Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Resumen

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Resumen

Rata adulta y células humanas de la médula espinal neurales madre / progenitoras (NSPCs) cultivadas en medio enriquecido factor de crecimiento permite la proliferación de, y células madre neurales expandibles auto-renovación multipotentes. En condiciones de suero, estas NSPCs multipotentes se diferenciarán, generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El tejido recogido se disocia enzimáticamente en una solución de papaína-EDTA y luego disociado mecánicamente y se separa a través de un gradiente de densidad discontinuo para producir una única suspensión celular que se sembró en medio neurobasal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF ), y heparina. Rata adulta NSPCs médula espinal se cultivan como neuroesferas que flotan libremente y adultos NSPCs médula espinal humanos se cultivan como cultivos adherentes. En estas condiciones, NSPCs de la médula espinal del adulto proliferan, marcadores expresas de células precursoras, y se pueden ampliar de forma continua durante el paso. Estas células pueden abe estudió in vitro en respuesta a diversos estímulos, y los factores exógenos puede ser utilizado para promover restricción linaje neural para examinar la diferenciación de células madre. Multipotentes NSPCs o su progenie también pueden ser trasplantadas en diversos modelos animales para evaluar la reparación regenerativa.

Introducción

NSPCs son células multipotentes comprometidas con el linaje neuronal que puede auto renovar y ampliar fácilmente in vitro. Nos referimos a estas células como una población mixta de células madre / progenitoras neurales ya que presentan propiedades de las células madre multipotentes auto-renovación y progenitores más restringidas. NSPCs se encuentran tanto en el cerebro fetal y adulto y la médula espinal ^1,2. En el adulto, NSPCs son normalmente quiescente y residen en nichos específicos, incluyendo la zona subventricular recubre los ventrículos laterales ^2-4, y la región periventricular que rodea el canal central de la médula espinal ^5,6.

Típicamente, NSPCs se cultivan como neuroesferas flotantes o monocapas como adherentes en medio libre de suero suplementado con EGF y bFGF, mitógenos que seleccionan para las poblaciones de células madre / progenitoras. El ensayo neuroesfera desarrollado originalmente por Reynolds y Weiss ^2, se usa más comúnmente para la cultura y laexpandir las células madre neurales. NSPCs muestran multipotencia cuando se sembraron en medio que contiene suero factor libre crecimiento, diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Multipotentes, NSPCs auto-renovación pueden ser aisladas y cultivadas a partir de la roedor adulto de la médula espinal cuando el tejido cultivado incluye regiones del canal central ^6,7. Una ventaja potencial en el uso de NSPCs generados a partir de la médula espinal adulta en oposición a la generación de células de otras regiones es que estas células específicas de tejido se asemejan más estrechamente células en la médula espinal que se pierde o se daña después de una lesión o enfermedad.

Trabajo previo mostró que neuroesferas derivadas de la médula espinal adulta humana no podrían ser propagadas a largo plazo o pases para generar un número suficiente de células ^8,9. Sin embargo, con modificaciones en las condiciones de cultivo, se informó de la expansión y el trasplante de médula NSPCs derivadas de la médula humanos adultos, lo que demuestra que la auto-renovacióny NSPCs multipotentes se pueden aislar de la médula espinal adulto humano de donantes de trasplante de órganos ^10. En primer lugar, la eliminación de la mayor parte de la materia blanca durante la disección y el cultivo de estas células sobre un sustrato adherente en un medio enriquecido con factor de crecimiento seleccionado para la proliferación de la médula espinal NSPCs adultos humanos. En este protocolo se describe la recolección de la médula espinal de rata adulta y de donantes humanos de trasplante de órganos, la disección del tejido periventricular, y el aislamiento, cultivo y expansión de NSPCs.

Protocolo

Todos los animales procedimientos son aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network, Toronto ON Canadá, de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales preparados por el Consejo Canadiense de los Animales. Para la recolección de tejido de la médula espinal humana, la aprobación se obtuvo de la Junta Ética de la Investigación Red de Salud de la Universidad y de la Trillium-regalo de la Fundación Vida, que supervisa la donación de órganos en Ontario, Canadá.

1. Preparación de Disección Los tampones y medios de cultivo

1. Para el aislamiento de médula espinal de ratas, preparar 100 ml de tampón de disección (1x PBS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar. Para la médula espinal humana preparar 100 ml de tampón de disección (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar.
2. Preparar medio 100 ml sin suero (SFM) y caliente a 37 ° C. Para preparar el MFS, agregue 2 mM L-glutamina, 100 g / ml de penicilina-estreptomicina, 2% B27, y 10% de la mezcla hormona para Neurobasal-A medio. Para preparar la mezcla de hormonas, hacer una 1: media / F12 1 DMEM que contenía 0,6% de glucosa, 3 mM NaHCO _3, 5 mM HEPES, 25 mg / ml de insulina, 100 g / ml apo-transferrina, 10 mM de putrescina, 30 nM selenio, y 20 nM de progesterona.
3. Preparar el factor enriquecido medios chapado crecimiento EFH (a SFM añadir 20 ng / ml de EGF, 20 ng / ml de bFGF, y 2 mg / ml de heparina) y caliente a 37 ° C. Asegúrese de que EFH humana contiene factores de crecimiento recombinantes humanos (véase la Tabla de Materiales).

2. Recolección y Disección de adulto Rata periventricular Tejido de la médula espinal

1. Esterilizar los instrumentos de disección en etanol y enjuague con solución salina estéril, o instrumentos de autoclave con antelación. Dar de rata (6 - 8 semanas de edad) una inyección letal de pentobarbital de sodio (1 cc a 65 mg / ml) o sobredosis de anestésico (es decir, 4% isofluorano) según una de institución aprobó el protocolo animal. Douse la parte trasera de la rata con 70% de etanol y quitar la piel en la superficie dorsal con grandes tijeras de disección.
2. Sosteniendo las tijeras perpendiculares a la superficie dorsal, transversalmente cortar la columna vertebral por encima de las extremidades posteriores. Con unas tijeras pequeñas para cortar longitudinalmente el músculo dorsal que recubre la columna vertebral en una dirección rostral para exponer las apófisis espinosas.
3. Comenzando en el extremo caudal expuesta, inserte gubia o un instrumento pequeño hueso de corte romo extradurally en la cara lateral del canal espinal en el espacio entre la médula espinal y la columna vertebral. Hacer pequeños cortes en la lámina (arcos óseos izquierdo y derecho de las apófisis espinosas en cada lado de las vértebras) y cuidadosamente retire la lámina para exponer la médula espinal (Figura 1A-D). Asegúrese de que el ángulo de las palas es poco profunda y paralela a la cuerda de modo que la médula espinal subyacente no está dañado.
4. Continuar laminectomía en dirección rostral a expose la médula espinal torácica y cervical.
5. Escindir suavemente la espina dorsal de la columna vertebral con pinzas de tejido contundentes y uso microtijeras para cortar cuidadosamente las raíces para liberar el cable. Coloque la médula espinal extirpado en una placa de Petri que contiene 4 ° C tampón de disección estéril rata (descrito más arriba en 1.1). Enjuague el tejido en 4 ° C tampón de disección recién preparados y con unas tijeras cortar la médula espinal transversalmente en segmentos de 1 cm (Figura 1E).
6. Para cada segmento de tejido, utilice una mano para sujetar el tejido con unas pinzas finas. Con la otra mano, use microtijeras para eliminar cuidadosamente las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayor parte de la materia gris, con la ayuda de un microscopio de disección. Alternativamente, utilizar unas pinzas finas (Dumont # 4) a despegarse la mayor parte de la materia gris y blanca, dejando sólo la región periventricular de la médula espinal que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante (Figura 1F-H).
7. En común el tejido periventricular diseccionado en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección rata frío.

3. Recolección y Disección de adulto periventricular humano Tejido de la médula espinal

Nota: el tejido de la médula espinal humana se cosecha de donantes de trasplante de órganos adultos (donantes con edades de 2 a 60 años de edad) después de que los otros órganos se han eliminado para el trasplante de órganos. El Trillium-Regalo del Programa Vida obtiene el consentimiento para la extracción de tejido con fines de investigación de la familia del paciente y notifica a nuestro equipo de recolección en el momento oportuno de tal manera que hemos sido capaces de cosechar las cuerdas dentro de 2 horas de pinzamiento aórtico. Se aceptan donantes adultos masculinos y femeninos con serología negativa y no hay infecciones.

1. Tejido de cosecha de una manera estéril en el quirófano a través de un abordaje anterior usando la misma exposición anterior ya diseccionado para la extracción de órganos por el órgano Transpequipo de recolección lant.
2. Exponer la columna vertebral anterior a través de la retracción con grandes esparcidores de costillas y grandes retractores de pádel de los tejidos y órganos que quedan incluidos los grandes vasos sanguíneos.
3. Use una sierra esternal montado con una larga hoja para cortar a través de los discos intervertebrales en los extremos rostral y caudal de la longitud deseada de la columna vertebral a ser resecado. Ángulo de la sierra cerca de 45 ° en sentido medial para cortar un canal triangular de la parte lateral de los cuerpos vertebrales de detención justo en el canal espinal.
4. Eliminar en bloque los aspectos mediales de los cuerpos vertebrales de los segmentos deseados con la ayuda de osteotomos curvos y mazo teniendo cuidado de evitar el corte a través de la duramadre. A continuación, levante suavemente la dura cubierta de la médula espinal con pinzas dentadas y agudamente incidir los extremos rostral y caudal de la médula. Use las tijeras largas y fórceps para seccionar bilateralmente las raíces individuales.
5. Coloque el segmento escindido de la médula espinal en 4 °; C tampón estéril (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) en un tubo de ensayo grande para el transporte a la sala de cultivo de tejidos.


6. Nota: Por lo general, un 3 - segmento de 6 cm de la médula espinal de la columna torácica superior y / o media-baja nivel torácico se retira de la sala de operaciones bajo condiciones estériles, tan pronto como sea posible después de la interrupción de la circulación y se colocaron en tampón estéril fría . El tiempo transcurrido entre el cese de la circulación y la eliminación de la médula espinal varía con el tiempo requerido para cosechar los órganos específicos para la donación y ha oscilado entre 45 min a 2 horas. Si también se han eliminado el corazón y los pulmones, la disección puede ser tomado lejos rostral para cosechar una porción de la médula cervical inferior, así.
7. Diseccionar el tejido de la médula espinal humana tan pronto como sea posible después de la cosecha, generalmente dentro de 3 hrs. Retire la duramadre y otros meninges con fórceps. Enjuague el tejido de la médula espinal en recién hecho 4 ° C y tampón de diseccióncortar transversalmente en segmentos de 1 cm.
8. Con la ayuda de un microscopio de disección, extirpar las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayoría de la materia gris utilizando pinzas de tejido, unas pinzas finas y microtijeras para cada segmento de tejido. En común el tejido diseccionado periventricular, que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante, en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección humana frío.

4. Aislamiento y cultivo de adulto Rata y NSPCs Médula Espinal Humanos

1. Realice los siguientes pasos asépticamente en una campana de flujo laminar.
   1. Picar la rata disecada o tejido periventricular humano en 1 mm ³ piezas con micro tijeras.
   2. Enzimáticamente disociar el tejido picado con enzimas proteolíticas utilizando el kit de la disociación de papaína como se indica en la tabla de materiales / reactivos. Nota: Los componentes reactivos incluyen 4 viales; Vial 1: solución salina equilibrada de Earle (EBSS), Vial 2: containin papaínag L-cisteína y EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNasa), Vial 4: inhibidor de la proteasa ovomucoide con albúmina de suero bovino (BSA).
      Nota: Nota: La papaína es una proteasa sulfhidrilo que tiene amplia especificidad de sustratos proteicos. La papaína en el presente documento se deriva a partir del látex de la planta de Carica papaya y degrada la mayoría de los sustratos de proteína más ampliamente que las proteasas pancreáticas. Durante el proceso de disociación hay algún daño celular causando ADN para ser liberado en el medio de disociación que aumentará la viscosidad y hacer pipeteando difícil. Por lo tanto, la ADNasa se incluye en el procedimiento de aislamiento de células para digerir el ADN sin dañar las células intactas. Ovomucoides se glicoproteína inhibidores de la proteasa utilizados para inhibir la actividad de papaína después de la etapa de disociación.
2. En el primer uso, reconstituir la mezcla de inhibidor de ovomucoide albúmina (vial 4) con 32 ml de EBSS (vial 1), y luego almacenar a 4 ° C y el uso para aislamientos posteriores.Nota: Esto produce una solución a una concentración eficaz de 10 mg de inhibidor de ovomucoide y 10 mg de albúmina por ml.
3. Añadir 5 ml de EBSS (vial 1) a un vial de papaína (vial 2), produciendo una solución en 20 unidades de papaína / ml en 1 mM de L-cisteína con EDTA 0,5 mM. Compruebe que la solución de papaína parece claro cuando está completamente disuelto, si no colocar el frasco en un 37 ° C baño de agua durante diez minutos hasta que la papaína se disuelva por completo para garantizar la plena actividad de la enzima.
4. Añadir 500 l de EBSS (vial 1) a un vial de DNasa (vial 3) y mezclar suavemente como DNasa es sensible a la cizalla desnaturalización. Añadir 250 l de la solución de DNasa al vial que contiene la papaína, resultando en una concentración final de aproximadamente 20 unidades / ml de papaína y 0,005% de DNasa. Guardar el saldo de la DNasa vial para su uso posterior.
5. Coloque la rata picada o tejido humano en la solución de papaína como se ha preparado en el paso 4.4 anteriormente. Para el aislamiento de tejido humano, dividir el tejido picado por igual entre dosviales de papaína (aproximadamente 0,2 g / vial).
6. Incubar a 37 ° C con agitación constante en una plataforma basculante para disociar el tejido en la solución de papaína activada. Incubar el tejido de rata durante 45 min a 1 hr, y el tejido humano durante 1 a 2 horas, dependiendo de la cantidad de tejido picado, sobre desde 0,2 hasta 0,4 g respectivamente.
7. Se tritura la mezcla con una pipeta de 10 ml para disociar cualquier piezas de tejido restantes para producir una suspensión de células nublado. Transferir la suspensión celular (no incluyen piezas de tejido no disociado) en un tubo cónico de 15 ml estéril y se centrifuga a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Resuspender las células sedimentadas en medio que contiene ovomucoide, un inhibidor de la papaína.
   1. Preparar la solución de ovomucoide mediante la mezcla de 2,7 ml EBSS (vial 1) con 300 l de la solución de inhibidor-albúmina ovomucoide reconstituido (vial 4) en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 150 l de solución de DNasa (vial 3) guardados en el paso 4.4 anterior.
   2. Descartar el sobrenadante delas células sedimentadas y de inmediato volver a suspender el sedimento celular en la mezcla de albúmina-inhibidor de ADNasa diluida.
9. Células intactas separados de las membranas celulares por centrifugación a través de un gradiente de densidad discontinuo solo paso.
   1. Prepare el gradiente de densidad discontinuo mediante la adición de 5 ml de solución de albúmina-inhibidor (vial 4) a un tubo de 15 ml, y usando una pipeta de 5 ml, con suavidad y la capa lentamente la suspensión de células (preparado como se describe anteriormente en la etapa 4.8) en la parte superior de la solución de albúmina-inhibidor.
   2. Centrifugar a 70 xg durante 6 min a TA.
   3. Nota: La interfaz entre las dos capas de la gradiente debe ser claramente visible, aunque mezcla mínima en este límite no afecta el resultado. Fragmentos de membrana permanecen en la interfase y células disociadas de pellets en la parte inferior del tubo.
10. Para células de rata, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 1 ml de rata medio EFH (pre-calentado a 37 ° C).Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células / l en EFH. El rendimiento típico de las células a partir de tejido de rata es de aproximadamente 2 x 10 ⁶ células con aproximadamente el 80% viability.If cultivos clonales se desea, las células de semillas a una densidad de menos de 10 células / mL. Incubar los matraces a 37 ° C en 5% de CO ₂ y permiten que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana para evitar la agregación de las esferas.
11. Para células humanas, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio de EFH humano (pre-calentado a 37 ° C). Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras nylon siguió con 30 ml de EFH para eliminar los fragmentos de mielina y de la membrana celular. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH.
12. Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células humanas en placas de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 10 ⁵ células / pocillo en un volumen totalde 5 ml EFH / pocillo. El rendimiento típico de las células de tejido humano es de aproximadamente 1 x 10 ⁶ células con aproximadamente el 70% de viabilidad. Pozos pre-capa con un sustrato adherente como Matrigel (ver nota abajo). Diluir en una proporción de 40 l Matrigel: 1 ml SFM.
13. Nota: Como alternativa, se pueden utilizar otros sustratos adherentes tales como poli-D-lisina / laminina, fibronectina, o colágeno.
14. Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO ₂ y permitir que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana.

5. pases de rata adulta y NSPCs médula espinal humanos

1. NSPCs Rat formarán pequeños neuroesferas aproximadamente 70 micras de diámetro dentro de 1 semana de siembra inicial; NSPCs rata pasaje semanales mediante la recopilación de la suspensión celular, centrifugación a 300 xg durante 5 min, y triturando mecánicamente el sedimento de células para disociar las neuroesferas.
2. Semilla las células disociadas en matraces T25 que contienen rata fresca medio EFH. Alternativamente,utilizar 50% de medio acondicionado de rata para los pases. El rendimiento típico de NSPCs rata en pases es de unos 5 x 10 ⁶ células que aumenta exponencialmente con el número de pases.
3. Para los cultivos humanos, una semana después del recubrimiento inicial, reemplace la mitad del medio de cultivo fresco con EFH dos veces por semana para permitir que las células se adhieran al sustrato. Generalmente, 1 - 2 semanas más tarde una vez que las células se han unido al sustrato, reemplazar todo el volumen de medio de cultivo dos veces a la semana con EFH fresco.
4. Células subcultura antes de llegar a la confluencia entre 4-8 semanas.
   1. Células de subcultivo separando las células del sustrato enzimáticamente (véase la Tabla de Materiales) con 2 ml de enzima por pocillo se incubó durante aproximadamente 10 min a 37 ° C. Recoger suspensión de células, centrifugar a 300 xg durante 5 min, y resuspender suavemente el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH recién hecho.
   2. Contar las células vivas con un hemocitómetro y placa las células en placas de cultivo de 6 pocillos (pre-coado como anteriormente en la etapa 4.12) a una densidad de 10 ⁵ células / pocillo en un volumen total de 5 ml de HEP / pocillo. El rendimiento típico de NSPCs humanos en pases es de aproximadamente 2 x 10 ⁶ células y en general este será el doble con el pasaje. En general, mantener los cultivos con 50% de medio acondicionado EFH 2 - 3 veces por semana entre pases.

Resultados

Las células de la médula espinal de ratas adultas cultivadas en cultivo en suspensión en un medio EFH formarán pequeños neuroesferas (colonias de células indiferenciadas) dentro de 1 semana de chapado inicial. En cultivos primarios, la mayoría de las células sembradas morirán y las células madre de factor de respuesta de crecimiento se proliferan y se seleccionan en el medio EFH. Por el paso 3, habrá numerosos neuroesferas que flotan libremente alrededor de 100 micras de diámetro (Figura 2A).

Discusión

Durante la disección de la médula espinal de ratas cuidado el tejido se debe tomar para no dañar la médula espinal en el desempeño de la laminectomía. Es más fácil de aislar el tejido periventricular cuando los segmentos de la médula espinal están intactos. Los segmentos de tejido deben sumergirse plenamente en el tampón de disección y las meninges que recubren y la materia blanca se pueden cortar a medida que tiras longitudinales con micro tijeras. Alternativamente, fórceps de tejidos finos se pueden utili...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM