Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Resumen

La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.

Resumen

Microdisección de captura por láser (LCM) permite el aislamiento de células específicas a partir de secciones de tejido delgadas con alta resolución espacial. LCM eficaz requiere la identificación precisa de las células subpoblaciones de un tejido heterogéneo. Identificación de células de interés para LCM generalmente se basa en criterios morfológicos o en los periodistas de proteínas fluorescentes. La combinación de LCM y immunolabeling rápida ofrece un medio alternativo y eficientes para visualizar determinados tipos de células y de aislarlos de los tejidos circundantes. ARN de alta calidad puede entonces ser extraído a partir de una población celular puro y se procesa adicionalmente para aplicaciones posteriores, incluyendo ARN de secuenciación, microarrays o QRT-PCR. Este enfoque se ha realizado anteriormente y descrito brevemente en algunas publicaciones. El objetivo de este artículo es ilustrar cómo realizar una rápida immunolabeling de una población celular mientras se mantiene la integridad del ARN, y la forma de aislar estas células específicas mediante LCM. En esto, ilustramosd este procedimiento multi-paso por inmunomarcaje y la captura de células dopaminérgicas en el tejido cerebral de los ratones de un día de edad. Destacamos pasos críticos clave que merecen una consideración especial. Este protocolo se puede adaptar a una variedad de tejidos y células de interés. Investigadores de diferentes ámbitos probablemente se beneficiarán de la manifestación de este enfoque.

Introducción

El cerebro se compone de una gran variedad de diferentes tipos de neuronas que forman redes complejas. Estas neuronas se organizan en grupos distintos y subgrupos en función de su morfología, la conectividad y la expresión génica patrón ^1. El desarrollo de microarrays, secuenciación de próxima generación, y QRT-PCR ofrecen la posibilidad de comparar los perfiles de expresión genética de poblaciones neuronales en diferentes contextos biológicos ^1,2. Estos análisis sensibles requieren la identificación precisa y el aislamiento de los tipos de células de interés mientras se mantiene la integridad del ARN ^2-4. Técnica fluorescente de células activadas (FACS) ha sido ampliamente usado para aislar determinados tipos de células basados ​​en marcadores y / o la morfología de la superficie celular. FACS requiere una etapa de disociación de células antes de la clasificación, lo que resulta en una pérdida completa de la resolución espacial ^5. Muchos subpoblaciones neuronales se distinguen una de otra de acuerdo con su distribución anatómica en ºe cerebro. Microdisección de captura por láser aplicado en las secciones del cerebro delgadas proporciona una opción apropiada para el aislamiento específico de células con alta resolución espacial ^6.8. Una limitación importante de LCM ha sido la necesidad de identificar las células de interés sobre la base de criterios morfológicos o en reporteros de proteínas fluorescentes de ingeniería genética en modelos animales. El desarrollo de nuevas técnicas para llevar a cabo los métodos de immunolabeling rápidas que conservan la integridad del ARN, en combinación con LCM, ahora permite el aislamiento de las subpoblaciones de células para proceder con los experimentos de genes de perfiles.

Este enfoque se ha realizado anteriormente y descrito brevemente en pocas publicaciones ^1,9-13. Aquí, nos demuestran un procedimiento detallado para obtener ARN de alta calidad a partir de un subconjunto específico de células en una estructura de tejido complejo combinando immunolabeling rápido con LCM. Mostramos cómo realizar los pasos críticos claves para obtener la recuperación de ARN máxima y evitar la degradación del ARN, ya que puede sigsignificativamente el perfil de expresión génica de impacto.

Para la demostración de este protocolo, fueron blanco de las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio de un día de edad de ratón. Las neuronas dopaminérgicas pueden ser immunolabeled usando un anticuerpo dirigido contra la tirosina hidroxilasa (TH), la enzima limitante de la velocidad para la síntesis de la dopamina. Siguiendo inmunotinción TH, individuo o grupos de neuronas dopaminérgicas entonces se puede aislar usando LCM. Microdissected células se recogen en el tampón de lisis, y se extrae el ARN usando un kit de aislamiento de ARN. Calidad y cantidad de ARN extraído se miden usando un bioanalizador ^5. Un análisis más detallado de la expresión génica usando: secuenciación de RNA, microarrays, o QRT-PCR posteriormente se puede realizar ^2,4,6. Como ejemplo, una de dos pasos QRT-PCR se demuestra en los dominios aislados dopaminérgicas láser capturado. Cuantificación relativa de los niveles de expresión de dos genes marcadores dopaminérgicos neurona ilustra la selectividad de este protocolo.

Protocolo

NOTA: Los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía Canadiense para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Protección Animal Laval Universidad.

1. Preparación de muestras

NOTA: En este ejemplo, hemos utilizado cerebros de ratones en el día postnatal 1.

1. Utilice la anestesia hipotermia en hielo picado para 3 a 4 minutos para cachorros, luego diseccionar los cerebros lo más rápidamente posible en medio L15 helada. Realice este paso dentro de 2 min.
2. Transferencia diseccionado cerebros en la incrustación de molde (cf. Lista de material) y se llenan de medios tejido congelado incrustación teniendo cuidado de orientar la muestra en la posición deseada. Congelar las muestras inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Realice este paso dentro de 30 seg.
   NOTA: Las muestras se pueden almacenar unos meses sin comprometer la calidad del ARN.

2. Seccionamiento

1. Coa membrana Treatted diapositivas de vidrio (cf. Lista de materiales) con solución descontaminante RNAsa superficie para eliminar cualquier rastro de RNAsas. Se lavan los portas en agua DEPC y déjelos secar. Alternativamente, las diapositivas de pasteles durante la noche a 200 ° C.
2. Transferir las muestras congeladas en un criostato previamente limpiado con una solución superficie RNAsa descontaminación. Establecer temperatura de la cámara criostato a -20 ° C y rebanada muestras a 10 micras de espesor. Recoger las secciones de tejido en los toboganes de membrana recubierto y dejar secar 10 min antes de la tinción. Alternativamente, la tienda se desliza a -80 ° C hasta que las manchas.

3. Preparación de las soluciones de tinción

1. Preparar todas las soluciones justo antes del inicio del experimento, y el uso de inhibidor de RNasa en todas las soluciones de tinción (excepto para las soluciones de lavado) para evitar la degradación del ARN.
2. Preparar la solución tampón. Utilice el mismo tampón en todas las soluciones (compuesta por solución salina tamponada con fosfato libre de ARNasa (PBS), complementado de 1% de BSA,0,2% de Triton y el inhibidor de RNAsa 2%). Para cada diapositiva, preparar 400 l de solución tampón (200 l para el primario y 200 l para los anticuerpos secundarios).
3. Preparar la solución de fijación: utilizar etanol al 70% se mantuvo a -20 ° C. Mantenga procedimiento de fijación del tejido mínima para evitar una reducción drástica en el rendimiento de la extracción de ARN.
   NOTA: También puede utilizar una solución de etanol al 95% complementado de ácido acético al 5% se mantiene a -20 ° C.
4. Preparar la solución de anticuerpo primario por dilución del anticuerpo primario en la solución tampón. Para el etiquetado de las neuronas dopaminérgicas, utilizar un anticuerpo dirigido la tirosina hidroxilasa (TH, enzima limitante para la producción de dopamina). Utilice una alta concentración de anticuerpo para compensar el tiempo de incubación rápida. Use anticuerpo TH a una dilución 1:25.
   NOTA: En el protocolo normal de inmunofluorescencia, este anticuerpo da una señal fuerte cuando se incubó durante la noche a una dilución de 1: 1000. En este protocolo, se utiliza 40 veces más concentrated debido al tiempo de incubación corto. Debido a la alta concentración de anticuerpo usado para este método, realizar una inmunotinción estándar en paralelo a fin de verificar cualquier aumento en el etiquetado no específica.
5. Preparar la solución de anticuerpo secundario diluyendo el anticuerpo secundario en la solución tampón. Utilice un anticuerpo secundario biotinilado a una concentración de 1: 100.
   NOTA: En este ejemplo, se utilizó un anticuerpo biotinilado anti-conejo.
6. Preparar la solución de complejo de avidina-biotina (ABC) para la detección de anticuerpos secundarios biotinilados. Hacer solución ABC añadiendo el compuesto A y el compuesto B a una concentración de 1: 100 diluido en DEPC PBS suplementado con inhibidor de RNasa 2%. Preparar la avidina-biotina complejo 30 min antes de añadir a las diapositivas.

4. La tinción

1. Descongelar una o dos diapositivas en el momento de -80 ° C con un movimiento rápido en el aire rápidamente (o utilizar un soplador de aire). Secciones de sonido envolvente con un hidrófobobarrera pluma y dejar secar durante unos pocos segundos.
   1. Colocar los portaobjetos en la solución fijadora en frío por no más de 5 minutos a -20 ° C. Agitar una vez en el aire para eliminar el exceso de solución de fijación entonces, rápidamente sumergir diapositivas en tiempos DEPC PBS 6-8 para el lavado.
   2. Flick las diapositivas para eliminar el exceso de DEPC PBS. Asegúrese de que las diapositivas de descongelación paso no exceda 5 min.
2. Colocar los portaobjetos en una bandeja limpia (pretratados con una solución de descontaminación superficie de ARNasa para eliminar cualquier rastro de ARNasas) y pusieron 200 l de la solución de anticuerpo primario en cada diapositiva (conejo anti-TH) durante 10 min a temperatura ambiente. Dip desliza rápidamente en DEPC PBS 3 veces para el lavado y la película de las diapositivas una vez para eliminar el exceso de DEPC PBS.
3. Ponga 200 l de la solución de anticuerpo secundario en cada portaobjetos durante 6 min a temperatura ambiente. Dip desliza rápidamente 3 veces en PBS DEPC para el lavado y la película de las diapositivas para eliminar el exceso de DEPC PBS.
4. Ponga 200 l de la solu ABCción en cada diapositiva durante 4 min a temperatura ambiente. Dip desliza rápidamente en DEPC PBS 3 veces para el lavado y la película de las diapositivas para eliminar el exceso DEPC PBS.
5. Preparar la solución durante el 4 minutos de incubación en la solución ABC DAB (3,3 'diaminobencidina). Utilizar los reactivos incluidos en el kit (Kit DAB sustrato de peroxidasa). Mezcle 1 gota de tampón proporcionado, 1 gota de solución de DAB y 1 gota de 30% de H ₂ O ₂ en 2,5 ml de agua DEPC. Mezclar la solución invirtiendo.
6. Tomar 196 l de la solución DAB y añadir 4 l (2%) de solución de inhibidor de RNasa justo antes de la distribución en portaobjetos. Colocar los portaobjetos en una bandeja limpia (pretratados con una solución descontaminante RNAsa superficie) y pusieron los 200 l de solución de DAB en las diapositivas.
   NOTA: solución DAB debe reaccionar within1 o 2 min.
7. Dip desliza rápidamente en DEPC PBS 3 veces para lavar y poner las diapositivas durante unos segundos en etanol absoluto. Seque las diapositivas con un movimiento rápido en el aire (o utilice un soplador de aire).
   NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C para su uso futuro o procesado para LCM.

Microdissection Capture 5. Láser

1. Descongele las diapositivas rápidamente con un movimiento rápido en el aire (o utilice un soplador de aire). Asegúrese de que las diapositivas de descongelación paso no exceda 5 min.
2. Continúe con LCM. Colocar el portaobjetos bajo el microscopio con el lado de la muestra frente a la tapa del tubo recolector. Elija la mejor magnificación para la muestra. Ajuste el enfoque para ver las células de interés.
   1. Definir la zona de corte y empezar a cortar con el láser. Recoger las células o pieza de tejido en la tapa del tubo de recogida lleno de 50 l de tampón de lisis (del kit de extracción de ARN) disecados. Asegúrese de que el paso del LCM no exceda de 30 minutos.
3. Extraer el ARN total de las células aisladas utilizando un kit de extracción de RNA (cf. Lista de materiales). Siga el protocolo del fabricante.
   1. Incubar las células recogidas durante 30 min a 42 ° C alisar las células. Pre-condición de la columna de purificación de ARN mediante la adición de 250 l de tampón de acondicionamiento. Cargar 50 l de etanol a las células lisadas. Cargue los 100 l de células lisadas en una columna de purificación previo de adaptación.
   2. Centrifugar la columna a 16.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente. Lavar la columna dos veces con tampones de lavado. Eluyen en el volumen mínimo recomendado (11 l) de RNasa libre de agua (no tratada con DEPC, ya que puede interferir con la Bioanalyser). Mantenga 2 l de calidad de la prueba.
      NOTA: Todas las soluciones y los reactivos se proporcionan en el kit.

6. Síntesis de ADNc y RT-PCR cuantitativa

1. Reverse-transcribir RNA de muestras de células dopaminérgicas láser capturado en ADN complementario usando la transcriptasa inversa y oligo (dT). Siga el protocolo del fabricante (cf. Lista de material).
2. Utilice 1 l de ADNc para la amplificación QRT-PCR con cebadores específicos de genes. Configure rea PCRcciones en volumen de 20 l con una mezcla de reacción de arranque en caliente de un solo componente para la PCR cuantitativa recomendada por el fabricante. Realizar cada reacción por triplicado.
   1. Para los experimentos descritos aquí, utilice los siguientes pares de cebadores: Gapdh-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / Gapdh-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-TGG CAG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC-3 ') / AADC-I (5'-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG-3').
3. Realizar cuantitativa amplificación por RT-PCR utilizando los siguientes parámetros de los ciclos rápidos: 95 ° C durante 5 min seguido de 45 ciclos de 10 segundos a 95 ° C, 10 seg a 60 ° C y 10 seg a 72 ° C. Realizar un análisis de la curva de fusión utilizando la configuración predeterminada del instrumento para deterla formación de producto homogénea ne.
4. Analizar los datos utilizando el software incorporado.
   1. Normalizar los valores de expresión de genes marcadores DA Th y AADC con la expresión de los dos genes de referencia GAPDH y Rpl13a para obtener niveles relativos de expresión como se describió anteriormente ^14.

Resultados

Este procedimiento immunolabeling rápida permite la visualización de células de interés mientras se mantiene la integridad del ARN. La Figura 1 ilustra las etapas de preparación de tejido antes de la extracción de ARN. Después de cryosectioning, las neuronas dopaminérgicas están etiquetados utilizando un anticuerpo dirigido contra la tirosina hidroxilasa (neuronas marcadas aparecen en marrón). Dependiendo de la pregunta experimental, las células individuales o mayor región de interés se pue...

Discusión

El punto más crítico de este método consiste en etiquetar células de interés, mientras que la prevención de la degradación del ARN. Como ARNasas son activos en soluciones acuosas, la disminución de los tiempos de incubación mejora la conservación de ARN ^11,15. Todas las soluciones utilizadas deben ser tratados con DEPC para inactivar RNAsas. Todos los materiales y superficies deben ser tratados con una solución de descontaminación ARNasa superficie para evitar la contaminación ARNasas. Finalmente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR