Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten

Zusammenfassung

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Zusammenfassung

Wir berichten über einen neuartigen Anpassung des Radialmonolayer-Zellmigrationsassay ersten gemeldet, um die radiale Migration von adhärenten Tumorzellen an extrazellulären Matrixproteinen zu messen, zur Messung der Beweglichkeit der fluoreszierend markierten, nicht-adhärente humane oder murine Effektor Immunzellen. Diese Technik verwendet ein nichtrostender Stahl und vielfältigen 10-Well-Teflon-Folie, um fokal einzahlen nicht haftende T-Zellen in die Vertiefungen entweder konfluent Tumorzellmonoschichten oder extrazellulären Matrixproteinen vorbereitet. Licht und / oder Mehrkanal-Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet wird, um die Bewegung und das Verhalten der Effektorzellen über die Zeit verfolgen. Fluoreszenzfarbstoffe und / oder virale Vektoren, die Code für fluoreszierende Transgenen verwendet werden, um differentiell zu markieren, die Zelltypen für die Bildgebung. Diese Methode unterscheidet sich von ähnlichen Typs in-vitro-Tests, die horizontale oder vertikale Migration / Invasion Verwendung Schiebekammern, Agar oder Transwell-Platten zu verfolgen. Der Test ermöglicht die detaillierte Bilddaten zu be mit verschiedenen Zelltypen mit spezifischen Fluoreszenzmarkern unterschieden gesammelt; sogar spezifische Subpopulationen von Zellen (dh transduziert / transduzierten) überwacht werden kann. Oberflächen Intensität Fluoreszenz Grundstücke werden mit speziellen Fluoreszenzkanälen, die zu migrierenden Zelltyp entsprechen generiert. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung der nichthaftImmunZellMobilität zu bestimmten Zeiten. Es ist auch möglich, Belege für andere Effektorzelle Funktionen wie Zytotoxizität oder der Übertragung von viralen Vektoren, die von Effektorzellen zu Zielzellen zu sammeln, als auch. Somit ermöglicht das Verfahren die Forscher mikroskopisch dokumentieren Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen von differentiell markierten, nicht-haftend mit adhärenten Zellen verschiedener Typen. Solche Informationen können besonders relevant bei der Beurteilung von biologisch manipuliert oder aktivierten Immunzelltypen, wo visuelle Nachweis der Funktionsfähigkeit mit Tumorzielzellen vor ihrer Verwendung zur Krebstherapie erwünscht.

Einleitung

Der Radial Monolayer-Zellmigrationsassay wurde ursprünglich entwickelt, um die Infiltrationseigenschaften von adhärenten Tumorzellen ^1-4 auf Objektträger mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteine ^​​5-7 oder mit einzelnen ECM-Komponenten, wie Fibronectin oder Laminin ^1,2 beschichtet messen. Die Technik involviert Animpfen einer Einzelzellsuspension von Tumorzellen in der Mitte der Vertiefungen unter Verwendung eines Edelstahl Zellsedimentation Verteiler (CSM). Nach Sedimentation würden die Tumorzellen an der Unterseite der Wanne und der Änderung des Durchmessers des anfänglichen Zellpopulation im Laufe der Zeit festhalten wurde verwendet, um eine Rate der horizontalen Beweglichkeit herzustellen. Die Radial Monolayer Zellmigration Test vorgesehen eine visuelle Vorteil gegenüber anderen existierenden Methoden, die Transwell-Platten, die in-vitro-Migrationsfunktionen von Zellen zu untersuchen beschäftigt; diese Tests sind nicht förderlich für die Bildgebung ^8. Wie gut, sondern auch bei der Auswahl der vorgesehenen Zeitpunkt eine große Menge an Freiheits, wenn die Migration untersucht, ohne Begrenzung auf die Anzahl der Zeitpunkte ein Forscher könnte nach der Sedimentation zu Bild auszuwählen.

Weil die Migrationsfähigkeit ist eine wichtige Funktion für die nicht-anhaftenden Zellen, insbesondere auf dem Gebiet der Immuntherapie oder wo sie als Abgabevehikel für virale Vektoren verwendet werden, geeignet ist der Einsatz der CSM, die Migration von nicht-adhärenten Zellen zu bewerten Typen auf Tumorzellschichten, zusätzlich zu den ECM-Proteine. Der zusätzliche Vorteil der mikroskopisch Visualisierung der Migration von nicht-adhärenten Zellen zu lebensfähigen Tumorzellschichten, auf komplexen ECM aus dem Tumor oder an einzelnen ECM Komponenten isoliert macht dieses Assay vielseitig. Assays, die Vertiefungen, die mit einem einzigen extrazellulären Protein beschichtet beschäftigen nicht genau weiß das ECM-Gewebesubstrat oder Tumor die Zellen würden durch in vivo zu migrieren.

Hier haben wir alloreaktiven zytotoxische T-Lymphozyten (alloCTL), zu den wichtigsten histocomp sensibilisiertatibility Komplex (MHC) -Proteinen mit Einweg gemischten Lymphozytentumorzellreaktionen (MLTR) oder gemischten Lymphozytenreaktionen (MLR) ^9, wie unsere repräsentative nicht-adhärenten Zelltyp. Wir testeten Zellen der menschlichen und murinen Ursprungs. Bei der Migration wurde auf Tumormonoschichten gemessen, waren die Tumorzellen eingesetzt entweder teilweise relevanten Ziele und zeigt einige der gleichen MHC-Proteinen auf der Zellpopulation verwendet, um die Effektoren oder vollständig relevanten Ziele, mit einem kompletten Satz von MHC-Molekülen zu sensibilisieren gestellt, dass die Effektoren hatte gegen sensibilisiert. In einigen Experimenten wurden fluoreszierende Celltracker Red CMPTX oder Zellproliferation Farbstoff eFluor 670 zwischen Effektor- und Zielzellen zu unterscheiden. Wir haben auch die Transduktion mit viralen Vektoren Codierung für fluoreszierende Proteine ​​als weitere Möglichkeit, um die Zellen zu visualisieren. Für bestimmte Tests, transduziert wir die alloCTL mit retroviralen Vektoren zu replizieren (RRV) für Emerald Green (EMD) fluoreszierendes Protein kodierende ^10,11; für othten, wurden Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren für mStrawberry Codierungs transduziert.

Die alloCTL wurden durch einen Kanal des Verteilers in die Mitte der beiden Tumorzellschichten oder ECM aus Tumorzellmonolayer geerntet ausgesät. Adhärenten und nicht-adhärenten Zell Wechselwirkungen wurden durch Licht und / oder durch Fluoreszenzmikroskopie im Laufe der Zeit sichtbar. Störung in der Tumorzellschicht mit geringer Leistung oder Tumorzellen mit fragmentierten Kernen mit hoher Leistung waren Indikatoren der Zellschädigung durch Lyse und Apoptose auf. Wir digital erstellt Oberfläche Intensität fluoreszierender Karten, auf denen die Migration von nicht-haftenden fluoreszierenden T-Zellen in den Monolayer-Kulturen. Wir haben auch darauf hingewiesen, die Zytotoxizität erzeugt, um die adhärenten Gliom-Zellmonolayer nach Clusterbildung der überlagerten nicht haft alloCTL. Wie gut, horizontal Transduktion RRV-EMD von der alloCTL auf die Gliom Monolage beobachtet.

Protokoll

1. Schieben Vorbereitung

1. Legen Zellsedimentation Manifold gleitet in Sterilisationsbeutel und Dichtung mit Autoklav-Band. Vor der Teflon-beschichteten Seite des Schiebers die Papierseite des Beutels an Kunststoff Ablagerungen auf den Vertiefungen zu vermeiden.
2. Autoklav Beutel für 15 min bei 121 ° C.
3. Objektträger aus Sterilisationsbeutel in einer Biosicherheitswerkbank und in eine sterile 150 x 15 mm sterilen Petrischale. Bis zu vier Dias pro Gericht passen. Legen Sie eine 35 x 10 mm Petrischale neben den Folien. Fügen Sie 2-3 ml sterilem H ₂ O, um Befeuchtung zu schaffen.
4. Precoat-mit Poly-D-Lysin an 100 ug / ml unter Verwendung von genügend Volumen, um gut decken die gesamte. Nach einer Stunde bei RT absaugen und spülen Sie die Oberfläche der Wanne zweimal durch Pipettieren 1x PBS über die Oberfläche der Vertiefungen.
5. Fügen Sie optional Fibronektin oder andere ECM-Komponenten zu einer stärkeren Tumorzellhaftung zu gewährleisten. Hinzufügen Fibronektin bei 5 ug / ml in genügend Volumen That den Vertiefungen wird nicht trocken in einem kurzen Zeitraum bei Raumtemperatur.
   1. Nach 1 Stunde, saugt den Restlösung und waschen zweimal durch Auf- und Abpipettieren mit 1x PBS.
6. Halten PBS auf den Brunnen, bis Tumor ist bereit für die Beschichtung. Verwendung gleitet am selben Tag.
7. Ernte einen konfluenten Flasche des gewünschten adhärenten Tumorzelltyp. Zählen lebensfähiger Zellen mit Trypan-Blau-Farbstoffausschluss durch Lichtmikroskopie und Resuspension in 5 x 10 ⁶ Zellen / ml in ausreichend gepuffert Wachstumsmedium, beispielsweise Dulbeccos minimal essential medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), L- Glutamin und Natriumpyruvat.
8. Wenn Fluoreszenzabbildung der adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die adhärente Zellpopulation mit einem Vitalfluoreszenzfarbstoff oder ein Zellproliferations Farbstoff nach den Protokollen des Herstellers.
9. Sanft Pipette 10 ul Vollmedium in jede Vertiefung des Objektträgers kümmert, damit Sie keine Blasen in der wells, da diese einheitliche Tumorzellhaftung zu verhindern.
10. Hinzufügen 2,5-5,0 x 10 ⁴ Zellen (5-10 ul Zellsuspension) zu dem Medium in jeder Vertiefung (1A). Stellen Sie die optimale Anzahl in Abhängigkeit von Tumorzelltyp und der Anzahl von Tagen Wachstum erwünscht. Größere Tumorzellen oder schnell wachsende Zellen weniger Zellen erfordern zunächst. Bringen Sie auch Volumen von bis zu 40 & mgr; l durch Zugabe von Medium und Pipette auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
11. Nachdem alle Vertiefungen ausgesät, damit die Tumorzellen bei RT auf dem 150 x 15 mm Petrischale haften, dann setzen Sie den Deckel vorsichtig bewegen Sie den Spiegel auf eine 37 ° C / 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator für mindestens 24 Stunden.
12. Ändern Sie das Kulturmedium täglich. Einen Teil des verbrauchten Mediums aus der Monolage vorsichtig pipettieren und ersetzen mit frischem Vollmedium.
    Hinweis: Wegen der Verdampfung, mehr Volumen benötigen als entnommen wurde hinzugefügt. Wells ist bereit für Test, wenn eine gleichmäßige, confließend Schicht von Zellen vorhanden ist. Dieser ist in der Regel 1-3 Tage nach der ersten Aussaat.
13. Sanft einmal waschen Monolayer mit PBS, wie in Schritt 1.4 beschrieben und entweder zu Schritt 2, wenn Monoschichten erwünscht sind, oder mit Schritt 1.13 ECM-Proteine ​​aus der Monoschicht zu extrahieren.
14. Einen 0,5% Triton-X (v / v) Lösung in komplettem Medium und füge 30 ul in jede Vertiefung. Lassen Mono verdauen Kapuze für 2 Minuten, dann waschen zweimal mit komplettem Medium mit einer Pipette wie oben beschrieben.
    HINWEIS: Die ECM-Schicht kann durch Lichtmikroskopie (Figur 2) angezeigt werden. Verwenden Sie Folien sofort, oder halten Sie in vollständigem Medium in der befeuchteten CO ₂ Inkubator für 1-2 Tage. Lassen Sie die Vertiefungen zu trocknen.

2. Sedimentation Nicht anhaftende T-Zellen auf Slide

1. Wenn Fluoreszenzabbildung des nicht-adhärenten Zellpopulation gewünscht ist, kennzeichnen die nicht-adhärenten Zellpopulationen mit einem Vital fluoreszierenden Farbstoff wie CFSE, Cell Tracker Red CMPTX oder eFluor670 durch Befolgen der Protokolle des Herstellers mindestens 1 Stunde vor dem Test zur Verfügung gestellt. Alternativ zu manipulieren Zellen fluoreszierende Proteine ​​durch virale Vektoren kodiert wird.
2. Autoklavieren den Zellsedimentation vielfältig in einem Autoklav Beutel wie oben in 1.2 beschrieben.
3. Entfernen Sie den befeuchteten Kammer mit Teflon beschichtete Objektträger aus dem Inkubator und in biologischen Sicherheitsschrank.
4. Waschen Vertiefungen mit 1x PBS durch Auf- und Abpipettieren, dann fügen Sie 45 ul Vollmedium mindestens 10% Serum mit.
5. Entfernen des Verteilers aus der Sterilisationsumschlag bilden und vorsichtig in den Vertiefungen bis 'Haken' am Ende des Verteilers berührt den unteren Rand der Folie (1B).
6. Sicherstellen, dass das Kulturmedium in jedem der Kanäle sichtbar ist. Wenn keine zu sehen ist, nehmen Sie die vielfältigen und noch mehr auf das entsprechende Medium gut, dann ersetzen und erneut prüfen.
7. Wiederholen Sie Schritt 2.5 für jede channel des Verteilers oder für so viele Vertiefungen nach Wunsch.
8. Zählen nicht-adhärenten Zellen und Resuspension bei mindestens 1,0-2,0 x 10 ⁵ / & mgr; l. Auszuarbeiten 1 ul Zellen und langsam pipettiert sie in den Kanal (Abbildung 1C). Tun Sie dies für jede Vertiefung gewünscht.
9. Lassen Sie die gesamte Zelle geladenen Gerät, also vielfältig und Rutsche, in der Bio-Haube für 20-30 Minuten, damit sich die Zellen in den Kanal zu begleichen.
10. Entfernen Sie die vielfältigen, indem Sie beide Enden und leichtes Anheben sie gerade nach oben von der Folie, um die Zellen fokal in der Mitte der Brunnen (1D) ausgesät nicht stören.
11. Untersuchen jeder Vertiefung, um sicherzustellen, daß die nicht-adhärenten Zellen wurden erfolgreich in der Mitte des Bohrlochs innerhalb des Umfangs des Verteilerkanals bleiben ausgesät. Die nichthaftenden Zellen werden in idealer leicht auf der Monoschicht oder ECM und aneinander haften daher sanft bewegt den Schieber herum wird die Zelle nicht Pelle verursachent zu zerstreuen. Drängen Sie nicht die Folie.

3. Fluoreszenzmikroskopie

1. Bei entsprechender experimentelle Ausstattung, führen Sie die Bild nach Sedimentation wird bestätigt. Idealerweise mit einem Mikroskop, das mit einem CO ₂ und Luftfeuchtigkeit Kammer ausgestattet ist. Bild mit geringer Leistung, das heißt, 4X oder 10X, um mehrere Bilder zu ermöglichen, von einer größeren Fläche aufgenommen, so dass die Gesamtheit der gut eingesehen werden kann.
2. Erwerben Sie digitale Bilder mit Aufnahmesoftware. Führen Hellfeld und / oder der Mehrkanal-Fluoreszenz-Imaging.
3. Falls gewünscht, kann ein Zeitraffer-Bilder in verschiedenen Kanälen über einen bestimmten Bereich aufzunehmen, oder halten Sie den Schiebe befeuchtet und in einem 37 ° C / 5% CO ₂ Inkubator und von Hand nehmen, um Bild zu den gewünschten Zeitpunkten (Bild gesetzt 1E & F, für längere Zeitpunkten empfohlen).

4. Analyse und Anzeige

1. Mit Bildbearbeitungssoftware, verschmelzen Licht und fluorescent Bilder in eine Schicht, so dass mehrere Zelltypen und Marken können in der gleichen Bildes gesehen werden. Ziehen Sie die Bilddateien für jede einzelne Farbe in das Programm und, wenn Sie gefragt werden, wählen Sie die "Ebene hinzufügen" Option, um eine Image-Datei mit mehreren Ebenen erstellen.
   1. Bei höherer Vergrößerung nehmen, ausrichten und zusammenfügen von Bildern über das auch digital. Richten Sie Dateien, indem du konservierten Regionen zwischen zwei Bildern und Überlagerung eines Bildes auf dem anderen, bis ein vollständiges Bild erzeugt.
2. Fügen Mikron Bars um Bilder bei der Aufnahme mit Hilfe der Capture-Software zur Entfernung einzelner Zellen gewandert sind zu bestimmen.
3. Zur Bestimmung der Zellmigration zu verschiedenen Zeiten, stellen Oberfläche Intensität Fluoreszenz-Karten mit Software-Image, dh ImageJ, um fluoreszierende T-Zell-Aggregation oder über die Zeit verteilt zu quantifizieren.
   1. Um Oberflächendarstellung zu erzeugen, nehmen Sie ein Bild mit Ebenen in Schritt 4.1 und unter dem Fenster Ebenen erzeugt,Deaktivieren Sie alle Ebenen außer die, die entsprechend dem gewünschten Kanal. Zum Beispiel, wenn eine Oberflächendarstellung gewünscht ist, EMD Ausdrucks sichtbar zu machen, nur die "grüne" Schichten entsprechend dem für diesen Marker verwendete Filter sollte sichtbar sein.
   2. Glätten Sie das Bild und speichern Sie sie in einem Dateiformat erkannt (zB PNG) und laden Sie das Bild in das Programm. Um die Oberfläche des Grundstückes zu erzeugen, ändern Sie den Bildtyp auf 8-bit, ändern Sie die Helligkeit / Kontrast wie notwendig, um den Hintergrund zu reduzieren, und wählen Sie die "Analyze / Surface Plot 'Option. Die Bilder in Abbildung 5 wurden, indem Sie die "Schatten", "Draw-Achse", "Ein Polygon pro Zeile" und "Smooth" Checkboxen generiert.
   3. Alternativ nehmen Messungen mit dem Radius oder Durchmesser von der Brennzelle Ablagerung zum Zeitpunkt Null und im Vergleich zu den Zellen im äußersten Punkt zu unterschiedlichen Zeiten. Der Durchmesser der Teflon Vertiefungen beträgt 6,0 mm.

Ergebnisse

Virale Vektoren kodierend für fluoreszierende Proteine ​​können zusätzlich zu oder anstelle der Fluoreszenzfarbstoff verwendet werden. Virale Transduktion sollte vor der Motilität Assay durchgeführt werden. Sowohl adhärenten und nicht-adhärenten Zelltypen kann differentiell markiert. Das Protokoll für die Weiterleitung von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Hier transduziert wir alloCTL in den 3, 5 und 6 mit RRV-EMD mindestens zwei Tage vor dem Test unter Verwendung ...

Diskussion

Tumorzellen in einem Einzelzellsuspension wurden in die Vertiefungen einer Teflon-maskiert Schieber pipettiert. Man ließ die Zellen anhaften und dann in einer befeuchteten 5% CO _2, 37 ° C-Inkubator (1A) gebildete Monoschichten. Etablierte Monoschichten oder ECM-Proteine ​​aus der Monoschicht abgeleitet könnte für diese Assays (1B) geerntet werden. Effektor-T-Lymphozyten mit vitalen Farbstoffen markiert oder mit Vektoren für EMD Codierungs transduziert wurden in der M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-masked microscope slides	Creative Scientific Methods	CSM002
Cell Sedimentation Manifold	Creative Scientific Methods	CSM001
Petri Dish, 150mm	Corning	430597
Petri Dish, 35mm	Corning	430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Mediatech	21-040
20 μl Pipetman	Gilson	F123600
200 μl Pipetman	Gilson	F123601
200 μl pipette tips	VWR	89003-060
Distilled, deionized water (sterile)	Mediatech	25-055
Trypsin	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (optional)	Gibco	12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V serum-free media	Invitrogen	12055-083
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced	Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
Fibronectin	BD	354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH