迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

要約

特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。

要約

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、高空間分解能を有する薄い組織切片から特定の細胞の単離を可能にする。効果的なLCMは、異種の組織からの細胞の亜集団の正確な同定を必要とします。 LCMのための目的の細胞の同定は、通常、形態学的基準や蛍光タンパク質レポーターに基づいています。 LCMおよび迅速な免疫標識の組み合わせは、特定の細胞型を視覚化し、周囲の組織から隔離するための代替的かつ効率的な手段を提供する。高品質RNAは、その後、純粋な細胞集団から抽出し、さらにRNA配列決定、マイクロアレイまたは定量RT-PCRなどの下流の適用のために処理することができる。このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物に記載されている。この記事の目的は、RNAの完全性を維持しながら、細胞集団の迅速な免疫標識を実行する方法を説明するために、どのようにLCMを用いて、これらの特定の細胞を単離することである。ここで、我々は説明するdは、この多段階手順1日齢マウスからの脳組織におけるドーパミン作動性細胞の免疫標識および捕捉することができる。我々は、特別な配慮に値する重要な重要なステップを強調表示します。このプロトコルは、目的の組織および種々の細胞に適合させることができる。異分野の研究者らは、おそらくこのアプローチのデモの恩恵を受ける。

概要

脳は、複雑なネットワークを形成する異なるニューロンタイプの多種多様で構成されている。これらのニューロンは、それらの形態、接続性と遺伝子発現パターン¹に係る個別のグループおよびサブグループに編成されています。マイクロアレイ、次世代シーケンシング、および定量RT-PCRの開発は、異なる生物学的状況^1,2におけるニューロン集団の遺伝子発現プロファイルを比較するための可能性を提供する。 RNAの完全性^を維持しながら^、2-4これらの高感度分析は、目的の細胞型の正確な同定および単離を必要とする。蛍光活性化セルソーティング（FACS）技術が広く細胞表面マーカーおよび/または形態学に基づいて、特定の細胞型を単離するために使用されている。 FACSは、空間分解能⁵の完全な損失をもたらすソーティング前の細胞解離段階を必要とします。多くのニューロンの亜集団は、目での解剖学的分布に応じて互いに区別さEの脳。薄い脳切片に適用レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、高空間分解能^6-8での細胞の特定の分離のための適切なオプションを提供します。 LCMの主な制限は、形態学的基準または遺伝的動物モデルで操作蛍光タンパク質レポーターに基づいて目的の細胞を同定するために必要であった。 LCMと組み合わせて、RNAの完全性を保存クイック免疫標識法を行うための新しい技術の開発が、現在、遺伝子プロファイリング実験を続行する細胞亜集団の単離を可能にする。

このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物^1,9-13に記載されている。ここでは、LCMを迅速免疫標識を組み合わせることによって、複雑な組織構造内の細胞の特定のサブセットから高品質のRNAを得るための詳細な手順を示す。我々は、最大のRNA回収率を得るために重要な重要なステップを実行し、sigができるように、RNAの分解を回避する方法を示してnificantly遺伝子発現プロファイリングに影響を与える。

このプロトコルのデモンストレーションのために、1日齢のマウスの脳からドーパミン作動性ニューロンが標的とされた。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミン合成の律速酵素に対する抗体を用いて免疫標識することができる。 TH免疫染色に続いて、ドーパミン作動性ニューロンの個人またはグループは、その後LCMを用いて単離することができる。顕微解剖した細胞を、溶解緩衝液中に収集され、そしてRNAは、RNA単離キットを用いて抽出した。品質と抽出されたRNAの量は、バイオアナライザー^5を使用して測定される。用いた遺伝子発現のさらなる分析：RNA配列決定、マイクロアレイ、または定量RT-PCRは、続いて^2,4,6-を行うことができる。一例として、二段階のqRT-PCRは、単離されたドーパミン作動性ドメインを捕捉し、レーザーで実証されている。 2ドーパミン作動性ニューロンのマーカー遺伝子の発現レベルの相対的定量化は、このプロトコルの選択性を示している。

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プロトコル

注：実験は、実験動物の管理と使用に関するカナダのガイドに従って行ったとラヴァル大学動物保護委員会によって承認された。

1.サンプルの調製

注：この例では、生後1日目のマウスの脳を使用していました。

1. その後氷冷L15培地中で可能な限り迅速に脳を解剖、子犬のために3から4分間砕いた氷に低体温麻酔を使用してください。 2分以内に、この手順を実行します。
2. 転送は、金型（物資のCF。リスト）を埋め込 ​​んで脳を解剖し、凍結組織包埋媒体が所望の位置に試料を方向付けるように注意しながらで埋める。 -80℃で液体窒素や店舗ですぐに標本をフリーズします。 30秒以内に、この手順を実行します。
   注：試料は、RNAの品質を損なうことなく、数ヶ月保存することができる。

2.セクショニング

1. メンブレンCOAトリートテッドガラススライド（CF素材のリスト）表面アーゼ除染液とは、RNアーゼの痕跡を除去する。 DEPC水でスライドを洗浄し、それらを乾燥させます。代わりに、一晩200℃で焼くスライド。
2. 以前に、表面のRNAse除染液で洗浄するクライオスタットで凍結サンプルを転送します。 10μmの厚さでCとスライス標本を-20℃でクライオスタットチャンバ温度を設定します。膜コーティングしたスライド上の組織切片を収集し、染色の前にそれらを乾燥10分ましょう。また、ストアは、染色まで-80℃でスライドする。

染色溶液の調製

1. 単に実験の開始前に、すべての溶液を調製し、RNAの分解を防ぐために（洗浄液を除く）すべての染色溶液中のRNアーゼ阻害剤を使用する。
2. 緩衝溶液を準備します。 、すべての溶液に、同じ緩衝液を使用して（1％BSAを補充した成るRNアーゼを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）0.2％トリトンおよび2％のRNAse阻害剤）。各スライドのために、緩衝液400μlの（一次および二次抗体の200μlのための200μl）を用意する。
3. 固定液を準備し、70％エタノールを使用するには、-20℃で保存。 RNA抽出収率の大幅な低下を避けるために最小限の組織固定処置を続ける。
   注：また、-20℃で保存し、5％酢酸を補充した95％エタノール溶液を使用。
4. 緩衝液中で一次抗体を希釈することによって一次抗体溶液を調製する。ドーパミン作動性ニューロンの標識のために、チロシンヒドロキシラーゼ（TH、ドーパミン産生のためのレート制限酵素）を標的とする抗体を使用しています。迅速なインキュベーション時間を補償するために、高濃度の抗体を使用する。 1:25希釈でTH抗体を使用してください。
   注：1,000：通常の免疫蛍光プロトコルでは、この抗体は、1の希釈で一晩インキュベート強いシグナルを与える。このプロトコルでは、40倍以上concentrat使用されている短いインキュベーション時間のために編。このための方法に使用される高濃度の抗体を、非特異的標識化の増加を確認するために並行して、標準的な免疫染色​​を行う。
5. 緩衝液中で二次抗体を希釈することによって二次抗体溶液を調製する。 100：1の濃度のビオチン化二次抗体を使用してください。
   注：この例では、抗ウサギビオチン化抗体を使用していました。
6. ビオチン化二次抗体の検出のためのアビジン - ビオチン複合体（ABC）溶液を調製する。 1の濃度の化合物Aと化合物Bを添加することによってABC溶液を作製：DEPC PBSで希釈した100は、2％のRNAse阻害剤を補充した。スライドに追加する前に、アビジン - ビオチン複合体の30分を準備します。

4.染色

1. すぐに空気中にそれらをフリックで-80℃から一度に1つまたは2つのスライドを解凍（または送風機を使用してください）​​。疎水性とサラウンドのセクションバリアペンと、数秒間乾燥させます。
   1. -20℃でわずか5分間冷たい固定剤溶液中にスライドを入れてください。すぐに洗浄にDEPC PBS 6-8回スライドを浸し、その後固定液の過剰を削除するには、一度空気中の振る。
   2. DEPC PBSの過剰を削除するスライドをフリック。ステップを解凍スライドが5分を超えていないことを確認してください。
2. クリーントレイに置きスライド（表面リボヌクレアーゼ除染液で前処理をRNアーゼの痕跡を除去するため）、室温で10分間、各スライド（ウサギ抗TH）に一次抗体溶液200μlを入れた。ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、DEPC PBSの過剰を削除するには、一度スライドをフリック。
3. 室温で6分間各スライド上の二次抗体溶液200μlを入れてください。ディップはすぐに洗浄のためのDEPC PBS中で3回スライドし、DEPC PBSの過剰を削除するスライドをフリック。
4. ABCソル200μlのを入れて室温で4分間各スライド上る。ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、過剰DEPC PBSを除去するためのスライドをフリック。
5. DAB（3,3 'ジアミノベンジジン）ABC溶液中でのインキュベーションの4分の間に溶液を準備します。キット（DABペルオキシダーゼ基質キット）で提供される試薬を使用してください。提供される緩衝液の1滴、DAB溶液を1滴及びDEPC水2.5ミリリットルの30％H ₂ O ₂の1滴を混合する。反転させた溶液を混合。
6. DAB溶液の196μLを取り、ちょうどスライドに拡散前のRNアーゼ阻害剤溶液4μlの（2％）を追加します。置きスライド（表面リボヌクレアーゼ除染液で前処理）クリーントレイに、スライド上のDAB溶液200μlを入れた。
   注：DAB溶液は以内に1または2分を反応させる必要があります。
7. ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、無水エタノールで数秒間スライドを置く。空気中にそれらをフリックでスライドを乾燥（または送風機を使用してください）​​。注：スライドを将来の使用のために-80℃で保存またはLCMのために処理することができる。

5.レーザーキャプチャーマイクロダイセクション

1. 空気中にそれらをフリックですばやくスライドを解凍（または送風機を使用してください）​​。ステップを解凍スライドが5分を超えていないことを確認してください。
2. LCMに進んでください。捕集管キャップに直面して試料側で顕微鏡下でスライドを置きます。サンプルのための最高の倍率を選択してください。目的の細胞を見てピントを調整します。
   1. 切削領域を定義し、レーザーで切断開始。 （RNA抽出キットから）の溶解緩衝液50μlで満たされた捕集管キャップで解剖細胞または組織片を収集します。 LCMのステップが30分を超えていないことを確認してください。
3. RNA抽出キット（CF。材料のリスト）を用いて単離した細胞から全RNAを抽出します。製造業者のプロトコルに従ってください。
   1. 42℃で30分間に収集された細胞をインキュベート細胞を溶解。コンディショニングバッファー250μLを添加することにより、RNA精製カラムを事前調整する。ロード溶解細胞にエタノールを50μlの。前処理精製カラムに溶解した細胞を100μlをロードします。
   2. 室温で2分間16000×gでカラムを遠心。洗浄バッファーで二回カラムを洗浄。 RNaseフリー水の最小限の推奨容量（11μL）（それはバイオアナライザーを妨げる可能性として扱わDEPCではない）で溶出する。テスト品質に2μLにしてください。
      注：すべてのソリューションおよび試薬キットで提供されている。

6. cDNA合成および定量的RT-PCR

1. レーザーからの逆転写RNAサンプルを逆転写酵素およびオリゴ（dT）を用いて相補DNAにドーパミン作動性細胞を捕獲した。製造業者のプロトコル（CF。材料のリスト）に従ってください。
2. 遺伝子特異的プライマーを用いて定量RT-PCR増幅のためのcDNA1μlのを使用してください。 PCR REAを設定定量的PCRのための一成分ホットスタート反応ミックス20μlの容量中ctions製造業者によって推奨される。三重で各反応を行う。
   1. ここに記載した実験のために、以下のプライマー対を使用します。GAPDH-F（5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 '）/ GAPDH-R（5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'）; RPL13A-F（5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 '）/ RPL13A-R（5'-CTG C​​CT GTT TCC GTA ACC TC-3'）;のTh-F（5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 '）/ TH-R（5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'）; AADC-F（5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 '）/ AADC-R（5'- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3'）。
3. 次の急速サイクリングパラメータを用いた定量的RT-PCR増幅を行う：95℃10秒95℃、60℃で10秒、72℃で10秒を45サイクル、続いて5分間。 determiする機器のデフォルト設定を使用して、融解曲線分析を実行NE均質産物形成。
4. 組み込みソフトウェアを使用してデータを分析する。
   1. 先に説明したように¹⁴の相対的な発現レベルを得るために、2つの参照遺伝子GAPDHおよびRPL13Aの発現DAマーカー遺伝子ThおよびAADCの発現値を正規化。

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結果

RNAの完全性を維持しながら、この迅速な免疫標識手順は、目的の細胞の可視化を可能にする。 図1は、RNA抽出前に組織調製のステップを示している。凍結切片の後、ドーパミン作動性ニューロンは、（ラベルニューロンが茶色で表示されます）チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いて標識される。実験的な質問に依存、単一細胞または関心の大きい領域は、LCM（ - ...

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ディスカッション

この方法の最も重要な点は、RNAの分解を防止しながら、目的の細胞を標識することにある。 RNA分解酵素は、水溶液中でアクティブであるため、インキュベーション時間を減少させることは、RNAの保全^11,15を向上させます。使用されるすべてのソリューションは、RNアーゼを不活性化するDEPCで処理しなければならない。全ての材料及び表面がRNアーゼ汚染を防ぐための表面のRNAse汚染除?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR