RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Zusammenfassung

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

Zusammenfassung

Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ermöglicht die Isolierung von spezifischen Zellen von Gewebedünnschnitten mit hoher räumlicher Auflösung. Effektive LCM erfordert eine genaue Identifizierung von Zellen-Subpopulationen aus einer heterogenen Gewebe. Identifizierung von Zellen von Interesse hinsichtlich LCM wird normalerweise auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierendes Protein Reporter basiert. Die Kombination von LCM und schnelle Immunomarkierung bietet eine Alternative und effizientes Mittel, um spezifische Zelltypen zu visualisieren und um sie vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Hochwertige RNA kann dann von einer reinen Zellpopulation extrahiert werden und für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR weiterverarbeitet werden. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Veröffentlichungen beschrieben. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigen, wie eine schnelle Immunmarkierung einer Zellpopulation durchzuführen und dabei RNA Integrität, und wie man diese spezifischen Zellen mit LCM isolieren. Hierin zeigen wird dieses mehrstufigen Verfahrens durch Immunmarkierung und die Erfassung dopaminergen Zellen im Hirngewebe von einem Tage alten Mäusen. Wir heben Taste kritischen Schritte, die besondere Beachtung verdienen. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Geweben und Zellen von Interesse angepasst werden. Forscher aus verschiedenen Bereichen wird wahrscheinlich von der Demonstration dieses Ansatzes profitieren.

Einleitung

Das Gehirn ist von einer großen Vielfalt von verschiedenen Neuronentypen Bilden komplexer Netzwerke zusammen. Diese Neuronen sind in verschiedene Gruppen und Untergruppen nach ihrer Morphologie, Konnektivität und Genexpressionsmuster ¹ organisiert. Die Entwicklung von Mikroarrays, der nächsten Generation Sequenzierung und qRT-PCR bot die Möglichkeit, Genexpressionsprofile von neuronaler Populationen in verschiedenen biologischen Kontexten ^1,2 zu vergleichen. Diese empfindlichen Analysen erfordern die präzise Identifizierung und Isolierung von Zelltypen von Interesse während RNA Integrität ^2-4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik wurde allgemein verwendet, um spezifische Zelltypen, basierend auf Zelloberflächen-Marker und / oder Morphologie zu isolieren. FACS benötigt eine Zellabtrennungsschritt vor der Sortierung, die in einem vollständigen Verlust der räumlichen Auflösung ⁵ führt. Viele neuronalen Subpopulationen voneinander unterschieden entsprechend ihrer anatomischen Verteilung in the Gehirn. Laser Mikrodissektion auf dünnen Gehirnschnitte angewendet bietet eine geeignete Option für spezifische Isolierung von Zellen mit hoher räumlicher Auflösung ^6-8. Eine Hauptbeschränkung von LCM wurde die Notwendigkeit, Zellen von Interesse, basierend auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierenden Reporterproteine ​​genetisch in Tiermodellen entwickelt identifizieren. Die Entwicklung neuer Techniken, um schnell Immunomarkierung Methoden, die RNA-Integrität bewahrt, in Kombination mit LCM durchzuführen, erlaubt nun die Isolierung von Zellpopulationen mit Gen-Profiling-Experimente fort.

Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Publikationen ^1,9-13 beschrieben. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren zu hochwertigen RNA von einer bestimmten Untergruppe von Zellen in einer komplexen Gewebestruktur durch Kombinieren schnellen Immunmarkierung mit LCM erhalten. Wir zeigen, wie die wichtigsten kritischen Schritte durchführen, um eine maximale RNA-Gewinnung zu erhalten und zu vermeiden RNA-Abbau wie es siglich Auswirkungen Genexpressionsanalysen.

Zur Demonstration dieses Protokoll wurden dopaminergen Neuronen von einem Tag alten Maushirn abgezielt. Dopaminergen Neuronen kann mit Hilfe eines gegen Tyrosinhydroxylase (TH) gerichteten Antikörpers, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms für Dopaminsynthese immunolabeled werden. Nach TH Immunfärbung können einzelne oder Gruppen von dopaminergen Neuronen dann mit LCM isoliert werden. Mikrodissezierten Zellen werden in Lysepuffer gesammelt und RNA wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit extrahiert. Qualität und Quantität der RNA extrahiert werden mit einem Bioanalyzer ⁵ gemessen. Die weitere Analyse der Genexpression mit: RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR kann anschließend durchgeführt ^2,4,6 werden. Als ein Beispiel wird ein zweistufiger qRT-PCR von den Laser erfassten isolierten dopaminergen Domänen gezeigt. Die relative Quantifizierung der Expressionsniveaus von zwei dopaminergen Neurons Markergene zeigt die Selektivität dieses Protokolls.

Protokoll

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Université Laval Tierschutzkommission genehmigt.

1. Probenvorbereitung

HINWEIS: In diesem Beispiel haben wir Mäusegehirnen bei postnatalen Tag 1.

1. Verwenden Hypothermie Anästhesie in zerstoßenem Eis für 3 bis 4 Minuten für Welpen, dann zerlegen Gehirn so schnell wie möglich in eiskaltem L15 Medium. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 2 min.
2. Über seziert Gehirn in das Einbetten (Liste von Gütern vgl.) Form und füllen mit gefrorenen Gewebeeinbettungsmedien darauf achten, dass die Probe in der gewünschten Position zu orientieren. Frieren Proben sofort in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 30 Sekunden.
   HINWEIS: Die Proben können einige Monate gelagert werden, ohne die RNA-Qualität.

2. Schnitte

1. Treat Membran coated Glasobjektträger (vgl. Liste der Material) mit Oberflächen RNAse Dekontaminationslösung, um jede Spur von RNAsen zu beseitigen. Waschen Sie die Folien in DEPC-Wasser und trocknen lassen. Alternativ backen Plättchen über Nacht bei 200 ° C.
2. Übertragen Sie eingefrorenen Proben in einem Kryostaten zuvor mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung gereinigt. Stellen Kryostatkammer Temperatur bei -20 ° C und in Scheiben schneiden Proben bei 10 & mgr; m Dicke. Sammeln Gewebeschnitte auf die Membran beschichteten Objektträgern und trocknen lassen 10 Minuten vor der Färbung. Alternativ gleitet bei -80 ° C bis zur Färbung.

3. Herstellung von Färbelösungen

1. Bereiten alle Lösungen unmittelbar vor dem Beginn des Experiments, und mit RNAse Inhibitor in allen Färbelösungen (außer Waschlösungen), um RNA-Abbau zu verhindern.
2. Bereiten Sie die Pufferlösung. Verwenden des gleichen Puffers in allen Lösungen (RNase-freies Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS besteht) von 1% BSA ergänzt war,0,2% Triton und 2% RNAse-Inhibitor). Für jede Folie, bereiten 400 ul Pufferlösung (200 ul für den primären und 200 ul für die Sekundärantikörper).
3. Bereiten Sie die Fixierungslösung: Verwenden Sie 70% Ethanol aufbewahrt bei -20 ° C. Halten der Gewebefixierung Verfahren minimal um eine drastische Verringerung der RNA Extraktionsausbeute zu vermeiden.
   HINWEIS: Alternativ können 95% Ethanol-Lösung von 5% Essigsäure ergänzt war, bei 20 ° C gehalten.
4. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung durch Verdünnen des primären Antikörpers in der Pufferlösung. Für dopaminergen Neuronen Kennzeichnung, verwenden Sie ein Antikörper, der auf die Tyrosin-Hydroxylase (TH, geschwindigkeitsbestimmende Enzym für Dopamin-Produktion). Mit einer hohen Konzentration des Antikörpers, um für die schnelle Inkubationszeit kompensieren. Verwenden TH-Antikörper in einer Verdünnung von 1:25.
   HINWEIS: Im normalen Immunfluoreszenz-Protokoll, diese Antikörper gibt ein starkes Signal, wenn über Nacht bei einer Verdünnung von 1: 1000. In diesem Protokoll wird es verwendet, 40x Konzentrataufgrund der kurzen Inkubationszeit ed. Aufgrund der hohen Konzentration des Antikörpers für dieses Verfahren verwendet, führen Sie eine Standard-Immunfärbung parallel, um jede Zunahme der nicht-spezifische Markierung überprüfen.
5. Vorbereiten des sekundären Antikörperlösung durch Verdünnung des sekundären Antikörpers in der Pufferlösung. Verwenden eines biotinylierten sekundären Antikörpers in einer Konzentration von 1: 100.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Anti-Kaninchen-Antikörper biotinyliert.
6. Vorbereiten des Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Lösung zum Nachweis von biotinylierten sekundären Antikörper. Make ABC-Lösung durch Zugabe der Verbindung A und der Verbindung B in einer Konzentration von 1: 100 in DEPC PBS verdünnt, ergänzt mit 2% RNAse Inhibitor. Bereiten Sie die Avidin-Biotin-Komplex 30 Minuten, bevor Sie den Folien.

4. Die Färbung

1. Tauen Sie ein oder zwei Folien zu der Zeit von -80 ° C nach schneller schnippte sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Surround Abschnitten mit einer hydrophobenBarriere Stift und lassen Sie für ein paar Sekunden trocknen.
   1. Die Objektträger in der kalten Fixierungslösung für nicht mehr als 5 min bei -20 ° C. Einmal schütteln, in der Luft, um mehr als Fixierungslösung anschließend in DEPC PBS 6-8 mal zum Waschen entfernen, schnell die Objektträger.
   2. Streichen Sie die Folien, um überschüssige DEPC PBS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten.
2. Objektträger auf eine saubere Schale (mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt, um jede Spur von RNAsen beseitigen) und setzte 200 ul des primären Antikörperlösung auf jeder Folie (Kaninchen-Anti-TH) für 10 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und Flick die Folien einmal, um den Überschuss an DEPC PBS zu entfernen.
3. Setzen 200 ul des sekundären Antikörperlösung auf jedem Objektträger 6 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell 3 mal in DEPC PBS zum Waschen und Flick die Folien, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen.
4. Setzen Sie 200 ul der ABC Lösungention auf jedem Objektträger für 4 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal für das Waschen und die Folien blättern, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen.
5. Bereiten Sie die DAB (3,3 'Diaminobenzidin) Lösung während der 4 min Inkubation in der ABC-Lösung. Verwenden Sie die Reagenzien im Kit (DAB Peroxidasesubstrat Kit) zur Verfügung gestellt. Mix 1 Tropfen vorgesehen Puffer, 1 Tropfen DAB-Lösung und 1 Tropfen 30% H ₂ O ₂ in 2,5 ml DEPC-Wasser. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen.
6. Nehmen Sie 196 ul der DAB-Lösung und fügen Sie 4 ul (2%) von RNAse Inhibitor-Lösung kurz vor Aufbringen auf Objektträger. Die Objektträger auf einer sauberen Schale (mit einer Fläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt) und legte die 200 ul der DAB-Lösung auf den Objektträgern.
   HINWEIS: DAB-Lösung sollte within1 oder 2 min reagieren.
7. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und legte Folien für einige Sekunden in absolutem Ethanol. Trocknen Sie die Folien durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse).
   Hinweis: Folien können bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gelagert oder für LCM verarbeitet werden.

5. Laser Capture Mikrodissektion

1. Tauen Sie gleitet schnell durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten.
2. Fahren Sie mit LCM. Den Objektträger unter dem Mikroskop mit Blick auf das Sammelrohr Kappe der Probenseite. Wählen die beste Vergrößerung für die Probe. Stellen Sie den Fokus, um die Zellen von Interesse zu sehen.
   1. Legen Sie den Schnittbereich und fang an zu schneiden mit dem Laser. Sammeln seziert Zellen oder Gewebestück in der Sammelrohrkappe mit 50 ul Lysepuffer (von RNA-Extraktions-Kits) gefüllt. Sicherzustellen, dass der Schritt des LCM ist 30 min nicht übersteigt.
3. Auszug Gesamt-RNA aus Zellen isoliert unter Verwendung einer RNA-Extraktions-Kits (vgl. Liste der Materialien). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
   1. Inkubieren gesammelten Zellen für 30 min bei 42 ° C zuLyse der Zellen. Voraussetzung der RNA Reinigungskolonne durch Zugabe von 250 ul der Konditionierungspuffer. Last 50 ul Ethanol zu lysierten Zellen. Laden Sie die 100 ul der lysierten Zellen auf eine vorkonditionierte Reinigungssäule.
   2. Zentrifugieren Sie die Spalte bei 16.000 g für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Zweimal Die Säule wird mit Waschpuffer. Eluieren in der minimal empfohlenen Volumen (11 ul) von RNase-freies Wasser (nicht behandelt DEPC wie es mit dem Bioanalyzer stören). Halten Sie 2 ul Testqualität.
      HINWEIS: Alle Lösungen und Reagenzien sind im Kit enthalten.

6. cDNA Synthese und Quantitative RT-PCR

1. Reverse Transkription und RNA-Proben aus dem Laser eingefangen dopaminergen Zellen in komplementäre DNA mittels reverser Transkriptase und Oligo (dT). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers (vgl. Liste von Material).
2. Verwenden 1 ul cDNA für qRT-PCR-Amplifikation mit genspezifischen Primern. Richten PCR reactions in 20 ul Volumen mit einer einkomponentigen Heißstartreaktionsmischung für quantitative PCR, wie vom Hersteller empfohlen. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung.
   1. Für die hier beschriebenen Experimente, die folgenden Primerpaare: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT GGG CAG ACA CAC G-3'); AADC-F (5'-CAT AGC GAG TTC TGC CCT TC-3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT CCC TGT CAG AG-3').
3. Führen quantitative RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Rapid Cycling-Parameter: 95 ° C für 5 min, gefolgt von 45 Zyklen von 10 sec 95 ° C, 10 sec bei 60 ° C und 10 sec bei 72 ° C. Führen Schmelzkurvenanalyse mit dem Standard-Einstellung des Instruments auf Bestimne homogene Produktbildung.
4. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der integrierten Software.
   1. Normalisierung der Expressionswerte DA Marker Gene Th und AADC mit der Expression der beiden Referenzgenen GAPDH und Rpl13a um relative Expressionsniveaus zu erhalten, wie zuvor beschrieben ^14.

Ergebnisse

Diese schnelle Immunomarkierung Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Zellen von Interesse während RNA Integrität. 1 veranschaulicht die Schritte der Gewebeaufbereitung vor RNA-Extraktion. Nach Kryoschneiden werden dopaminergen Neuronen mit einem gegen die Tyrosin-Hydroxylase gerichteten Antikörper (markierten Neuronen in braun angezeigt) gekennzeichnet. Je nach der experimentellen Frage, können einzelne Zellen oder größere Region von Interesse mit LCM isoliert werden (1D -...

Diskussion

Der kritischste Punkt dieses Verfahrens besteht darin, die Markierung von Zellen von Interesse, während verhindert RNA-Abbau. Wie RNAsen in wässrigen Lösungen aktiv sind, abnehm Inkubationszeiten verbessert RNA Erhaltung ^11,15. Alle verwendeten Lösungen müssen mit DEPC, um RNasen zu inaktivieren behandelt werden. Alle Materialien und Oberflächen benötigen, um mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung zu RNAsen Kontamination zu verhindern behandelt werden. Schließlich wird in diesen Bedingung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR