirar la solución sobrante y lavar dos veces con la pipeta hacia arriba y abajo con 1x PBS.
6. Mantenga PBS en los pozos hasta que el tumor está listo para la siembra. Uso desliza el mismo día.
7. Cosecha de un matraz confluente de el tipo de célula tumoral adherente deseado. Contar las células viables mediante exclusión con colorante azul de tripano por microscopía de luz y resuspender en 5 x 10 ⁶ células / ml en el ejemplo medio para el crecimiento adecuadamente tamponada con, medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS), L- glutamina y piruvato de sodio.
8. Si se desea imágenes fluorescentes de la población de células adherentes, etiquetar la población celular adherente con un colorante fluorescente vital o un colorante de la proliferación de células siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante.
9. Suavemente pipeta de 10 l de medio completo en cada pocillo de la atención de diapositivas tomar para evitar la creación de burbujas en el wells, ya que estos pueden prevenir uniforme adherencia de las células del tumor.
10. Añadir 2,5-5,0 x 10 ⁴ células (5-10 l de suspensión celular) al medio en cada pocillo (Figura 1A). Ajuste el número óptimo dependiendo del tipo de célula tumoral y el número de días de crecimiento deseados. Las células tumorales más grandes o células de crecimiento rápido pueden requerir un menor número de células inicialmente. Aumentar el volumen así hasta 40 l mediante la adición de medio y pipeta de arriba y abajo para asegurar una distribución uniforme de las células.
11. Después de todos los pozos se siembran, permitir que las células tumorales se adhieran a temperatura ambiente, a continuación, coloque la tapa en el 150 x 15 mm placa de Petri y se mueven con cuidado el plato a un incubador humidificado 37 ° C / 5% de CO ₂ durante al menos 24 horas.
12. Cambie el medio de cultivo a diario. Pipetear con cuidado una porción del medio gastado de la monocapa y reemplazar con medio completo fresco.
    NOTA: Debido a la evaporación, será necesario añadir que fue tomada más volumen. Wells estará listo para el ensayo cuando un par, confluente capa de células está presente. Esto es típicamente 1-3 días después de la siembra inicial.
13. Lave suavemente monocapa una vez con PBS como se describe en el paso 1.4 y, o bien continúe con el paso 2 si se desean monocapas, o al paso por debajo de 1,13 para extraer proteínas ECM de la monocapa.
14. Hacer una Triton-X (v / v) solución al 0,5% en medio completo y añadir 30 l a cada pocillo. Deje monocapa digerir en campana durante 2 min, luego lavar dos veces con medio completo mediante pipeteo como se describe anteriormente.
    NOTA: La capa de ECM puede ser visible al microscopio óptico (Figura 2). Utilice diapositivas de inmediato, o mantener en medio completo en el humidificado incubadora de CO ₂ durante 1-2 días. No permita que los pocillos se sequen.

2. La sedimentación de las células T no adherentes en un portaobjetos

1. Si se desea una imagen fluorescente de la población de células no adherentes, etiquetar las poblaciones de células no adherentes con un tinte fluorescente de vital importancia, como la CFSE, Cell Rastreador Red CMPTX o eFluor670 siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante al menos 1 hr antes de la prueba. Alternativamente, manipular las células para expresar proteínas fluorescentes codificadas por los vectores virales.
2. Autoclave el colector de sedimentación celular en una bolsa de autoclave como se describe en 1.2 anteriormente.
3. Retire la cámara de humidificado contiene diapositivas recubiertos de teflón de la incubadora y el lugar en el gabinete de seguridad biológica.
4. Lavar los pocillos con PBS 1x pipeteando arriba y abajo, a continuación, añadir 45 l de medio completo que contiene al menos 10% de suero.
5. Retire el colector de la envoltura de esterilización y deslice cuidadosamente en más de los pocillos hasta que el "gancho" en el extremo del colector toca la parte inferior de la corredera (Figura 1B).
6. Asegúrese de que el medio de cultivo es visible en cada uno de los canales. Si ninguno se ve, quitarse el colector y añadir más medio al pocillo correspondiente, luego vuelva a colocar y puedes volver a intentarlo.
7. Repita el paso 2.5 para cada channel del colector, o para tantos pozos como se desee.
8. Contar las células no adherentes y volver a suspender a no menos de 1,0 a 2,0 x 10 ⁵ / l. Elaborar 1 l de células y lentamente la pipeta ellos en el canal (Figura 1C). Haga esto para cada bien deseado.
9. Deja todo el aparato cargado célula, es decir, del colector y de diapositivas, dentro de la bio-campana durante 20-30 min para permitir que las células en el canal se asienten.
10. Retire el colector al tocar ambos extremos y levantando suavemente de él hacia arriba de la diapositiva con el fin de no molestar a las células focalmente sembradas en el centro de los pozos (Figura 1D).
11. Inspeccionar cada pocillo para asegurar que las células no adherentes se han sembrado con éxito en el centro de la así permanecer dentro de la circunferencia del canal colector. Las células no adherentes se adhieran idealmente ligeramente a la monocapa o ECM y entre sí, por lo tanto, moviendo suavemente el portaobjetos alrededor no causará la pelle celulart para dispersar. No empujar la diapositiva.

3. Microscopía de Fluorescencia

1. Con el equipo experimental apropiado, realizar la proyección de imagen después de que se confirmó la sedimentación. Lo ideal es utilizar un microscopio que está equipado con una cámara de CO ₂ y la humedad. Imagen a baja potencia, es decir, 4X o 10X, para permitir múltiples imágenes para ser tomado de un área más grande para que la totalidad del bien puede ser visto.
2. Adquirir imágenes digitales usando el software de captura de imágenes. Realizar campo claro y / o imágenes de fluorescencia multi-canal.
3. Si lo desea, configure una de lapso de tiempo para grabar imágenes en diferentes canales sobre un área determinada, o mantener la diapositiva humidifica y en un / 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C y manualmente sacar a la imagen en los puntos de tiempo deseados (Figura 1E y F, se recomienda para los puntos de tiempo más largos).

4. Análisis y Visualización

1. El uso de software de edición de imagen, combinar la luz y la flimágenes fluorescentes en una sola capa para múltiples tipos de células y los marcadores se pueden ver en la misma imagen. Arrastre y suelte los archivos de imagen para cada color individual en el programa y, cuando se le solicite, seleccione la opción "Añadir Capa" para crear un archivo de imagen con múltiples capas.
   1. A mayor aumento, tomar, alinear y unir juntos las imágenes de todo el bien digitalmente. Alinear archivos mirando a regiones conservadas entre dos imágenes y la superposición de una imagen en la parte superior de la otra hasta que una imagen completa se genera.
2. Añadir bares micras a las imágenes durante la adquisición usando el software de captura para determinar la distancia células individuales han migrado.
3. Para determinar la migración de células en diversos momentos, hacer mapas de intensidad de fluorescencia superficie con la imagen del software, es decir, ImageJ, para cuantificar la agregación de células T fluorescente o extendido en el tiempo.
   1. Para generar representaciones gráficas de superficie, tomar una imagen con capas generada en el paso 4.1 y bajo la ventana de capas,desactive todas las capas excepto las correspondientes al canal deseado. Por ejemplo, si se desea un gráfico de superficie para visualizar la expresión de EMD, sólo las capas "verdes" que corresponde al filtro utilizado para este marcador debe ser visible.
   2. Aplanar la imagen y guardarla en un formato de archivo reconocido (por ejemplo, .png) y cargar la imagen en el programa. Para generar el gráfico de superficie, cambiar el tipo de imagen de 8 bits, cambiar el brillo / contraste, según sea necesario para reducir el fondo, y seleccione la opción "Analizar / Superficie Terreno». Las imágenes de la Figura 5 se generaron mediante la comprobación de la 'sombra', 'Dibuja Axis', 'Un polígono por línea ", y casillas de verificación" suave ".
   3. Otra opción es tomar mediciones utilizando el radio o el diámetro del depósito de células focal en el tiempo cero y comparar a las células en el punto más exterior en diferentes momentos. El diámetro de los pozos de teflón es 6,0 mm.

Resultados

Los vectores virales que codifican para las proteínas fluorescentes se pueden utilizar además de, o en lugar de, tinte fluorescente. Transducción viral se debe realizar antes de el ensayo de motilidad. Ambos tipos de células adherentes y no adherentes pueden ser marcados de forma diferencial. El protocolo para la transducción dependerá del tipo de vector utilizado. Aquí, transduced la alloCTL en las figuras 3, 5 y 6 con RRV-EMD al menos dos días de anticipación de la prueba uti...

Discusión

Las células tumorales en una suspensión de células se pipetearon en los pocillos de un portaobjetos de Teflon-enmascarado. Las células se dejaron adherir y luego formaron monocapas en un humidificado 5% de CO _2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocapas establecidas o proteínas ECM derivados de la monocapa pueden ser cosechadas para estos ensayos (Figura 1B). Linfocitos T efectores marcados con colorantes fluorescentes vitales o transducidas con vectores que codifican pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-masked microscope slides	Creative Scientific Methods	CSM002
Cell Sedimentation Manifold	Creative Scientific Methods	CSM001
Petri Dish, 150mm	Corning	430597
Petri Dish, 35mm	Corning	430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Mediatech	21-040
20 μl Pipetman	Gilson	F123600
200 μl Pipetman	Gilson	F123601
200 μl pipette tips	VWR	89003-060
Distilled, deionized water (sterile)	Mediatech	25-055
Trypsin	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (optional)	Gibco	12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V serum-free media	Invitrogen	12055-083
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced	Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
Fibronectin	BD	354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH