Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Riepilogo

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Abstract

Ratto adulto e del midollo spinale cellule neurali staminali / progenitrici umane (NSPCs) coltivate in crescita a medio fattore arricchito consente la proliferazione di multipotenti, e le cellule staminali neurali espandibili auto-rinnovamento. In condizioni di siero, questi NSPCs multipotenti si differenziano, generando neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Il tessuto raccolto viene enzimaticamente dissociato in una soluzione di papaina-EDTA e poi dissociato meccanicamente e separati mediante un gradiente di densità discontinuo per produrre una sospensione di cellule singole che è placcato in medium Neurobasal supplementato con fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF ), ed eparina. Ratto adulto NSPCs midollo spinale sono coltivate come neurosfere libero di fluttuare e adulti NSPCs midollo spinale umano vengono coltivate come le culture aderenti. In queste condizioni, per adulti NSPCs midollo spinale proliferano, i marcatori espressi di cellule precursori, e possono essere continuamente ampliati al passaggio. Queste cellule possono be studiato in vitro in risposta a vari stimoli, e fattori esogeni può essere usato per promuovere restrizione lineage esaminare neurali differenziazione delle cellule staminali. Multipotenti NSPCs o loro discendenti possono essere trapiantate in vari modelli animali per valutare riparazione rigenerativa.

Introduzione

NSPCs sono cellule multipotenti impegnate per il lignaggio neurale che possono auto rinnovarsi e facilmente espandere in vitro. Ci riferiamo a queste cellule come una popolazione mista di cellule staminali / progenitrici neurali dal momento che espongono proprietà delle cellule staminali multipotenti auto-rinnovamento e progenitori più ristretti. NSPCs si trovano sia nel cervello fetale e adulto e il midollo spinale ^1,2. Nell'adulto, NSPCs sono normalmente quiescenti e di soggiornare all'interno di nicchie specifiche, tra cui la zona subventricolare rivestimento dei ventricoli laterali ^2-4, e la regione periventricolare che circonda il canale centrale del ^5,6 del midollo spinale.

In genere, NSPCs sono coltivate come neurosfere fluttuanti o monostrato come aderenti in mezzo privo di siero integrato con EGF e bFGF, mitogeni che selezionano per le popolazioni di cellule staminali / progenitrici. Il saggio neurosfere originariamente sviluppato da Reynolds e Weiss ^2, è più comunemente usato per la cultura eespandere le cellule staminali neurali. NSPCs mostrano multipotenza quando sono placcati in siero terreno contenente senza fattore di crescita, differenziarsi in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Multipotenti, NSPCs auto-rinnovamento possono essere isolate e coltivate da roditore midollo spinale adulto quando il tessuto coltivato comprende le regioni del canale centrale ^6,7. Un potenziale vantaggio nell'utilizzo NSPCs generati dal midollo spinale adulto al contrario di generare cellule da altre regioni è che queste cellule tessuto-specifiche più simili cellule del midollo spinale che sono perso o danneggiato seguenti infortunio o malattia.

Lavoro precedente ha mostrato che neurosfere derivate dal midollo spinale adulto umano non vengano estese a lungo termine o diversi passaggi per generare un numero sufficiente di cellule ^8,9. Tuttavia, con modificazioni in condizioni di coltura, abbiamo riportato l'espansione e trapianto di midollo NSPCs derivati ​​da spinale umani adulti, dimostrando che l'auto-rinnovamentoe NSPCs multipotenti possono essere isolate dal midollo spinale adulto umano dei donatori di trapianto di organi ^10. Principalmente, la rimozione della maggior parte della sostanza bianca durante la dissezione e coltura di tali cellule su un substrato aderente in crescita a medio fattore arricchito selezionato per proliferanti adulti NSPCs midollo spinale umano. In questo protocollo si descrive la raccolta del midollo spinale di ratto adulto e da donatori umani di trapianto di organi, la dissezione dei tessuti periventricolare, e l'isolamento, la cultura e l'espansione di NSPCs.

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono approvati dal Comitato cura degli animali della University Health Network, Toronto ON Canada, in conformità con le politiche stabilite nella Guida per la cura e l'uso degli animali sperimentali predisposti dal Consiglio canadese cura degli animali. Per la raccolta di tessuto del midollo spinale umano, l'approvazione è stata ottenuta dal Research Ethics Consiglio University Health Network e dal Trillium Gift of-Life Foundation che sovrintende la donazione di organi in Ontario, Canada.

1. Preparazione di dissezione buffer e cultura dei media

1. Per l'isolamento di topo midollo spinale, la preparazione di 100 ml di buffer dissezione (1x PBS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero. Per midollo spinale umano preparare 100 ml di tampone di dissezione (1x HBSS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero.
2. Preparare 100 ml di mezzo privo di siero (SFM) e calda a 37 ° C. Per preparare SFM, aggiungere 2 mM L-glutammina, 100 mg / ml di penicillina-streptomicina, 2% B27, e il 10% della miscela ormone Neurobasal-A medio. Per preparare mix ormonale, fare un 1: medio / F12 1 DMEM contenente 0,6% di glucosio, 3 NaHCO mm _3, 5 mM HEPES, 25 mg / ml di insulina, 100 mg / ml apo-transferrina, 10 micron putrescina, 30 nm selenio, e 20 nM progesterone.
3. Preparare la crescita EFH fattore arricchita di placcatura dei media (a SFM aggiungere 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, e 2 mg / ml di eparina) e calda a 37 ° C. Assicurarsi che EFH umano contiene fattori di crescita ricombinante umano (vedi Tabella dei Materiali).

2. La raccolta e la dissezione di Adult Rat periventricolare midollo spinale Tissue

1. Sterilizzare strumenti sezionare in etanolo e risciacquare in soluzione fisiologica sterile, o strumenti autoclave in anticipo. Dare rat (6-8 settimane) una iniezione letale di pentobarbital di sodio (1 cc a 65 mg / ml) o overdose di anestetico (vale a dire, il 4% isofluorane) secondo una dell'ente approvato protocollo animale. Douse parte posteriore del ratto con 70% etanolo e rimuovere la pelle sulla superficie dorsale con grandi forbici dissezione.
2. Tenendo le forbici perpendicolari alla superficie dorsale, trasversalmente tagliare la colonna vertebrale sopra arti posteriori. Usare le forbici piccole per longitudinalmente tagliare il muscolo dorsale sovrastante la colonna vertebrale in una direzione rostrale per esporre i processi spinosi.
3. A partire dalla fine caudale esposta, inserire rongeurs o un piccolo strumento osso-taglio smussato extradurally nella parte laterale del canale spinale nello spazio tra il midollo spinale e la colonna vertebrale. Fare piccoli tagli nella lamina (archi ossee a destra ea sinistra delle apofisi spinose su ogni lato delle vertebre) e con attenzione staccarsi la lamina per esporre il midollo spinale (Figura 1A-D). Verificare l'angolo delle pale è bassa e parallela al cavo in modo che il midollo spinale sottostante non sia danneggiato.
4. Continuare laminectomia in direzione rostrale a fierevia e il midollo spinale toracico e cervicale.
5. Accise delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale, con una pinza di tessuto smussato e uso microscissors per tagliare con attenzione alle radici per rilasciare il cavo. Posizionare il midollo spinale asportato in una capsula di Petri contenente 4 ° C tampone sterile dissezione ratto (descritto in 1.1). Lavare il tessuto in appena preparato 4 ° C tampone dissezione e con le forbici hanno tagliato il midollo spinale trasversalmente in 1 centimetro segmenti (Figura 1E).
6. Per ogni segmento di tessuto, usare una mano per tenere il tessuto con una pinza sottile. Con l'altra mano, utilizzare microscissors per rimuovere con attenzione le meningi sovrastanti, sostanza bianca, e la maggior parte della materia grigia con l'aiuto di un ambito dissezione. In alternativa, utilizzare una pinza sottile (Dumont 4 #) a staccarsi maggior parte della materia grigia e bianca, lasciando solo la regione periventricolare del midollo spinale che comprende la ependyma e una piccola quantità di materia grigia circostante (Figura 1F-H).
7. Pool il tessuto periventricolare sezionato in una capsula di Petri 10 centimetri sterile contenente freddo tampone dissezione ratto.

3. La raccolta e la dissezione di Adult periventricolare umana midollo spinale Tessuto

Nota: il tessuto del midollo spinale umano è raccolto da donatori di trapianto di organi adulti (i donatori avevano un'età compresa 2-60 anni) dopo che gli altri organi sono stati rimossi per il trapianto di organi. Il Trillium Gift of-Life Program ottiene il consenso per la rimozione di tessuto per la ricerca da parte della famiglia del paziente e avvisa il nostro team di raccolta in modo tempestivo in modo che siamo stati in grado di raccogliere le corde entro 2 ore di clampaggio aortico. Si accettano donatori adulti maschili e femminili con sierologia negativa e senza infezioni.

1. Tessuto raccolto in un modo sterile in sala operatoria attraverso un approccio anteriore utilizzando la stessa esposizione anterior già sezionato per la rimozione di organi dal transp organosquadra raccolta lant.
2. Esporre la colonna spinale anteriore attraverso svincolo con grandi crocette costola e grandi divaricatori paddle dei rimanenti tessuti e organi, tra cui i grandi vasi sanguigni.
3. Utilizzare una sega sternale montato con una lunga lama per tagliare i dischi intervertebrali alle estremità rostrale e caudale della lunghezza desiderata della colonna vertebrale, per essere asportato. Angolo della sega circa 45 ° medialmente per tagliare un trogolo triangolare dalla parte laterale dei corpi vertebrali fermandosi poco prima del canale spinale.
4. Togliere in blocco gli aspetti mediali dei corpi vertebrali dei segmenti desiderati con l'ausilio di osteotomi curve e maglio avendo cura di evitare il taglio attraverso la dura. Sollevare delicatamente la dura ricoperta midollo spinale con una pinza dentata e fortemente incidere le estremità rostrale e caudale del cavo. Utilizzare lunghe forbici e pinze per transetto bilateralmente le singole radici.
5. Posizionare il segmento asportato del midollo spinale in 4 °; C tampone sterile (1x HBSS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) in una grande provetta per il trasporto verso la camera di coltura tissutale.


6. Nota: Generalmente, un 3 - segmento 6 cm midollo spinale dal toracico superiore e / o medio-basso livello toracico viene rimosso in sala operatoria in condizioni sterili non appena possibile dopo la cessazione della circolazione e posto in fredda tampone sterile . Il tempo trascorso tra la cessazione della circolazione e la rimozione del midollo spinale varia con il tempo necessario per raccogliere gli organi bersaglio per la donazione e variava da 45 minuti a 2 ore. Se il cuore e polmoni sono anche state rimosse, la dissezione può essere preso lontano rostrally per raccogliere una porzione del midollo cervicale inferiore.
7. Sezionare il tessuto del midollo spinale umano il più presto possibile dopo la raccolta, generalmente entro 3 ore. Rimuovere la dura e altri meningi con una pinza. Sciacquare il tessuto del midollo spinale in appena fatto 4 ° C tampone dissezione etagliate trasversalmente in 1 centimetro segmenti.
8. Con l'aiuto di un ambito dissezione, accise meningi sovrastanti, sostanza bianca, e la maggior parte della materia grigia con pinze dei tessuti, una pinza sottile e microscissors per ogni segmento del tessuto. Pool tessuto periventricolare sezionato, che include il ependima e una piccola quantità di materia grigia circostante, in una piastra di Petri 10 centimetri sterile contenente freddo tampone dissezione umana.

4. L'isolamento e coltura di Adult Rat e NSPCs midollo spinale umano

1. Effettuare le seguenti operazioni asetticamente in una cappa a flusso laminare.
   1. Tritare il ratto sezionato o tessuto periventricolare umana in 1 mm ³ pezzi con microscissors.
   2. Enzimaticamente dissociare il tessuto macinata con enzimi proteolitici utilizzando il kit di dissociazione papaina come indicato nella tabella di materiali / reagenti. Nota: i componenti dei reagenti includono 4 flaconcini; Fiala 1: soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS), Fiala 2: contenent papainag L-cisteina e EDTA, Fiala 3: Deoxyribonuclease I (DNasi), Fiala 4: inibitore della proteasi ovomucoid con albumina sierica bovina (BSA).
      Nota: Nota: La papaina è una proteasi solfidrile che ha un'ampia specificità per i substrati di proteine. La papaina qui è derivato dal lattice dall'impianto papaya Carica e degrada maggior parte dei substrati proteici più esteso rispetto proteasi pancreatiche. Durante il processo di dissociazione c'è qualche danno cellulare del DNA che causano per essere rilasciato nel medium di dissociazione che aumenterà la viscosità e rendere pipettaggio difficile. Così, DNase è inclusa nella procedura di isolamento cellulare per digerire il DNA senza danneggiare le cellule intatte. Ovomucoids sono glicoproteina inibitori della proteasi utilizzati per inibire l'attività papaina dopo la fase di dissociazione.
2. Al primo utilizzo, ricostituire la miscela inibitore albumina ovomucoid (fiala 4) con 32 ml di EBSS (fiala 1), e quindi conservare a 4 ° C e utilizzare per isolamenti successive.Nota: Si ottiene una soluzione ad una concentrazione efficace di 10 mg di inibitore ovomucoid e 10 mg di albumina per ml.
3. Aggiungere 5 ml di EBSS (fiala 1) per una fiala papaina (fiala 2), ottenendo una soluzione a 20 unità di papaina / ml in 1 mM L-cisteina con EDTA 0,5 mm. Verificare che la soluzione papaina appare chiaro quando disciolto completamente, altrimenti posizionare il flacone in un bagno di acqua 37 ° C per dieci minuti fino a quando la papaina è completamente sciolto a garantire la piena attività dell'enzima.
4. Aggiungere 500 ml di EBSS (fiala 1) per una fiala DNasi (fiala 3) e mescolare delicatamente come DNasi è sensibile al taglio denaturazione. Aggiungere 250 microlitri della soluzione di DNasi al flaconcino contenente la papaina, ottenendo una concentrazione finale di circa 20 unità / ml papaina e 0,005% DNasi. Salvare l'equilibrio della fiala DNasi da utilizzare in seguito.
5. Posizionare il ratto macinate o tessuti umani nella soluzione papaina come preparata al precedente punto 4.4. Per l'isolamento tessuto umano, suddividere il tessuto tritato equamente tra duefiale papaina (circa 0,2 g / flacone).
6. Incubare a 37 ° C con agitazione costante su una piattaforma rocker dissociare il tessuto nella soluzione papaina attivato. Incubare tessuti di ratto per 45 minuti a 1 ora, e tessuti umani per 1 a 2 ore a seconda della quantità di tessuto tritato, circa 0,2-0,4 g rispettivamente.
7. Triturare la miscela con una pipetta 10 ml di dissociare eventuali pezzi di tessuto rimanenti per produrre una sospensione cellulare torbida. Trasferire la sospensione cellulare (non includono pezzi di tessuto non dissociato) in una sterile tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Risospendere le cellule pellet in terreno contenente ovomucoid, un inibitore della papaina.
   1. Preparare la soluzione ovomucoid mescolando 2,7 ml EBSS (fiala 1) con 300 ml di soluzione di albumina-inibitore ovomucoid ricostituito (flaconcino 4) in un tubo da 15 ml. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi (fiala 3) salvato in precedente punto 4.4.
   2. Eliminare il surnatante dale cellule pellet e immediatamente risospendere il pellet cellulare nella miscela di albumina-inibitore DNasi diluito.
9. Cellule intatte separati da membrane cellulari mediante centrifugazione attraverso un unico passaggio gradiente di densità discontinuo.
   1. Preparare il gradiente di densità discontinuo aggiungendo 5 ml di soluzione di albumina-inibitore (fiala 4) in una provetta da 15 ml, e utilizzando una pipetta da 5 ml, delicatamente e lentamente strato la sospensione cellulare (preparato come descritto in precedenza al passo 4.8) sopra la soluzione di albumina-inibitore.
   2. Centrifugare a 70 xg per 6 minuti a temperatura ambiente.
   3. Nota: L'interfaccia tra i due strati di gradiente deve essere chiaramente visibile, anche se miscelazione minima in quel punto non influisce sul risultato. Frammenti di membrana rimangono all'interfaccia e cellule dissociate pellet sul fondo della provetta.
10. Per le cellule di ratto, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di ratto EFH media (pre-riscaldato a 37 ° C).Contare densità cellulare in tempo reale con un emocitometro e piastra le cellule in un pallone di coltura T25 ad una densità di 10 cellule / microlitro in EFH. La resa tipica di cellule da tessuto di ratto è di circa 2 x 10 ⁶ cellule con circa il 80% viability.If colture clonali sono desiderati, alveoli con una densità inferiore a 10 cellule / microlitro. Incubare le beute a 37 ° C in 5% CO ₂ e consentire le culture di crescere indisturbata per 1 settimana per evitare l'aggregazione di sfere.
11. Per le cellule umane, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno EFH umana (pre-riscaldato a 37 ° C). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino 40 micron cella nylon seguita con 30 ml di EFH per rimuovere frammenti mielina e membrana cellulare. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di EFH media.
12. Contare densità cellulare in tempo reale con un emocitometro e piastra cellule umane in piastre di coltura da 6 pozzetti ad una densità di 10 ⁵ cellule / pozzetto in un volume totaledi 5 ml EFH / bene. La resa tipica di cellule da tessuto umano è di circa 1 x 10 ⁶ cellule con circa il 70% redditività. Pozzi Pre-coat con un substrato aderenti come Matrigel (vedi nota sotto). Diluire con un rapporto di 40 microlitri Matrigel: 1 ml SFM.
13. Nota: In alternativa, possono essere utilizzati altri substrati aderenti come il poli-D-lisina / laminina, fibronectina o collagene.
14. Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO ₂ e consentire le culture di crescere indisturbata per 1 settimana.

5. Passaging di ratto adulto e NSPCs midollo spinale umano

1. NSPCs Rat formeranno piccoli neurosfere di circa 70 micron di diametro entro 1 settimana dalla semina iniziale; NSPCs passaggio ratto settimanali raccogliendo la sospensione cellulare, centrifugazione a 300 xg per 5 min, e triturazione meccanicamente il pellet cellulare dissociare le neurosfere.
2. Seme le cellule dissociate in fiasche T25 contenenti ratto fresco EFH medio. Alternativamente,utilizzare il 50% di media ratto condizionata per passaging. La resa tipica di NSPCs ratto a passaging è di circa 5 x 10 ⁶ cellule che aumenta in maniera esponenziale con il numero di passaggio.
3. Per le culture umane, una settimana dopo la placcatura iniziale, sostituire la metà del terreno di coltura con fresca EFH due volte alla settimana per permettere alle cellule di aderire al substrato. Generalmente, 1 - 2 settimane dopo una volta che le cellule sono attaccate al substrato, sostituire l'intero volume del terreno di coltura due volte alla settimana con EFH fresca.
4. Cellule Subculture prima di raggiungere confluenza tra 4-8 settimane.
   1. Cellule Subculture staccando le cellule dal substrato enzimatica (vedere Tabella dei materiali) con 2 ml di enzima per pozzetto incubate per circa 10 minuti a 37 ° C. Raccogliere sospensione cellulare, centrifugare a 300 xg per 5 minuti, e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 ml di appena fatto medio EFH.
   2. Contare le cellule vive con un emocitometro e piastra le cellule in piastre di coltura 6 pozzetti (pre-coated come sopra al punto 4.12) ad una densità di 10 ⁵ cellule / pozzetto in un volume totale di 5 ml EFH / pozzetto. La resa tipica di NSPCs umani a passaging è di circa 2 x 10 ⁶ cellule e, in generale questo sarà il doppio con il passaggio. In generale, mantenere le culture con il 50% di media condizionata EFH 2 - 3 volte a settimana tra passaging.

Risultati

Ratto adulto cellule del midollo spinale cresciute in coltura in sospensione in EFH medio formeranno piccoli neurosfere (colonie di cellule indifferenziate) entro 1 settimana di placcatura iniziale. In colture primarie, la maggior parte delle cellule placcato moriranno e le cellule staminali fattore-sensibile crescita proliferare e sono selezionati per nel mezzo EFH. In passaggio 3, ci saranno numerose neurospheres fluttuanti circa 100 micron di diametro (Figura 2A). Neurosfere sono rotonde e la fase-lu...

Discussione

Durante la dissezione del midollo spinale di ratto cura tessuto dovrebbe essere presa non danneggiare il midollo spinale durante l'esecuzione della laminectomia. È facile isolare il tessuto periventricular quando i segmenti del midollo spinale sono intatti. I segmenti di tessuto devono essere completamente immersi in tampone dissezione e le meningi sovrastanti e della sostanza bianca possono essere tagliate via come strisce longitudinali con microscissors. In alternativa, pinze dei tessuti fini possono essere utili...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM