Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

Özet

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Özet

İlk floresan etiketli, yapışkan olmayan, insan veya murin efektör bağışıklık hücrelerinin hareketliliği ölçmek için, hücre dışı matris proteinleri üzerinde yapışık tümör hücrelerinin radyal migrasyonun ölçülmesi için rapor Radyal tabakalı hücre gücü deneyi yeni bir adaptasyon sunulmaktadır. Bu teknik bir paslanmaz çelik manifoldu ve 10-kuyu teflon slayt fokal birleşen tümör hücre mono tabakaları veya hücre dışı matriks proteinleri ya hazırlanan kuyulara yapışmaz T hücrelerini yatırmak için kullanır. Hafif ve / veya çok-kanallı floresan mikroskobu zamanla efektör hücrelerin hareketi ve davranışını izlemek için kullanılır. Floresan boyalar ve / veya floresan transgenler için kod diferansiyel görüntüleme için hücre tipleri etiketlemek için kullanılan viral vektörler. Bu yöntem, bir slayt bölmeleri, agar veya Transwell plakaları kullanılarak, yatay ya da dikey göç / işgali etiket in vitro deneyler içindeki tip farklıdır. Tahlil ayrıntılı görüntüleme verileri b sağlarBelirli bir fluoresan markörler ile ayırt farklı hücre tipleri ile toplanmış, e; hücrelerin hatta belirli alt gruplar (örneğin, nontransduced / transdüksiyon ile aktarılabilir) izlenebilir. Yüzey yoğunluklu floresan araziler göç hücre tipine karşılık gelen özel flüoresan kanalları kullanılarak üretilir. Bu belirli zamanlarda yapışkan olmayan immün hücre hareketliliğinin iyi olarak gösterebilir. Bir de, hedef hücrelere gibi sitotoksisite veya efektör viral vektörlerin transferi gibi diğer efektör hücre fonksiyonlarının, kanıt toplamak mümkündür. Bu durumda, yöntem, araştırmacılar mikroskobik çeşitli yapışkan hücreler ile farklı olarak etiketli olmayan yapışık hücre-hücre etkileşimleri belge sağlar. Bu tür bilgiler, işlevselliği görsel kanıt, kanser tedavisi için kullanılmadan önce tümör hedef hücreleri ile arzu edilen biyolojik olarak manipüle ya da aktive edilmiş immun hücre tiplerinin belirlenmesinde, özellikle uygun olabilir.

Giriş

Radyal tabakalı hücre gücü deneyi ilk olarak, hücre dışı matris (ECM), proteinleri ^5-7 ile ya da fibronektin ve laminin ^1,2 tek tek ECM bileşenleri ile kaplanmış dilimlerin üzerine yapışık tümör hücreleri ^1-4 infiltratif özelliklerini ölçmek için geliştirilmiştir. Bu teknik, paslanmaz çelik bir hücre, sedimantasyon manifoldu (CSM) kullanılarak kuyu merkezinde tümör hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu tohumlama çıkıyor. Sedimantasyon sonra, tümör hücreleri, yatay motilite oranı belirlemek üzere kullanılan kuyu ve zaman içinde başlangıç ​​hücre popülasyonunda çapında değişiklik alt azaltacaklardır. Radyal tabakalı hücre gücü deneyi hücrelerinin in vitro göç yeteneklerine tahlil edilmesi Transwell plakaları kullanılan diğer mevcut yöntemlere göre görsel bir avantaj sağlanır; Bu analizler görüntüleme ⁸ olmayan elverişli. Yanı sıra, aynı zamanda bir zaman noktası seçiminde özgürlük büyük miktarda sağladıgöç, değerlendirilir timepoints sayısında herhangi bir sınır ile bir araştırmacı sedimantasyon sonra görüntünün tercih ne zaman s.

Geçirmek için yeteneği, özellikle de viral vektörler için salıverme araçları olarak kullanılabilir immünoterapi veya burada alanında, yapışkan olmayan hücreler için önemli bir işlevi olduğu için, yapışkan olmayan hücre göçünü değerlendirmek için CSM kullanımını uyarlanmış tümör hücre tekli katmanları üzerinde tipleri, ECM proteinleri ilave olarak. Mikroskopik olarak, ya da tek tek ECM bileşenleri tümöründen izole edilmiş kompleks ECM ile, uygun bir tümör hücre tekli katmanları üzerinde yapışkan olmayan hücreleri göç görselleştirme yararı, bu deney, çok yönlü kılar. Tek bir hücre dışı bir protein ile kaplı oyuklar da kullanan deneyler doğru hücrelerin, in vivo yoluyla göç edecektir ECM doku alt-tabakanın ya da tümör yansıtmamaktadır.

Burada, biz büyük histocomp karşı duyarlı alloreaktif sitotoksik T lenfositleri (alloCTL), kullanılanBizim için temsili yapışmayan hücre tipi olarak, tek yönlü karma lenfosit tümör hücresi tepkileri (MLTR) ya da karışık lenfosit reaksiyonları (MLR), ⁹ kullanarak atibility kompleksi (MHC) proteinleri içerir. Biz de, insan ve murin kökenli hücreler test edildi. Göç tümör mono tabakaları üzerinde ölçüldü zaman kullanılan tümör hücreleri ya kısmen ilgili hedefler MHC moleküllerinin tam bir set ile efektörler, ya da tamamen ilgili hedefler, duyarlı kullanılan hücre popülasyonu üzerinde bulunan aynı MHC proteinlerinin bazı görüntüleme, olduğunu etkileyiciler karşı duyarlı hale getirilmiş. Bazı deneylerde, efektör ve hedef hücrelerin ayırt etmek için floresan CellTracker Kırmızı CMPTX veya hücre çoğalması, boya eFluor 670 kullanılır. Ayrıca hücrelerin görselleştirmek için ek bir yol olarak floresan proteinler için viral vektörler, kodlama ile transdüksiyon kullanılır. Bazı deneyler için, Emerald Green (Merck) floresan protein ^10,11 kodlayan retroviral replike vektörleri (RRV) ile alloCTL transduse; oth içinalıcılar, tümör hücreleri mStrawberry kodlayan lentiviral vektörleri ile transdüse edilmiştir.

alloCTL tümör hücre monokatmanlarından hasat edilen tümör hücre mono tabakaları ya da ECM ya merkezine manifoldunun bir kanal üzerinden ekilmiştir. Yapışkan olmayan yapışık hücre etkileşimleri ışık ve / veya zaman içinde floresan mikroskobu ile görülür hale getirilirler. Yüksek güçte parçalanmış çekirdekleri ile düşük güçte tümör hücre mono tabakasında bozulması ya da tümör hücreleri, sırasıyla erime ve apoptoz ile hücre hasarı göstergeleri idi. Biz dijital tek tabaka kültürler üzerinde yapışmaz floresanlama T hücrelerinin göçünü gösteren yüzey yoğunluğu floresan haritalar yarattı. Biz de sitotoksisite Kaplanmış yapışmayan alloCTL küme oluşumundan sonra yapışık glioma hücre tabakasına yol açtığı kaydetti. Yanı sıra, glioma tek tabaka için alloCTL gelen RRV-EMD yatay transdüksiyon gözlendi.

Protokol

1. Slayt Hazırlama

1. Sterilizasyon torbalar içine Hücre Sedimantasyon Manifold slaytlar yerleştirin ve otoklav bandı ile mühür. Kese kağıdı tarafı kuyuları plastik birikmeleri önlemek için slayt Teflon kaplı yan Yüz.
2. 121 ° C'de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır torbalar.
3. Steril 150 x 15 mm steril Petri kabındaki bir biyogüvenlik kabini ve yerin içinde sterilizasyon kese slaytı çıkarın. Dört slaytlar kadar tabak başına sığabilir. Slaytlar yanında 35 x 10 mm Petri kabı yerleştirin. Nemlendirmeyi sağlamak için steril _H2O 2-3 ml ilave edilir.
4. Şekilde tüm karşılamak için yeterli hacmi kullanılarak 100 ug / ml poli-D-lisin ile önceden kat kayar. Oda sıcaklığında bir saat sonra, çözelti aspire edilerek kuyu yüzeyi üzerine 1x PBS pipetleme de iki yüzey yıkayın.
5. İsteğe bağlı olarak, daha güçlü tümör hücre yapışmasını sağlamak için fibronektin veya diğer ECM bileşenleri ekleyin. Yeterli hacim tha 5 ug / ml fibronektin ekleKuyular t oda sıcaklığında zaman kısa bir süre içinde kuru olmaz.
   1. 1 saat sonra, artık bir çözüm aspire ve 1x PBS ile pipetleme ve aşağı iki kez yıkayın.
6. Tümör kaplama için hazır olana kadar kuyular PBS tutun. Kullanım aynı gün slaytlar.
7. Istenen yapışkan tümör hücre tipi bir birleşik bir şişe hasat edilir. Yeterli tamponlu büyüme ortamı; örneğin 5 x 10 ⁶ hücre / ml'de ışık mikroskobu ve tekrar süspansiyon Tripan mavisi kullanılarak canlı hücre sayımı, Dulbecco minimum gerekli ortam,% 10 fetal sığır serumu ile (FCS) (FBS), L- glutamin ve sodyum piruvat.
8. Yapışık hücre popülasyonunun floresan görüntüleme isteniyorsa, önemli bir flüoresan boya veya üretici tarafından sağlanan protokol izlenerek, bir hücre çoğalması boya ile yapışık hücre popülasyonu olarak etiketleyin.
9. Sorunsuz wel içinde hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için slayt özen göstererek her kuyuya tam orta 10 ul pipetls, bu gibi üniforma tümör hücresi yapışmasını önleyebilirsiniz.
10. Her bir sıra (Şekil 1A) ortama 2.5-5.0 x 10 ⁴ hücrelerini (hücre süspansiyonu 5-10 ul) eklenir. Tümör hücre tipine ve arzu edilen büyüme gün sayısına bağlı olarak uygun sayıda ayarlayın. Büyük tümör hücreleri veya hızlı büyüyen hücreleri başlangıçta daha az hücre gerektirebilir. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için yukarı ve aşağı orta ve pipet ekleyerek 40 ul kadar iyi ses getirmek.
11. Tüm oyuklar tohumlanmış olduktan sonra, tümör hücreleri, daha sonra oda sıcaklığında uygun yer kapak 150 x 15 mm Petri tabağına ve dikkatli bir şekilde en az 24 saat süreyle 37 ° C /% 5 _CO2 nemlendirilmiş inkübatör çanağı hareket etmesine izin verir.
12. Günlük kültür ortamı değiştirin. Dikkatle tek tabaka harcanan ortamın bir bölümünü pipet ve taze tamamlanmış besiyeri ile değiştirin.
    NOT: buharlaşma nedeniyle, daha fazla hacim dışarı alındı ​​daha ilave edilmesi gerekecektir. Wells tahlil için ne zaman hazır olacağını daha, conflhücre uent tabaka mevcuttur. Bu 1-3 gün ilk tohumlama sonra genellikle.
13. Adım 1.4 tarif ve mono tabakalar isteniyorsa 2. adıma geçin, ya da tek tabaka ECM proteinleri ayıklamak için aşağıdaki 1,13 adıma olarak ya PBS ile hafifçe kez tek tabaka yıkayın.
14. Komple ortam içinde% 0.5 Triton-X (h / h) çözeltisi oluşturunuz ve her bir oyuğa 30 ul ilave edin. Tek tabaka, daha sonra 2 dakika süre ile kaputu sindirimi, yukarıda anlatıldığı gibi pipetleme tam ortam ile iki kez yıkayın olsun.
    NOT: ECM tabakası ışık mikroskobu (Şekil 2) ile görülebilir. Hemen slaytlar kullanarak, veya 1-2 gün süreyle nemlendirilmiş _CO2 kuluçka makinesi içinde komple ortam içinde tutmak. Kuyular kurumasına izin vermeyin.

Slide üzerine Yapışmayan T hücrelerinin 2. sedimantasyon

1. Yapışmayan hücre popülasyonunun floresan görüntüleme isteniyorsa, bu tür CFSE, hücre Takibi Kırmızı CMPTX veya eFluor olarak önemli bir floresan boya ile yapışkan olmayan hücre popülasyonları, etiketTahlilde önceden üreticisi, en az 1 saat tarafından sağlanan protokolleri takip ederek 670. Seçenek olarak ise, viral vektörler tarafından kodlanan floresan proteinleri ifade etmek için hücreleri manipüle.
2. Yukarıda 1.2'de tarif edildiği gibi bir otoklav torbanın hücre sedimantasyon manifoldu otoklava.
3. Biyolojik güvenlik kabininde kuvöz ve yerden Teflon kaplı slaytlar içeren nemlendirilmiş odasına çıkarın.
4. Pipetleme 1x PBS ile yıkayın ve aşağı, daha sonra, en az% 10 serum içeren komple ortam içinde 45 ul ekle.
5. Sterilizasyon zarf manifoldu çıkarın ve dikkatlice slayt (Şekil 1B) alt dokunur manifoldu sonunda 'kanca' kadar kuyularda üzerinde slayt.
6. Kültür ortamı, her bir kanal görünür olduğundan emin olun. Hiçbiri görülürse, manifoldu çıkarmak ve iyi gelen daha fazla orta ekleyin, daha sonra değiştirin ve tekrar kontrol edin.
7. Her chan için yineleyin 2.5nel manifold ya da birçok kuyu için arzu edildiği şekilde.
8. En az / ^5, 10 x 1.0-2.0 daha ul yıkanarak yapışmayan hücreler ve tekrar süspansiyon sayısı. Hücrelerin 1 ul çizin ve yavaş yavaş kanal (Şekil 1C) içine pipetle. Iyi istenen her yapın.
9. Kanal hücreleri yerleşmek için izin 20-30 dakika süreyle biyo-kaput içinde, yani manifoldu ve slayt tüm hücre yüklü cihazı, bırakın.
10. Fokal kuyularda (Şekil 1D) merkezinde seribaşı hücreleri rahatsız etmeyecek şekilde slayttan yukarı doğru kaldırarak hafifçe iki ucunu dokunarak ve manifoldu çıkarın.
11. Yapışmayan hücreler başarılı bir şekilde iyi manifoldu kanalın çevresi içinde kalma merkezinde seribaşı olarak emin olmak için her iyi kontrol edin. yapışmayan hücreler ideal bir miktar, bu nedenle hafif hücre Pelle neden olmaz çevresinde slayt hareket tek tabaka veya ECM ve birbirine yapışırt dağıtmak için. Slayt jostle etmeyin.

3. Floresan Mikroskopi

1. Sedimantasyon onaylandıktan sonra uygun deneysel donanımları ile, görüntüleme gerçekleştirmek. İdeal olarak, bir _CO2 ve nem odası ile donatılmış bir mikroskop kullanılır. Kuyunun tamamı görülebilir, böylece birden fazla görüntü için izin vermek için, düşük güç, yani, 4X veya 10X, bir görüntü daha büyük bir alanı alınacak.
2. Görüntü yakalama yazılımı kullanarak dijital görüntüler elde edin. Aydınlık ve / veya çok-kanallı floresan görüntüleme yapın.
3. İstenirse, belirli bir alanda farklı kanallarda görüntü kaydetmek ya da nemlendirilmiş slayt tutmak ve 37 ° C /% 5 CO ₂ inkübatör ve manuel (istenilen zaman noktalarında görüntü Şekil almaya bir time-lapse kurmak daha uzun bir zaman noktası için önerilen 1E & F).

4. Analiz ve Görüntü

1. Resim düzenleme yazılımı kullanarak, ışık ve fl birleştirmebir katman birden çok hücre tipleri ve işaretleri içine uorescent görüntüleri aynı görüntüde görülebilir. Sürükle ve her programa renk ve istendiğinde, çoklu katmanlar ile bir görüntü dosyası oluşturmak için 'Katman ekle' seçeneğini görüntü dosyalarını bırakın.
   1. Yüksek büyütmede, almak hizalamak ve dijital birlikte kuyunun genelinde görüntüleri dikiş. İki görüntü arasında korunmuş bölgeler bakarak ve tam bir resim oluşturulur kadar üst üste bir görüntü kaplayan dosyaları hizalayın.
2. Tek tek hücreler göç mesafeyi belirlemek için yakalama yazılımı kullanarak edinimi sırasında görüntülere mikron çubuklarını ekleyin.
3. , Çeşitli zamanlarda hücre göçü belirleyen floresan T hücre agregasyonu veya zamana yayılmış ölçmek için, yani görüntü yazılımı, ImageJ ile yüzey yoğunluğu floresan haritaları yapmak için.
   1. Yüzey araziler oluşturmak adımda 4.1 ve Katmanlar pencerenin altında oluşturulan bir katmanlı görüntü çekmek için,İstediğiniz kanala karşılık gelen olanlar dışındaki tüm katmanları işaretini kaldırın. Bir yüzey arsa Merck tanımının görüntülenmesi arzu edildiği takdirde, örneğin, bu marker için kullanılan filtreye karşılık gelen, sadece 'yeşil' tabakalar görünür olmalıdır.
   2. Düzleştirilmiş görüntü ve programa görüntüyü (örn, .png) tanınan bir dosya biçiminde kaydedin ve yükleyin. Yüzey arsa üretmek için, 8-bit görüntü türünü değiştirmek arka plan azaltmak için gerektiği gibi parlaklık / kontrast değiştirmek ve '/ Yüzey Plot Analizi' seçeneğini seçin. Şekil 5 görüntüler 'Shade', 'Axis Beraberlik', 'Bir Poligon Başına Hattı', ve 'Smooth' onay kutularını işaretleyerek üretildi.
   3. Alternatif olarak, sıfır zamanında fokal hücre mevduat yarıçapını veya çapını kullanarak ölçümler almak ve farklı zamanlarda dış noktada hücrelere karşılaştırın. teflon kuyu çapı 6.0 mm'dir.

Sonuçlar

Floresan proteinleri kodlayan viral vektörler ya da bunun yerine, floresan boya, bir ek olarak kullanılabilir. Viral transdüksiyon motilite deneyinin önceden yapılmalıdır. Hem yapışkan ve yapışkan olmayan hücre tipleri farklı şekilde etiketlenmiş olabilir. transdüksiyonu için protokol kullanılan vektör tipine bağlı olacaktır. Burada, ¹² 'de tanımlanan protokol kullanılarak gerçekleştirilen bir deneyde önceden Şekil RRV EMD ile birlikte 3, 5 ve ...

Tartışmalar

Tek bir hücre süspansiyonu olarak tümör hücreleri Teflon-maskeli sürgü oyuklarına pipetle alındı. hücreler yapışmaya bırakıldı ve daha sonra bir nemlendirilmiş bir% 5 _CO2, 37 ° C inkübatör (Şekil 1A) içinde tek-tabakalar oluşturulmuştur. Tek tabaka elde kurulan tek tabakalar ya da ECM proteinlerinin bu tahlillerde (Şekil 1B) hasat edilebilir. EMD kodlayan vektörler ile önemli bir floresan boya ile işaretlenmiş ya da transduse efektör T lenfositle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-masked microscope slides	Creative Scientific Methods	CSM002
Cell Sedimentation Manifold	Creative Scientific Methods	CSM001
Petri Dish, 150mm	Corning	430597
Petri Dish, 35mm	Corning	430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Mediatech	21-040
20 μl Pipetman	Gilson	F123600
200 μl Pipetman	Gilson	F123601
200 μl pipette tips	VWR	89003-060
Distilled, deionized water (sterile)	Mediatech	25-055
Trypsin	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (optional)	Gibco	12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V serum-free media	Invitrogen	12055-083
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced	Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
Fibronectin	BD	354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH