Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Özet

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Özet

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yüksek uzaysal çözünürlüğü ile ince doku bölümleri belirli hücrelerin izolasyonu sağlar. Etkili LCM heterojen doku hücreleri alt popülasyonlar hassas tanımlanmasını gerektirir. LCM ilgi hücrelerin tanımlanması, genellikle morfolojik kriterlere veya flöresanlı proteinin, muhabir dayanmaktadır. LCM ve hızlı immunolabeling kombinasyonu alternatif ve etkili bir araç özel hücre tiplerini görselleştirmek ve çevresindeki doku onları izole etmek için sunuyor. Kaliteli RNA daha sonra saf hücre popülasyonu elde edilmesi ve daha RNA dizileme, mikrotertibin veya Mah-PCR olmak üzere mansap uygulamalar için işlenmiş olabilir. Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az yayınlarda tarif edilmiştir. Bu makalenin amacı nasıl LCM kullanarak bu özel hücrelerin izole RNA bütünlüğünü tutarak, ve sırasında hücre popülasyonu hızla immün gerçekleştirmek için nasıl göstermek için. Burada, biz göstermekd immün ve bir günlük farelerden elde edilen beyin dokusu dopaminerjik hücrelerin yakalamak için bu çok aşamalı bir prosedür. Biz özel dikkat hak anahtar kritik adımlar vurgulayın. Bu protokol, doku ve ilgi çeşitli hücreler için adapte edilebilir. Farklı alanlardan gelen araştırmacılar büyük olasılıkla bu yaklaşımın gösterilmesi yararlanacaktır.

Giriş

Beyin, karmaşık ağlar oluşturan farklı nöron tiplerinin çok çeşitli oluşmaktadır. Bu nöronlar kendi morfolojisi, bağlantı ve gen ifadesi desen ^1'e göre farklı gruplar ve alt organize edilmektedir. mikrodizileri gelişimi, yeni nesil dizileme ve Mah-PCR, farklı biyolojik bağlamlarda ^1,2 nöronal nüfus gen ekspresyon profillerini karşılaştırma olanağı sundu. Bu hassas analizler RNA bütünlüğü ^2-4 tutarken ilgi hücre tiplerinin kesin belirlenmesi ve izolasyon gerektirir. Floresan etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) tekniği çok hücre yüzeyi işaretleri ve / veya morfolojiye göre özel hücre tiplerini izole etmek için kullanılmıştır. FACS uzamsal çözünürlük ⁵ tam bir kayıp ile sonuçlanır önce sıralama, bir hücre ayırma aşamasını gerektirir. Bir çok alt-popülasyonları bulunduğunu nöronal th anatomik dağılıma göre birbirlerinden ayırt edilirlerE beyin. İnce beyin bölümlerinde uygulanan lazer yakalama mikrodiseksiyon yüksek uzaysal çözünürlüğü ^6-8 ile hücrelerin spesifik izolasyonu için uygun bir seçenek sunar. LCM önemli bir sınırlama, morfolojik kriterlere ya da genetik olarak hayvan modellerinde tasarlanmış floresan protein muhabir göre ilgi hücreleri belirlemek için bir ihtiyaç olmuştur. LCM ile kombinasyon halinde, bir RNA bütünlüğü korunur pratik immün yöntemleri gerçekleştirmek için yeni tekniklerin geliştirilmesi, hemen gen profil deney devam etmek için hücre alt izolasyonunu sağlar.

Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az sayıda yayın ^1,9-13 tarif edilmiştir. Burada, biz LCM ile hızlı immün birleştirerek karmaşık bir doku yapısında belirli bir hücre alt kümesi yüksek kaliteli RNA elde etmek için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Biz maksimum RNA kurtarma elde etmek için anahtar kritik adımları uygulayın ve sig olabilir RNA bozulmasını önlemek için nasıl göstermekanlamlı ölçüde etki gen ekspresyon profili.

Bu protokolün gösteri için, bir günlük fare orta beyin dopaminerjik nöronlar hedef alındı. Dopaminerjik nöronlar, tirosin hidroksilaz (TH) karşı yönlendirilmiş bir antikor, dopamin sentezi için oran-sınırlayıcı enzim kullanılarak imüno edilebilir. TH immun boyama sonra, tek tek ya da dopaminerjik nöronların grupları daha sonra LCM kullanılarak izole edilebilir. Microdissected hücreler lizis tamponu içinde toplanır ve RNA, RNA izolasyon kiti kullanılarak ekstre edilir. Kalite ve çıkarılan RNA miktarı Bioanalyzer ⁵ kullanılarak ölçülmektedir. Kullanılarak gen tanımının diğer analizleri: RNA sıralanması, mikrodizi veya qRT-PCR, daha sonra ^2,4,6 gerçekleştirilebilir. Bir örnek olarak, bir iki-aşamalı QRT-PCR lazer yakalanan izole dopaminerjik etki ile gösterilmiştir. Iki dopaminerjik nöron marker genlerinin ekspresyon seviyeleri rölatif ölçümü, bu protokol seçicilik göstermektedir.

Protokol

NOT: Deneyler Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kanada Kılavuzu'na uygun olarak yapıldı ve Université Laval Hayvanları Koruma Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Numune Hazırlama

NOT: Bu örnekte, doğum sonrası 1. günde, fare beyni kullanılır.

1. 3 yavrular için en az 4 için ezilmiş buz hipotermi anestezi kullanın, sonra buz gibi soğuk L15 ortamında mümkün olduğunca çabuk beyinleri teşrih. 2 dakika içinde bu adımı gerçekleştirin.
2. Aktarım disseke kalıp (materyalininin cf. Liste) gömme beyinleri ve istenilen konumda numune yönlendirmek için özen dondurulmuş doku gömme medya ile doldurun. -80 ° C'de, sıvı azotun ve mağaza hemen örnekleri dondurun. 30 saniye içinde bu adımı gerçekleştirin.
   NOT: Örnekler RNA kalitesinden ödün vermeden birkaç ay saklanabilir.

2. Kesit

1. Sağlıgı membran coated cam slaytlar (cf. malzemenin listesi) yüzey RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile RNases herhangi bir iz ortadan kaldırmak için. DEPC su slaytlar yıkayın ve kurumaya bırakın. Alternatif olarak, bir gecede 200 ° C'de fırında slaytlar.
2. Daha önce bir yüzey RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile temizlenmelidir bir kriostat dondurulmuş örnekleri aktarın. 10 mikron kalınlığında -20 ° C ve dilim örneklerinde Set kriyostat odası sıcaklığı. Membran kaplı slaytlar üzerinde doku bölümleri toplayın ve boyama önce onlara kuru 10 dakika sürdü. Alternatif olarak, mağaza boyama kadar -80 ° C'de slaytlar.

Boyama Çözümleri 3. Hazırlık

1. Sadece deney başlamadan önce tüm çözelti hazırlayın, ve RNA bozulmasını önlemek için (yıkama çözeltileri için hariç) boyama Çözeltilerin RNaz inhibitörü kullanımı.
2. Tampon çözeltisi hazırlayın. % 1 BSA ilave RNAse içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS oluşan tüm çözümler aynı tampon () kullanarak% 0.2 Triton ve% 2 RNaz inhibitörü). Her bir slayt için, tampon çözelti içinde 400 ul (primer, 200 ul ve ikincil antikorlar için 200 ul) hazırlayın.
3. Sabitleyici çözeltisi hazırlandı:% 70 etanol kullanmak -20 ° C'de tutuldu. RNA ekstraksiyon veriminde ciddi bir azalma önlemek için minimal doku tespit prosedürü tutun.
   Not: Alternatif olarak, -20 ° C'de tutuldu ve% 5 asetik asit ilave% 95 etanol solüsyonu kullanın.
4. Tampon çözeltisi içinde birincil antikor seyreltilmesiyle primer antikor çözeltisi hazırlayın. Dopaminerjik nöronlar etiketleme için, tirozin hidroksilaz (TH, oran dopamin üretimi için enzim sınırlayıcı) hedefleyen bir antikor kullanın. Pratik inkübasyon süresi telafi etmek için antikorun daha yüksek bir konsantrasyon kullanın. 01:25 bir seyreltme TH antikoru kullanın.
   NOT: 1.000: Normal immünofloresan protokolü, bu antikor, bir 1 seyreltme gece boyunca kuluçkalanmıştır güçlü bir sinyal verir. Bu protokolde, bu 40X daha konsantreler kullanılırKısa inkübasyon süresi nedeniyle ed. Bu nedenle yöntem için kullanılan yüksek antikor konsantrasyonu için spesifik olmayan etiketleme herhangi bir artış kontrol etmek için paralel olarak standart bir immün gerçekleştirin.
5. Tampon çözeltisi içinde sekonder antikor seyreltilmesiyle ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. 100: 1 bir konsantrasyonda biyotinile edilmiş ikincil antikor kullanın.
   NOT: Bu örnekte, bir anti-tavşan biyotinile antikor kullanılır.
6. Biyotinlenmiş sekonder antikor tespiti için avidin-biyotin kompleksi (ABC) çözeltisi hazırlayın. 1 arasında bir konsantrasyonda bileşik A ve bileşik B eklenerek ABC çözeltisi oluşturunuz: DEPC PBS içinde seyreltilmiş 100 uL% 2 RNaz inhibitörü ile takviye edilmiştir. Slaytlar eklemeden önce Avidin-Biotin kompleksi 30 dakika hazırlayın.

4. Boyama

1. Hızla havada onları iterek ° C -80 zaman bir ya da iki slaytlar çözülme (ya da bir hava üfleyici kullanın). Hidrofobik ile Surround bölümlerbariyer kalem ve bir kaç saniye kurumaya bırakın.
   1. -20 ° C 'de en fazla 5 dakika boyunca soğuk halde sabitleyici çözeltisi slaytlar koyun. Çamaşır yıkama için DEPC PBS 6-8 kez slaytlar hızlı, daha sonra fiksatif çözüm fazlasının ayrılması daldırma havada kez çalkalayın.
   2. DEPC PBS fazlasının kaldırmak için slaytlar Flick. Adımı Defrost slaytlar 5 dk geçmemesi emin olun.
2. Temiz bir tepsiye yerleştirin kayar (bir yüzey RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile önceden tedavi edilen RNaz'larına herhangi bir izi ortadan kaldırmak için) ve oda sıcaklığında 10 dakika için her bir sürgü (tavşan anti-TH) birincil antikor çözeltisi 200 ul koyun. Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve DEPC PBS aşırı kaldırmak için bir kez slaytlar fiske.
3. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca Her bir slayt, ikincil antikor çözeltisinin 200 ul koyun. Dip hızlı yıkama için DEPC PBS içinde 3 kez slaytlar ve DEPC PBS fazlasının kaldırmak için slaytlar fiske.
4. ABC Solu 200 ul koyunoda sıcaklığında 4 dakika boyunca Her bir slayt yon. Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve aşırı DEPC PBS kaldırmak için slaytlar fiske.
5. DAB (3,3 'diaminobenzidin) ABC çözeltisi içinde inkübasyon 4 dakika boyunca çözelti hazırlayın. Kit (DAB Peroksidaz Yüzey Kiti) sağlanan reaktifler kullanın. Sağlanan tampon 1 damla, DAB solüsyonu 1 damla ve DEPC su 2.5ml% 30 H ₂ O ₂ 1 damla karıştırın. Ters çevrilerek çözüm karıştırın.
6. DAB çözeltisi 196 ul al ve slaytlar üzerinde yayılan önce RNaz inhibitör çözeltisinin 4 ul (% 2) ilave edin. Talep (bir yüzey RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile ön muamele edilmiş), temiz bir tepsi üzerine kayar ve slaytlar üzerinde DAB çözeltisi 200 ul koyun.
   NOT: DAB çözümü within1 veya 2 dakika tepki gerekmektedir.
7. Dip DEPC PBS hızlı yıkama için 3 kez slaytlar ve mutlak etanol birkaç saniye slaytlar koydu. Havada onları iterek slaytlar kurulayın (ya da bir hava üfleyici kullanın).
   Not: Slaytlar gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de saklandı veya LCM işlenebilir.

5. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

1. Havada onları iterek hızla slaytlar defrost (ya da bir hava üfleyici kullanın). Adımı Defrost slaytlar 5 dk geçmemesi emin olun.
2. LCM geçin. Toplama tüp kapağı bakacak örnek tarafı mikroskop altında slayt yerleştirin. Numune için en iyi büyütmeyi seçin. Ilgi hücreleri görmek için odağı ayarlayın.
   1. Kesim alanı tanımlayın ve lazer ile kesim başlar. Parçalara hücreleri ya da (RNA ekstraksiyon kiti) liziz tamponunda 50 ul ile dolu toplama borusu kapağın doku parçası toplayın. LCM adım 30 dakika aşmadığı emin olun.
3. Bir RNA özütleme kiti (cf.. Malzeme listesi) kullanılarak izole hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin. Üreticinin protokolünü takip ediniz.
   1. 42 ° C'de 30 dakika boyunca toplanan hücreleri inkübehücreler lize edildi. Ön koşul klima tampon 250 ul ekleyerek RNA saflaştırma sütun. Yük tabii tutulan parçalanmış hücrelerin etanol 50 ul. Önceden koşullandırılmış bir arıtma kolonuna lize hücreler 100 ul yerleştirin.
   2. Oda sıcaklığında, 2 dakika için 16,000 x g'de santrifüjleyin sütunu. Yıkama tampon ile iki kez kolon yıkayın. RNAse içermeyen su minimal önerilen hacmi (11 ul) Zehir (bu BioAnalyser engel olabilir gibi muamele DEPC değil). Test kalitesine 2 ul tutun.
      Not: Bütün çözeltiler ve reaktifler kit sağlanmaktadır.

6. cDNA Sentezi ve Nicel RT-PCR

1. -Ters transkribe ters transkriptaz ve oligo (dT) kullanılarak tamamlayıcı DNA'ya lazer yakalanan dopaminerjik hücrelerinden RNA örnekleri. Üreticinin protokolü (bkz. Malzemenin listesi) izleyin.
2. Gen spesifik primerler ile QRT-PCR için cDNA 1 ul kullanın. Set up PCR reaNicel PCR için bir tek bileşenli sıcak başlangıç ​​reaksiyon karışımı ile 20 ul hacim içinde seksiyonlar, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi. Her biri üçlü halde reaksiyona yürütmek.
   1. Burada tarif edilen deneyler için, aşağıdaki primer çiftler kullanılarak: GAPDH-F (5'-CCA AGA CCC AGA CTG TGG AT-3 '), / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GTT GAT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC ACC GTA TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC-3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC'si-F (5'CAT GAG AGC TTC TGC SKK TC -3 ') / AADC'si-R (5'GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
3. Ardından hızlı döngü parametreleri kullanılarak kantitatif RT-PCR amplifikasyonu yapın: 95 ° C, 10 saniye 45 döngü, 95 ° C, 60 ° C 'de 10 saniye ve 72 ° C'de 10 saniye, ardından 5 dakika karıştırıldı. Belirlenme aracın varsayılan ayarı kullanarak erime eğrisi analizi yapınne homojen ürün oluşumu.
4. Yerleşik yazılım kullanarak verileri analiz edin.
   1. Daha önce tarif edildiği gibi ¹⁴ nispi ekspresyon seviyelerini elde etmek için, iki referans gen, GAPDH ve Rpl13a sentezlenmesi DA markör genleri Th ve AADC ifade değerleri normalize.

Sonuçlar

Bu hızlı immün prosedürü RNA bütünlüğünü koruyarak ilgi hücrelerin görselleştirme sağlar. 1 RNA ekstraksiyon öncesi doku hazırlık aşamaları göstermektedir Şekil. Cryosectioning sonra, dopaminerjik nöronların tirosin hidroksilaz karşı yönelik bir antikor (işaretlenmiş nöronlar kahverengi görünür) ile etiketlenmiştir. Deney Söz bağlı olarak, tek bir hücre ya da ilgi daha büyük bölge LCM kullanılarak izole edilebilir (Şekil 1D - <...

Tartışmalar

Bu yöntemin en kritik nokta RNA bozulmasını önlerken ilgi hücreleri etiketleme oluşur. RNases sulu çözeltilerde aktif olarak kuluçka süreleri azalan RNA koruma ^11,15 geliştirir. Kullanılan tüm çözümler RNases inaktive DEPC ile tedavi edilmelidir. Tüm malzemeler ve yüzeyler RNaz'larına kirlenmeyi önlemek için bir yüzey RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile muamele edilmesi gerekir. Son olarak, bu koşullar altında, her Çözeltilerin RNaz inhibitörü ilave bozunmadan RNA koruma etkili...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR