Выделение РНК из клеточных конкретные подгруппы с помощью лазера захвата микродиссекции в сочетании с быстрым иммунноокрашивания

Резюме

Анализ экспрессии гена подмножества клеток в определенной ткани представляет собой серьезную проблему. Эта статья описывает, как изолировать высокого качества общей РНК с определенного клеточной популяции путем объединения быстрый способ иммунноокрашивания с лазерным захвата микродиссекции.

Аннотация

Лазерная захватывающая микродиссекция (LCM) позволяет изолировать конкретных клеток из тонких срезов тканей с высоким пространственным разрешением. Эффективное LCM требуется точное определение клеток субпопуляций от гетерогенной ткани. Идентификация клеток, представляющих интерес для LCM обычно на основе морфологических критериев или флуоресцентный белок репортеров. Сочетание LCM и быстрого иммунного предлагает альтернативные и эффективные средства для визуализации конкретных типов клеток и изолировать их от окружающих тканей. Высококачественный РНК может затем быть получена из чистого клеточной популяции и дополнительно обрабатываются для последующих применений, в том числе РНК-последовательности, микрочипов или QRT-PCR. Этот подход был ранее выполнен и кратко описаны в нескольких публикациях. Цель этой статьи заключается в иллюстрации того, как выполнять быстрое иммунного клеточной популяции, сохраняя при этом целостность РНК, и, как изолировать эти специфические клетки, используя НОК. Здесь мы проиллюстрируемd такая многоходовая процедура, с помощью иммунного и захвата дофаминергических клеток в ткани головного мозга от одного-дневных мышей. Мы выделяем ключевые важных шагов, которые заслуживают особого внимания. Этот протокол может быть адаптирован для различных тканей и клеток, представляющих интерес. Исследователи из разных областей, скорее всего, выгоду от демонстрации этого подхода.

Введение

Мозг состоит из большого разнообразия различных типов нейронных сетей, образующих сложные. Эти нейроны организованы в различных группах и подгруппах в зависимости от их морфологии, подключения и экспрессии генов рисунка ^1. Развитие микрочипов следующего поколения последовательности, а также Qrt-PCR предлагается возможность сравнить профили экспрессии генов популяций нейронов в различных биологических контекстах ^1,2. Эти чувствительные анализы требуют точной идентификации и изоляции клеточных типов, представляющих интерес, сохраняя РНК целостности ^2-4. Флуоресцентный активирована сортировки клеток (FACS) методика широко используется для выделения конкретных типов клеток, основанные на клеточной поверхности маркеров и / или морфологии. FACS требует диссоциации клеток шаг до сортировки, что приводит к полной потере пространственным разрешением ^5. Многие нейронные субпопуляции отличаются друг от друга в соответствии с их анатомической распределения в гое мозг. Лазерная захвата микродиссекции применяется на тонких срезах мозга обеспечивает подходящий вариант для конкретного изоляции клеток с высоким пространственным разрешением ^6-8. Основным недостатком LCM была необходимость идентификации клеток, представляющих интерес, основанные на морфологических критериев или на флуоресцентный белок журналистами генетически модифицированных животных моделях. Разработка новых методов для выполнения быстрых методов иммунноокрашивания, которые сохранили целостность РНК, в сочетании с LCM, теперь позволяет изолировать клеточных субпопуляций, чтобы продолжить генов профилирования экспериментов.

Этот подход был ранее выполнен и кратко описаны в нескольких публикациях ^1,9-13. Здесь мы демонстрируем подробную процедуру получения высокого качества РНК с определенного подмножества клеток в комплексной структуры тканей путем объединения быстрый иммунноокрашивания с LCM. Мы покажем, как выполнять основные критические шаги для получения максимального извлечения РНК и избежать деградации РНК, как это может сигственно ген воздействие выражение профилирования.

Для демонстрации этого протокола, дофаминергические нейроны от одного-дневных мозга мыши были направлены. Дофаминергических нейронов может быть immunolabeled с использованием антитела, направленные против тирозингидроксилазы (TH), то фермент, ограничивающий скорость синтеза дофамина. После TH иммуноокрашивания, индивидуальный или группы дофаминергических нейронов может быть выделен с использованием НОК. Микродиссекции клетки собирают в буфере для лизиса, и РНК экстрагировали с использованием набора для выделения РНК. Качество и количество добываемого РНК измеряли с помощью Bioanalyzer ^5. Дальнейший анализ экспрессии генов с использованием: РНК последовательности, микрочипов, или Qrt-ПЦР может затем быть выполнена ^2,4,6. В качестве примера, в два этапа Qrt-ПЦР показано на лазерных захвачен изолированные дофаминергических доменов. Относительная количественная оценка уровня экспрессии двух дофаминергических генов нейронов маркер показывает селективность этого протокола.

протокол

Примечание: эксперименты были проведены в соответствии с Руководством по Канады по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Лаваля Комитета по Университета защиты животных от.

1. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере мы использовали мозг мышей в постнатальный день 1.

1. Используйте гипотермии анестезии в колотый лед для 3 до 4 мин для щенков, то рассекают мозги как можно быстрее в ледяной среде L15. Выполните этот шаг в течение 2 мин.
2. Передача расчлененный мозги в вложение пресс-формы (ср. Список техники) и залейте замороженной ткани вложения средств массовой информации с учетом необходимости ориентировать образец в нужное положение. Немедленно заморозить образцы в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Выполните этот шаг в течение 30 сек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть сохранены несколько месяцев без ущерба для качества РНК.

2. Секционирование

1. Лечить мембраны соаТед стеклышки (ср. перечень материалов) с поверхности РНКазы дезактивации решения, чтобы устранить любые следы РНКазы. Вымойте слайды в DEPC водой и дайте им высохнуть. Кроме того, пекут слайды в течение ночи при 200 ° С.
2. Трансфер замороженных образцов в криостате предварительно очищенные раствором поверхность РНКазы дезактивации. Установите криостат температура в камере при -20 ° С и нарезать образцов при 10 толщиной мкм. Сбор срезах тканей на мембране покрытием слайды и дайте им высохнуть 10 минут до окрашивания. Кроме того, магазин скользит при -80 ° С до окрашивания.

3. Подготовка окрашивания Solutions

1. Подготовьте все решения непосредственно перед началом эксперимента, а также использовать ингибитор РНКазы во всех окрашивания растворов (для моющих растворов, кроме) для предотвращения деградации РНК.
2. Подготовка буферного раствора. Используйте тот же буфер во всех растворов (в составе РНКазы фосфатно-солевом буфере (PBS), дополненной 1% BSA,0,2% Triton и 2% ингибитора РНКазы). Для каждого слайда, подготовить 400 мкл буферного раствора (200 мкл для первичной и 200 мкл для вторичных антител).
3. Подготовка Фиксирующий раствор: используют 70% этанола выдерживали при -20 ° C. Держите процедуру фиксации тканей минимальна, чтобы избежать резкого снижения доходности экстракции РНК.
   Примечание: В качестве альтернативы, использовать 95% раствор этанола, дополненную 5% уксусной кислоты выдерживают при -20 ° С.
4. Приготовьте раствор первичного антитела путем разбавления первичного антитела в буферном растворе. Дофаминергических нейронов маркировки, используйте антитело, нацеленную на тирозингидроксилазу (TH, ограничение скорости фермента для производства дофамина). Использование высокой концентрации антитела для компенсации быстрого времени инкубации. Использование TH антитела в разведении 1:25.
   Примечание: В нормальном протокола иммунофлюоресценции, это антитело дает сильный сигнал при инкубации в течение ночи при разведении 1: 1000. В этом протоколе, он используется 40X больше Концентратред из-за короткого инкубационного периода. Из-за высокой концентрации антитела, используемого для этого метода, выполнить стандартную иммунное окрашивание параллельно, чтобы проверить любое увеличение неспецифической маркировки.
5. Подготовка раствора вторичного антитела путем разбавления вторичного антитела в буферном растворе. Использование биотинилированного вторичного антитела в концентрации 1: 100.
   Примечание: В этом примере мы использовали анти-биотинилированным антителом кролика.
6. Подготовка комплекса (ABC) раствор авидин-биотин для обнаружения биотинилированных вторичных антител. Сделать раствор ABC путем добавления соединение А и соединение B в концентрации 1: 100 разводят в DEPC PBS с добавлением 2% ингибитора РНКазы. Подготовка авидинбиотиновом комплексе 30 мин перед добавлением его к слайдам.

4. Окрашивание

1. Оттепель один или два слайда в это время из -80 ° С, щелкая ими в воздухе быстро (или использовать специальный вентилятор,). Surround участки с гидрофобнымбарьер перо и дайте высохнуть в течение нескольких секунд.
   1. Поместите слайды в холодном растворе фиксирующего не более чем за 5 мин при -20 ° С. Встряхните один раз в воздух, чтобы удалить избыток фиксирующего раствора, то, быстро окунуть слайдов в DEPC PBS 6-8 раз для стирки.
   2. Флик слайды, чтобы удалить избыток DEPC PBS. Убедитесь, что слайды шаг размораживания не превышает 5 мин.
2. Место скользит по чистой лоток (предварительно обработанной раствором поверхности РНКазы дезактивации, чтобы устранить любые следы РНКазы) и положить 200 мкл раствора первичных антител каждого слайда (кролик анти-TH) в течение 10 мин при комнатной температуре. Dip быстро скользит в DEPC PBS 3 раза для промывки и Флик слайды один раз, чтобы удалить избыток DEPC PBS.
3. Поместите 200 мкл раствора вторичного антитела на каждом слайде в течение 6 мин при комнатной температуре. Dip слайды быстро 3 раза в DEPC PBS для мытья и вылить слайды, чтобы удалить избыток DEPC PBS.
4. Положите 200 мкл Солу ABCции на каждом слайде в течение 4 мин при комнатной температуре. Dip быстро скользит в DEPC PBS 3 раза для промывки и Флик слайды, чтобы удалить лишнюю DEPC PBS.
5. Подготовка DAB (3,3 ') диаминобензидина раствор в течение 4 мин инкубации в растворе ABC. Использовать реагенты, предоставляемыми в комплекте (DAB субстрата пероксидазы Kit). Смешайте 1 каплю предоставляемого буфера, 1 каплю раствора DAB и 1 каплю 30% H ₂ O ₂ в 2.5 мл DEPC воды. Смешайте решение путем обращения.
6. Взять 196 мкл раствора DAB и добавить 4 мкл (2%) РНКазы раствора ингибитора перед распространением на слайдах. Место скользит по чистой лоток (предварительно обработанные раствором дезактивации поверхности РНКазы) и поставить 200 мкл раствора DAB на слайдах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: решение DAB должны реагировать за 1 или 2 мин.
7. Dip быстро скользит в DEPC PBS 3 раза для промывки и положить слайды в течение нескольких секунд в абсолютном этаноле. Высушите слайды, щелкая ими в воздухе (или использовать специальный вентилятор,).
   Примечание: Слайды можно хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования или обработаны для LCM.

5. Лазерная микродиссекция Capture

1. Размораживание слайды быстро щелкая их в воздухе (или использовать специальный вентилятор,). Убедитесь, что слайды шаг размораживания не превышает 5 мин.
2. Перейдите к LCM. Поместите слайд под микроскопом с образцом стороне, обращенной к сбора трубки колпачок. Выбор наилучшего увеличение для образца. Отрегулируйте фокус, чтобы увидеть клеток, представляющих интерес.
   1. Определите лесосеки и начать сокращать с помощью лазера. Сбор клеток или расчлененный кусок ткани в колпачке сбора трубки, заполненной 50 мкл буфера для лизиса (с использованием набора для экстракции РНК). Убедитесь, что этап LCM не превышает 30 мин.
3. Извлечение общую РНК, выделенной из клеток с использованием экстракции РНК комплект (ср. Список материалов). Следовал протоколу производителя.
   1. Инкубируйте клетки, собранные в течение 30 мин при 42 ° С долизиса клеток. Предварительным условием РНК колонне очистки путем добавления 250 мкл буфера для кондиционирования. Нагрузка 50 мкл этанола, лизированных клеток. Загрузите 100 мкл лизированных клеток на переобусловленного колонне очистки.
   2. Центрифуга колонку при 16000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Промыть колонку дважды стиральных буферов. Элюции в минимальной рекомендованной объема (11 мкл) РНКазы воды (не DEPC обрабатывают, как это может помешать bioanalyser). Держите 2 мкл чтобы испытать качество.
      Примечание: Все решения и реагенты предоставляются в комплекте.

6. Синтез кДНК и количественной ОТ-ПЦР

1. Обратное записать образцы РНК из лазерных захватили дофаминергических клеток в комплементарной ДНК с помощью обратной транскриптазы и олиго (DT). Следовал протоколу производителя (ср. Перечень материалов).
2. Используйте 1 мкл кДНК Qrt-ПЦР-амплификации с геном-специфических праймеров. Настройка ПЦР REActions в объеме 20 мкл с однокомпонентной горячей смеси начало реакции для количественного ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя. Провести каждой реакции в трех экземплярах.
   1. Для экспериментов, описанных здесь, используют следующие пары праймеров: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA ТГК AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-АСА GCC ACT GAG GAG CTG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG ССТ GTT TCC ACC GTA TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT СТС-3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'-CAT GAG AGC TTC ТГК CCT TC-3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT СТС CAG TGT AG-3').
3. Выполнение количественного амплификации RT-PCR с использованием следующих параметров быстрых велосипедных: 95 ° C в течение 5 мин с последующим 45 циклов 10 сек 95 ° С, 10 сек при 60 ° С и 10 с при 72 ° С. Выполнить анализ кривой плавления с использованием настроек по умолчанию инструмента для установпе однородная формация продукт.
4. Анализ данных с помощью встроенного в программное обеспечение.
   1. Нормализация значения экспрессии DA маркеры генов Th и AADC с выражением двух эталонных генов GAPDH и Rpl13a, чтобы получить относительные уровни экспрессии, как описано выше ^14.

Результаты

Это быстрая процедура иммунного позволяет визуализировать клеток, представляющих интерес, сохраняя при этом целостность РНК. Рисунок 1 иллюстрирует этапы подготовки ткани перед экстракцией РНК. После cryosectioning, дофаминергические нейроны помечены с использованием антитела, на...

Обсуждение

Наиболее критическая точка этого метода состоит в том, маркировки клеток, представляющих интерес в то время как предотвращение деградации РНК. Как РНКаз активны в водных растворах, уменьшая время инкубации улучшает сохранение РНК ^11,15. Все решения, используемые должны быть обрабо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR