레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

요약

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

초록

우리는 먼저 형광 표지 된, 비 - 부착 인간 또는 뮤린 효과기 면역 세포의 운동성을 측정하기 위해, 세포 외 기질 단백질에 부착 된 종양 세포의 반경 방향 이동을 측정하는 것으로보고, 방사형 단층 세포 이동 분석법 신규 적응을보고한다. 이 기술은 스테인리스 매니 폴드 10 웰 테플론 슬라이드 국소 적 융합 성 종양 세포 단층 또는 세포 외 기질 단백질로 제조 중 웰로 미부착 된 T 세포를 증착하기 위해 사용한다. 광 및 / 또는 다 채널 형광 현미경은 시간이 지남에 이펙터 세포의 이동 및 동작을 추적하는 데 사용된다. 형광 염료 및 / 또는 형광 유전자에 대한 코드가 차등 이미징 세포 유형에 라벨을 사용하는 바이러스 벡터. 이 방법은 슬라이드 챔버, 한천 또는 트랜스 웰 플레이트를 이용하여 수평 또는 수직 마이그레이션 / 침략을 추적 체외 분석에서 비슷한 유형 구별된다. 분석은 상세한 영상 데이터가 ㄱ 할 수 있습니다특정 형광 마커에 의해 구별 다른 종류의 세포로 수집 된 전자; 세포의 경우에도 특정 하위 집단 (즉, nontransduced / 형질)을 모니터링 할 수 있습니다. 표면 강도 형광 플롯 이주 셀 타입에 대응하는 특정 형광 채널을 이용하여 생성된다. 이것은 특정 시간에 비 부착 면역 세포 이동의 더 나은 시각화 할 수 있습니다. 그것은뿐만 아니라, 세포를 대상으로 같은 세포 독성 또는 이펙터에서 바이러스 벡터의 전송과 같은 다른 이펙터 세포 기능의 증거를 수집 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 연구자들이 다양한 유형의 미시적 부착 세포 차분 적 표지 된, 비 - 부착의 세포 간 상호 작용을 기록 할 수있다. 이러한 정보는 기능의 시각적 증거가 암 치료를위한 이들의 사용 전에 종양 표적 세포에 요구되는 생물학적 활성 또는 조작 면역 세포 유형의 평가에 특히 적합 할 수있다.

서문

방사형 단층 세포 이동 분석은 원래 세포 외 기질 (ECM) 단백질 ^5-7 또는 피브로넥틴 또는 라미닌 ^1,2- 개별 ECM 성분으로 코팅 된 슬라이드 부착 성 종양 세포의 ^1-4 침윤성 특성을 측정하기 위해 개발되었다. 기술은 스테인레스 스틸 셀 침강 매니 폴드 (CSM)을 사용하여 웰의 중심에 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 시딩 관여. 침전 후, 종양 세포는 수평 운동의 속도를 설정하는 데 사용 된 시간과 웰 위에 초기 세포 집단의 직경 변화의 하단에 부착된다. 방사형 단층 세포 이동 분석은 세포의 체외 철새 능력을 분석하는 트랜스 웰 플레이트를 채용 기존의 방법에 비해 시각적 인 장점을 제공; 이러한 분석은 촬상 ⁸ 비 이바지. 뿐만 아니라, 또한 평가시기를 선택하는 자유도 다량 구비마이그레이션, 평가된다 시점들의 수에 제한이없는 연구자가 침전 후 이미지를 선택할 수있을 때에요.

이동하는 능력이 특히 그들은 바이러스 벡터에 대한 전달 비히클로서 사용될 수있다 면역 또는 여기서의 영역에서, 비 - 부착 세포에 중요한 기능을하기 때문에, 우리는 미부착 된 세포의 이동을 평가하기 CSM의 사용을 채택 종양 세포 단층상의 종류, ECM 단백질 이외에. 현미경, 또는 개별 ECM 구성 요소에 종양에서 고립 복잡한 ECM에, 가능한 종양 세포 단일 층에 비 부착 세포의 이동을 시각화의 추가 혜택이 분​​석은 다양한 있습니다. 하나의 세포 외 단백질로 코팅 우물을 사용하는 분석은 정확하게 세포가 생체 내에서를 통해 마이그레이션 것 ECM 조직 기판 또는 종양을 반영하지 않습니다.

여기서 우리는 주요 histocomp 민감 alloreactive 세포 독성 T 림프구 (alloCTL)를 사용우리의 대표적인 비 - 부착 세포 유형으로, 단방향 혼합 림프구 종양 세포 반응 (MLTR) 또는 혼합 림프구 반응 ^(MLR)을 사용하여 ^구 atibility 복합체 (MHC) 단백질. 우리는 모두 인간과 쥐 기원의 세포를 시험했다. 마이그레이션 종양 단층을 측정 한 결과, 고용 종양 세포가 부분적으로 관련 대상 MHC 분자의 전체 세트와 이펙터, 또는 완전히 관련 목표를 감작하는 데 사용되는 세포 집단에서 발견 동일한 MHC 단백질의 일부​​를 표시되었는지 이펙터를 향해 민감했다. 일부 실험에서, 우리는 이펙터와 대상 세포를 구분하는 형광 CellTracker 레드 CMPTX 또는 세포 증식 염료 eFluor (670)을 사용했다. 또한 세포를 시각화하는 추가적인 방법으로 형광 단백질 바이러스 벡터로 형질 도입 인코딩을 사용했다. 특정 분석을 위해, 우리는 에메랄드 그린 (EMD) 형광 단백질 ^{(10, 11)을} 코딩하는 레트로 바이러스 복제 벡터 (RRV)로 alloCTL를 형질 도입; OTH에 대한ERS 종양 세포 mStrawberry 코딩하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입 하였다.

alloCTL 종양 세포 단층에서 수확 종양 세포 단층 또는 ECM 하나의 중심으로 매니 폴드의 채널을 통해 접종 하였다. 점착성 및 비 점착성 세포 상호 작용에 의해 빛 및 / 또는 시간에 따른 형광 현미경에 의해 가시화 하였다. 고전력 파편과 핵 저전력 종양 세포 단일 층 붕괴, 또는 종양 세포는 각각 분해 및 아폽토시스에 의한 세포 손상의 지표였다. 우리는 디지털 단층 배양 위에 미부착 된 형광 T 세포의 이동을 나타내는 표면 형광 세기 맵을 생성. 우리는 또한 세포 독성이 포개어 미부착 alloCTL의 클러스터 형성 후 부착 신경 교종 세포 단층에 생기게 언급. 뿐만 아니라, 신경 교종 단층에 alloCTL에서 RRV-EMD의 수평 전달이 관찰되었다.

프로토콜

1. 슬라이드 준비

1. 멸균 파우치에 휴대 침전 매니 폴드 슬라이드를 삽입하고 오토 클레이브 테이프로 밀봉. 봉지의 종이 측 플라스틱 웰에 침착을 방지하기 위해 슬라이드 테프론 코팅면에 직면한다.
2. 121 ℃에서 15 분간 멸균 파우치.
3. 멸균 150 X 15mm 멸균 페트리 접시에 바이오 안전성 캐비닛과 장소 내부 살균 주머니에서 슬라이드를 제거합니다. 네 개의 슬라이드까지 접시 당에 맞게 할 수 있습니다. 슬라이드 옆에 35 X 10mm 페트리 접시를 놓습니다. 가습을 제공하기 위해 멸균 H ₂ O의 2-3 ML을 추가합니다.
4. 물론 전체를 커버하기에 충분한 양을 사용하여 100 ㎍ / ㎖의에 폴리 D 리신으로 미리 코팅 슬라이드. RT 이상의 시간 후, 용액을 흡인하고, 웰의 표면 위에 1X PBS 피펫 팅하여 잘 배의 표면을 헹군다.
5. 선택적으로, 더 강한 종양 세포 부착을 위해 피브로넥틴 또는 다른 ECM 성분을 추가한다. 충분한 볼륨 그쪽에서 5 ㎍ / ㎖의에서 피브로넥틴 추가웰 T RT에서 단시간 내에 건조하지 않습니다.
   1. 1 시간 후, 남아있는 솔루션을 대기음 1X PBS와 피펫 팅에 의해 아래로 두 번 씻는다.
6. 종양이 도금을위한 준비가 될 때까지 우물에 PBS를 유지합니다. 사용 당일 슬라이드.
7. 원하는 점착성 종양 세포 유형의 융합 플라스크 수확. 적절히 완충 성장 매체 - 예를 들어 5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 광 현미경 resuspend에 의해 트립 판 블루 염색 배제를 사용하여 생존 세포를 세어, 둘 베코 최소 필수 배지, 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS), L- 글루타민 및 피루브산 나트륨.
8. 부착 성 세포 집단의 형광 영상을 원하는 경우, 중요한 형광 염료 또는 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 세포 증식 염료 부착 세포 집단 레이블.
9. 부드럽게 아에 거품을 만들지 않도록하기 위해 슬라이드 돌보는의 각 웰에 전체 매체의 10 μl를 피펫LS, 다음과 같이 균일 한 종양 세포의 부착을 방지 할 수 있습니다.
10. 각 웰 (그림 1A)의 매체에 2.5-5.0 × 10 ⁴ 세포 (세포 현탁액의 5 ~ 10 μL)를 추가합니다. 종양 세포 유형의 성장 및 바람직한 일 수에 따라 최적의 수를 조정한다. 큰 종양 세포 또는 빠르게 성장하는 세포는 처음에는 적은 수의 세포를 필요로 할 수있다. 세포의 균일 한 분포를 확인하기 위해 위 아래로 중간 피펫을 추가하여 40 μL까지 잘 볼륨을 가져와.
11. 모든 웰은 시딩 한 후, 종양 세포는 그 후, 실온에서 접착 배치 뚜껑을 150 X 15mm 페트리 접시에 조심스럽게 최소 24 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO ₂ 가습 인큐베이터 접시를 이동할 수있다.
12. 매일 문화 매체를 변경합니다. 조심스럽게 단층에서 소비 된 매체의 일부를 피펫 신선한 완전 배지로 교체합니다.
    참고 : 증발하기 때문에, 더 볼륨을 꺼내어보다 추가해야합니다. 웰스 분석을위한 준비가되어있을 때조차, confl세포의 uent 층이 존재한다. 이 1~3일 초기 시딩 후 일반적이다.
13. 단계 1.4에서 설명하고 단일 층이 요구되는 경우 2 단계로 진행, 또는 단일 층에서 ECM 단백질을 추출 아래 1.13 단계 중 하나로 PBS로 가볍게 한 번 단층을 씻으십시오.
14. 완전 배지에서 0.5 % 트리톤 X (v / v)의 솔루션을 확인하고 각 웰에 30 μl를 추가합니다. 단분자막이어서, 2 분 동안 후드 다이제스트 전술 한 바와 같이 피펫 팅 완전 배지로 두 번 세척하자.
    참고 : ECM 층은 광학 현미경 (그림 2)로 표시 될 수 있습니다. 바로 슬라이드를 사용하거나 1-2일의 가습 CO ₂ 배양기에서 완전한 매체에 보관하십시오. 우물이 건조 할 수 없습니다.

슬라이드에 미부착 된 T 세포의 침강 2.

1. 미부착 된 세포 집단의 형광 이미징이 요구되는 경우, 이러한 CFSE, 셀 트랙커 레드 CMPTX 또는 eFluor 같은 중요한 형광 염료 미부착 된 세포 집단을, 레이블분석에 앞서 제조에서 1 시간 이상에 의해 제공된 프로토콜에 따라 670. 대안으로, 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 형광 단백질을 발현하는 세포를 조작.
2. 상기 1.2에 기재된 바와 같이 오토 클레이브 파우치 셀 침강 매니 폴드를 압력솥.
3. 생물 안전 캐비닛의 보육과 장소에서 테프론 코팅 된 슬라이드를 포함하는 가습 실을 제거합니다.
4. 피펫 팅에 의해 1X PBS로 우물을 세척하고 아래로, 다음 10 % 이상 혈청을 포함하는 완전한 매체의 45 μl를 추가합니다.
5. 살균 봉투로부터 매니 폴드를 조심스럽게 제거하고 슬라이드 (도 1b)의 바닥에 닿을 매니 폴드의 끝에 '후크'까지 웰 위에 미끄러.
6. 배지는 각 채널에서 볼 수 있는지 확인하십시오. 아무 것도 볼 수없는 경우, 매니 폴드를 벗고 잘 대응에 더 많은 매체를 추가 한 다음 교체하고 다시 확인합니다.
7. 각 짱 단계를 반복 2.5에 채널 매니 폴드의, 또는 많은 우물을 위해 원하는대로.
8. 아니 이하 / ⁵ 10 × 1.0 ~ 2.0보다 μL에서 비 부착 세포에 resuspend를 계산합니다. 세포의 1 μl를 작성하여 천천히 채널 (그림 1C)로 피펫. 물론 원하는 각각에 대해이 작업을 수행합니다.
9. 채널의 세포가 정착 할 수 있도록 20 ~ 30 분 동안 바이오 후드 안쪽 즉, 매니 폴드와 슬라이드 전체 셀로드 장치를, 두십시오.
10. 국소 적 우물 (그림 1D)의 중심에 놓는 세포를 방해하지 않도록 슬라이드에서 바로 들어 올려 부드럽게 양쪽 끝을 터치에 의해 매니 폴드를 제거합니다.
11. 비 접착 세포가 성공적으로 잘 매니 폴드 채널의 원주 내에 머무르는 중심 시딩 된되도록 각 웰을 검사한다. 비 - 부착 세포는 이상적으로 약간 부드럽게 따라서 셀 PELLE 발생하지 않습니다 주위 슬라이드 이동, 단층 또는 ECM으로 서로 부착된다t은 분산합니다. 슬라이드를 밀다하지 마십시오.

3. 형광 현미경

1. 침강 확인 후 적절한 실험 장비, 영상을 수행합니다. 이상적으로, CO ₂ 및 습도 챔버가 장착되어 현미경을 사용합니다. 웰의 전체가 볼 수 있도록 여러 개의 이미지를 허용하는 낮은 전력, 즉 4X 또는 10X, 이미지에 더 큰 영역으로 채취한다.
2. 촬상 소프트웨어를 이용하여 디지털 이미지를 획득. 명 시야 및 / 또는 다 채널 형광 이미징을 수행한다.
3. 원하는 경우, 특정 영역에 서로 다른 채널의 이미지를 촬영하거나, 또는 가습 슬라이드를 유지하고 37 ° C / 5 % CO ₂ 배양기에서 수동으로 (원하는 시점에서 이미지에 그림을 취할 시간 경과를 설정 더 이상 시간 지점에 권장 1E & F).

4. 분석 및 디스플레이

1. 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 광 및 FL 병합그래서 하나의 층에 여러 종류의 세포 및 마크로 uorescent 이미지는 동일한 이미지를 볼 수있다. 드래그 앤 각 개별 프로그램에 색상과 메시지가 표시되면, 여러 레이어와 이미지 파일을 만들 수있는 '레이어를 추가'옵션을 선택에 대한 이미지 파일을 삭제합니다.
   1. 높은 배율에서 취할 정렬하고 디지털 함께 잘에서 이미지 만들기. 두 이미지 사이의 보존 된 지역보고 완전한 그림이 생성 될 때까지 다른 상단에 하나의 이미지를 오버레이하여 파일을 맞 춥니 다.
2. 각각의 세포가 마이그레이션 한 거리를 결정 캡처 소프트웨어를 사용하여 수집하는 동안 이미지 미크론 막대를 추가합니다.
3. 다양한 시간에 세포 이동을 결정 형광 T 세포 응집 또는 시간에 걸쳐 정량화, 즉 이미지 소프트웨어, ImageJ에 의해 표면 강도 형광을지도한다.
   1. 표면 플롯을 생성하는 단계 4.1 및 레이어 창에서 생성 된 레이어 이미지를 촬영하기 위해,원하는 채널에 해당하는 제외한 모든 레이어를 선택 취소합니다. 표면 그림이 EMD 발현을 시각화하고자하는 경우, 예를 들어,이 마커에 사용될 필터에 대응하는 전용 "녹색"층을 보여야한다.
   2. 이미지를 평평하게하고 프로그램으로 이미지를 (예를 들어, .png를) 인식 할 수있는 파일 형식으로 저장 및로드합니다. 표면 플롯을 생성하기 위해, 8 비트에 이미지 형식을 변경 배경을 줄이기 위해 필요에 따라 밝기 / 명암을 변경하고 '/ 표면 플롯 분석'옵션을 선택합니다. 그림 5의 이미지는 '그늘', '축 그리기', '하나의 다각형 당 선'과 '부드러운'체크 박스를 선택하여 생성되었다.
   3. 대안 적으로, 시간 제로 초점 셀로부터 입금 반경 또는 직경을 측정 할 그리고 상이한 시간 시점에서 최 세포에 비교한다. 테프론 웰의 직경은 6.0 mm이다.

결과

형광 단백질 코딩하는 바이러스 벡터는, 또는 그 대신에 형광 염료의에 더하여 사용될 수있다. 바이러스 형질 도입은 운동성 분석에 앞서 수행되어야한다. 두 점착성 및 비 점착성 세포 유형 차등하게 표지 될 수있다. 전달을위한 프로토콜을 이용할 벡터의 종류에 따라 달라질 것이다. 여기서, 우리는 ^(12)을 설명하는 프로토콜을 사용하는 분석에 앞서도 RRV EMD-3, 5, 6,

토론

단일 세포 현탁액 중의 종양 세포는 테프론 마스크 슬라이드의 웰에 피펫 팅 하였다. 세포가 접착 가능하고 가습 된 5 % CO _2, 37 ℃ 배양기 (도 1a)에 단분자층을 형성 하였다. 단일 층에서 파생 설립 된 단일 층 또는 ECM 단백질은 이러한 분석 (그림 1B) 수확 할 수있다. EMD를 코딩하는 벡터로 중요한 형광 염료로 표지 또는 형질 이펙터 T 림프구 웰을 사용 CSM의 중심으?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-masked microscope slides	Creative Scientific Methods	CSM002
Cell Sedimentation Manifold	Creative Scientific Methods	CSM001
Petri Dish, 150mm	Corning	430597
Petri Dish, 35mm	Corning	430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Mediatech	21-040
20 μl Pipetman	Gilson	F123600
200 μl Pipetman	Gilson	F123601
200 μl pipette tips	VWR	89003-060
Distilled, deionized water (sterile)	Mediatech	25-055
Trypsin	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (optional)	Gibco	12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V serum-free media	Invitrogen	12055-083
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced	Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
Fibronectin	BD	354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH